Name: Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Aprenda a gerar e distinguir macrófagos alveolares de células dendríticas usando culturas de medula óssea murina com GM-CSF. Este método in vitro permite obter números celulares suficientes para estudos imunológicos.

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Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (Grant MOP-119503) e do Conselho Ciências e Engenharia Natural do Canadá (NSERC). NSERC também apoiou studentships de verão para YD e AA YD é apoiado pela Universidade de British Columbia (UBC), com uma bolsa de estudos de 4 anos, AA é suportado por CIHR com a atribuição de um estudante de graduação do Master (CGS-M). Agradecemos Calvin Roskelley para assistência com o microscópio usado para gerar as imagens na Figura 2. Também reconhecemos o apoio dos animais e citometria de fluxo Instalações UBC.

Os ratos foram sacrificados de acordo com a Canadian Council on Animal Care diretrizes para pesquisa com animais ética por procedimentos aprovados pela Universidade do Comitê Animal Care Columbia Britânica. 1. Aquisição de uma única célula de Medula Óssea de suspensão de rato fémur e da tíbia <ol><li> Ligue uma câmara de segurança biológica (BSC) 15 min antes do início do procedimento para purgar ar do gabinete e permitir a estabilização do fluxo de ar, a superfície BSC, em seguida, limpa / pulverização com 70% de etanol. Manter tudo tão estéril quanto possível para a totalidade do protocolo. Não corte os ossos sob condições não estéreis. </li><li> Preparar as ferramentas de dissecação por imersão em etanol a 70% (um par de tesouras de dissecação, 2 pares de pinças), solução equilibrada de Hank sal com 5% de soro fetal de vitelo (HBSS-FCS), placas de Petri estéreis (100 mm x 15 mm), 1 seringas ml, 26½ agulhas de calibre, tubos de coleta cónicas (15 ml ou 50 ml), e toalhas de papel na BSC. </li><li> Euthanize o mouse usandoprotocolos aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da instituição. Trazer para o BSC, coloque no topo de uma ou duas toalhas de papel e pulverizar o mouse com 70% de etanol. </li><li> No BSC, abrir uma placa de Petri estéril assepticamente, uma alíquota de 10 ml de HBSS-FCS para a base e 1 - 2 ml para a tampa. </li><li> Posicione o mouse em seu estômago com a parte traseira voltada para cima e levantar a pele ao redor das seções torácicas com os dedos da mão não-dominante. Use a tesoura para fazer uma incisão onde a pele é levantada. </li><li> Segure-se em ambas as extremidades do corte, uma extremidade com cada mão e cuidadosamente puxe a pele ao redor o mouse na parte de trás para o estômago, continue a puxar até duas extremidades da incisão se encontram no estômago. </li><li> Virar o mouse para o estômago virado para cima e com uma mão puxar a metade inferior da pele para baixo em direção à perna, manter a puxar para trás a pele até que as pernas estão expostos. </li><li> Segurar o pé do mouse para cima e cortar os tendões de Aquiles acima da articulação do tornozelo eos ligamentos que ligam os músculos de pé na extremidade inferior da tíbia com uma tesoura. Isto solta o pé dos ossos da perna. </li><li> Mantendo-se a perna pelo pé, cortar os músculos e ligamentos com uma tesoura ao redor da articulação do joelho, na extremidade inferior do fémur para cortar os músculos da coxa a partir da parte inferior da perna. Use uma pinça para puxar delicadamente músculos soltos longe da fíbula e superfícies femoral. Tome cuidado para não cortar a artéria femoral para evitar sangramento intenso. </li><li> Com uma mão segurando o pé, imprensa tesouras para baixo abertas na extremidade superior do fêmur na articulação do quadril, girar a perna e puxe para separar o fémur da articulação do quadril, enquanto usando a tesoura para fazer