Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

O objetivo geral é que este procedimento é gerar e distinguir macrófagos semelhantes a alvéolos de células dendríticas em culturas de células de medula óssea murina in vitro suplementadas com GM-CSF. Este método in vitro pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a função das células dendríticas ou macrófagos. A principal vantagem da técnica é que ela pode gerar números de células suficientes e pode distinguir entre células dendríticas e macrófagos semelhantes a alvéolos.

As implicações dessa técnica podem se estender para a terapia da proteinose pulmonar, pois facilita a aquisição de macrófagos semelhantes a alvéolos, que podem ser usados para tratar essa doença. Geralmente, os indivíduos novos neste método precisarão praticar o isolamento dos ossos limpos e a lavagem da medula óssea. A demonstração visual desse método é útil, pois nem todas as técnicas usadas são facilmente compreendidas apenas por instruções escritas.

15 minutos antes de iniciar a dissecção, ligue um gabinete de segurança biológica para purgar o ar do gabinete e estabilizar o fluxo de ar e limpe a superfície do gabinete com etanol a 70%. Quando o gabinete estiver pronto, coloque um mouse em cima de uma a duas toalhas de papel na posição de bruços e borrife o animal com etanol a 70%. Em seguida, com a mão não dominante, levante a pele ao redor da região torácica e use uma tesoura para fazer uma incisão.

Segurando as duas extremidades da incisão, puxe cuidadosamente até que as duas extremidades da incisão se encontrem no estômago. Em seguida, coloque o mouse na posição supina e use uma mão para puxar a metade inferior da pele para baixo até que as pernas fiquem expostas. Segurando o pé, corte os tendões de Aquiles acima da articulação do tornozelo e os ligamentos que conectam os músculos ao pé na extremidade inferior da tíbia para soltar o pé dos ossos da perna.

Mantendo a perna levantada, remova os músculos e ligamentos ao redor da articulação do joelho na extremidade inferior do fêmur para cortar os músculos da coxa da perna. Usando uma pinça, puxe suavemente os músculos soltos para longe das superfícies fibular e femoral. Em seguida, pressionando a tesoura na posição aberta na articulação do quadril, gire a perna e puxe suavemente o fêmur para separar o osso da perna da articulação do quadril enquanto corta a perna do corpo.

Agora, segurando a perna na extremidade do quadril com uma pinça estéril, use outra pinça para remover o pé da extremidade do tornozelo. Em seguida, segurando a extremidade distal do fêmur com uma pinça e a extremidade proximal da tíbia e fíbula com outra, dobre cuidadosamente a tíbia e a fíbula na direção oposta da articulação do joelho para separar a perna do fêmur e da patela. Use a pinça para remover os ligamentos, músculos e fíbula restantes dos ossos da perna e coloque a tíbia limpa em uma tampa de placa de Petri invertida, contendo um a dois mililitros de HBSS/FCS.

Segurando a extremidade inferior do fêmur com um conjunto de pinças e a patela com outro, dobre o joelho e os tecidos circundantes na direção oposta para remover a articulação. Em seguida, remova qualquer um dos tecidos conjuntivos restantes do fêmur e coloque o osso na tampa da placa de Petri invertida. Quando todos os ossos tiverem sido colhidos, use uma pinça para limpar qualquer tecido residual ainda preso aos ossos e mergulhe os ossos em 10 mililitros de HBSS / FCS dentro da base da placa de Petri.

Mantendo o prato parcialmente protegido com uma tampa estéril, corte cada um dos ossos limpos ao meio com uma tesoura. Em seguida, use uma seringa de um mililitro, equipada com uma agulha de calibre 26,5 para lavar um mililitro de HBSS / FCS do prato para o final de cada pedaço de osso até que toda a medula vermelha tenha sido liberada. Passe vários pedaços visíveis de medula óssea pela seringa para formar uma única suspensão celular, seguida de uma mistura completa com uma pipeta de 10 mililitros.

Transfira as células para um tubo de coleta e enxágue a placa de Petri uma vez com cinco mililitros de HBSS / FCS para coletar quaisquer células residuais. Em seguida, acumule a lavagem no tubo de coleta e coloque as células no gelo. Para estabelecer uma cultura de células da medula óssea, centrifugue as células coletadas e aspire o sobrenadante com uma pipeta de vidro estéril Pasteur conectada à sucção a vácuo.

Afrouxe o grânulo rico em glóbulos vermelhos com batidas. Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de lise de hemácias e ressuspenda as células com vórtice. Após uma incubação de cinco minutos em temperatura ambiente, interrompa a lise com 10 mililitros de HBSS / FCS e gire as células, ressuspendendo o pellet em meio celular da medula óssea.

Conte o número de células viáveis por exclusão de Trypan Blue e transfira as células necessárias para um novo tubo com meio celular de medula óssea. Em seguida, recolher as células por centrifugação e ressuspender o sedimento a uma diluição de quatro milhões de células por mililitro em meio celular da medula óssea com 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF. Em seguida, adicione 9,5 mililitros de meio celular da medula óssea suplementado com 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF a uma placa de Petri bacteriana estéril por cultura e adicione 500 microlitros de células ao centro de cada placa.

Incube as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. No terceiro dia, adicione 10 mililitros de meio de medula óssea fresca suplementado com 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF a cada cultura, tomando cuidado para minimizar quaisquer distúrbios nas células. No sexto dia, transfira cuidadosamente 10 mililitros de sobrenadante de cultura de células para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.

Centrifugue as células e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio celular fresco da medula óssea, contendo 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF. Em seguida, vórtice suavemente a suspensão celular e retorne as células à placa de cultura. No primeiro dia, as células da medula óssea são pequenas e esparsas, mas no terceiro dia, as células aumentaram em número e tamanho, e algumas começaram a aderir.

No sexto dia, há mais células e frações aderentes e não aderentes são observadas. A cultura pode ser colhida do sétimo ao 10º dia e fechada por tamanho e células vivas com uma porcentagem maior de células CD11c positivas obtidas nas culturas do 10º dia. No sétimo dia, a fração não aderente coletada é muito enriquecida para células com morfologia dendrítica.

As populações CD11c-positivas, GR1-negativas, colhidas no sétimo e 10º dia, podem ser divididas em três populações principais. Macrófagos, células dendríticas imaturas e células dendríticas maduras pela expressão de MHCII e ligação FL-HA. Curiosamente, o MerTK, embora considerado um marcador de macrófagos, exibe uma expressão robusta em populações de macrófagos e células dendríticas imaturas, colhidas nos dias sete e 10, com um baixo nível de expressão observado em células dendríticas maduras.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar técnicas estéreis durante a coleta de medula óssea e cultura de células. Após este procedimento, as células também podem ser classificadas para examinar as populações de células separadamente, ou podem ser estimuladas com agentes inflamatórios e posteriormente analisadas quanto à produção de citocinas por coloração intracelular e citometria de fluxo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células da medula óssea e cultivá-las em GM-CSF para gerar células dendríticas e macrófagos semelhantes a alvéolos.