o corte final para livre da perna a partir do corpo. </li><li> Deste ponto em diante, somente prender o tecido com uma pinça estéril. Segurar a perna em uma extremidade e retirar o pé do outro. Nota: Isto não deve exigir muita força, como ligamentos de ligação são cortadas no passo1.9. Alternativamente, cortar a tibia logo acima do tornozelo, onde o osso é fundida. </li><li> Mantenha a perna pela extremidade distai do fémur, com um conjunto de pinças e extremidade proximal da tíbia e fíbula com outro, dobrar cuidadosamente a tíbia e o perónio na direcção oposta à da articulação do joelho a separá-los do fémur e patela. </li><li> Use uma pinça para puxar para baixo os ligamentos remanescentes e os músculos ainda ligados aos ossos inferiores da perna. Aqui, remover o perónio, juntamente com os tecidos conjuntivos com uma pinça, uma vez que é demasiado pequeno para ser liberado por células de medula óssea. Coloque a tíbia feita na tampa invertida placa de Petri. </li><li> Segurar a extremidade inferior do fémur com um conjunto de pinça e a patela com outro, dobrar a patela e tecidos circundantes na direcção oposta da articulação para a remoção. Em seguida, limpar restantes tecidos conjuntivos do fémur; puxando-os com uma pinça, e colocá-lo na tampa invertida placa de Petri. Descarte a patela. </li><li> Repita 1,7- 1.13 com a outra perna se necessário. Transferir os ossos para 1,6 ml tubos de microcentrífuga estéril contendo 1 ml de HBSS-FCS para transporte, se necessário. </li><li> Coloque ossos na tampa invertida placa de Petri, com 1 - 2 ml de HBSS-FCS, utilizar uma pinça para limpar qualquer tecido residual ainda ligado à tíbia e fémur, em seguida, transferir os ossos à base do prato de Petri contendo 10 ml de HBSS- FCS. Alternativamente, limpar os ossos e remover o tecido muscular anexado usando um 70% de etanol tecido encharcado. </li><li> Corte cada um dos ossos ao meio com uma tesoura. Parcialmente proteger a placa de Petri com uma tampa estéril durante o corte para garantir que os ossos ficar no prato. Alternativamente, o corte do lado de cada osso para permitir a lavagem no passo seguinte. </li><li> Fixe a 26½ agulha G para a seringa de 1 ml, e elaborar 1 ml HBSS-FCS a partir da placa de Petri. Inserir a ponta da agulha para dentro da extremidade de um pedaço de osso e lavar as células de medula óssea (tecido vermelho macio dentro dos ossos). Inserir a agulha na cabeçado osso e a extremidade aberta, até que toda a medula de cor vermelha é removido. Observe os ossos, como na cor branca. </li><li> Passar quaisquer aglomerados visíveis de medula óssea através da seringa algumas vezes para formar uma suspensão de células individuais. </li><li> Descarte os ossos coradas. Usar uma pipeta de 10 ml para misturar a suspensão de células bem e transferir para o tubo de recolha. Lavar a placa de Petri uma vez com 5 ml de HBSS-FCS para recolher as células residuais no prato. Coloque as células no gelo. NOTA: A suspensão de células de medula óssea ainda é viável se for armazenado durante 2-3 h a 4 ° C. </li></ol> 2. Galvanização e Cultivo de Células de Medula Óssea (CMO) <ol><li> Prepare os seguintes reagentes e suprimentos. <ol><li> Preparar tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC), fazendo 0,84% de cloreto de amónio, em uma solução final de Tris 2 mM, pH 7,2, em seguida esterilizar por filtração através de um filtro de 0,2 mícron. </li><li> Prepare meios BMC pela adição de 10% de FCS, HEPES 20 mM, 1x aminoácido não essencial, 55 &amp; #181; M de 2-mercaptoetanol, 50 U / ml de penicilina e estreptomicina, piruvato de sódio 1 mM e 2 mM de L-glutamina em meio RPMI 1640. </li><li> Obter disponível comercialmente recombinante de GM-CSF ou GM-CSF usar contendo o sobrenadante das células de mieloma Ag8.653 transfectadas com o gene de GM-CSF 20. Determinar a concentração de GM-CSF no sobrenadante por ELISA e adiciona o equivalente a 20 ng / ml para os meios de comunicação a BMC. </li></ol></li><li> Girar as células da medula óssea a 314 xg durante 5 min. O pellet é vermelho, devido à hemácias. No BSC, aspirar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur de vidro estéril ligada a vácuo de sucção, soltar o pellet tocando, em seguida, adicione 10 ml de tampão de lise RBC. Vortex para ressuspender as células e incuba-se em tampão de lise dos glóbulos vermelhos à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar 10 ml de HBSS-FCS então girar as células a 314 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Observe o pellet celular como cor branca. Ressuspender as células em volume desejado de meios BMC. </li><li> Contar o resu-spended células utilizando um hemocitómetro após a coloração das células mortas com 0,4% de azul de tripano. NOTA: Se a medula óssea a partir de uma perna (tíbia único e fémur) é utilizado, ressuspender em 5 ml de meio de BMC, tomar 10 ul de suspensão de células e diluir com 70 ul de 0,4% de azul tripano, misturar bem e transferir 10 ul de a diluição 1/8 de células para a câmara de hemocitómetro. Contar as células viáveis ​​em quatro quadrantes: a média das quatro contagens quadrante x factor de diluição x 10 4 = número de células por ml. A fémur e uma tíbia de uma perna geralmente resultam em cerca de 2-4 x 10 7 células após RBC lise. </li><li> Estimar o número de pratos de 10 ml de culturas de medula óssea necessários para as experiências a jusante com base no número total de células necessárias para experiências no final da cultura. NOTA: Cada prato requer 2 x 10 6 células da medula óssea na propagação inicial e rendimentos de 5 - 10 x 10 6 células no dia 7. <ol><li> Todosquot o número total de células por plaqueamento em um novo tubo, girar a 314 xg durante 5 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 4 x 10 6 células / ml em meio de BMC. </li></ol></li><li> Prepara-se uma nova estéril 100 milímetros x 15 mm numa caixa de Petri com 9,5 ml de meio contendo 200 ng BMC de GM-CSF (recombinante ou de GM-CSF contendo sobrenadante). Adicionar 500 ul da / células da medula óssea ml 4 x 10 6 células para o centro do prato de Petri para a concentração final de 2 x 10 5 culas / ml em 10 ml. NOTA: É importante a utilização de uma placa de Petri estéril e não um prato de cultura de tecidos. Além disso, ao adicionar as células, garantir células continuam concentradas no centro e minimizar a perturbação aos pratos após a semeadura e durante alterações na mídia. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2. Este é o dia 0 em cultura. </li><li> No dia 3, adicionar 10 mL de meio fresco contendo BMC de 200 ng de GM-CSF para cada placa de células. Tome cuidado para minimizar a perturbação of as células concentradas em suspensão. O volume total de cultura de células é agora de 20 ml. </li><li> Observar as células ao microscópio óptico uma ampliação de 100X. Observar numerosas células não-aderentes (redondo) e algumas células aderentes (lisos). As células em grupos de três ou quatro pétalas que se assemelham de uma flor pode ser vista, indicando a proliferação. </li><li> No dia 6 de realizar uma mudança metade meios. Remova cuidadosamente 10 ml de mídia em um tubo de 50 ml cônico estéril, girar a 314 g durante 5 min, aspirado e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio fresco contendo BMC 20 ng / ml de GM-CSF, suavemente vórtice e adicionar ao prato de cultura de células original para um volume total de 20 ml. Observar as células ao microscópio. NOTA: Dia 7 cultura deve estar a 70% ou superior em confluência com células aderentes planas e nuvens densas de células não-aderentes redondos. </li></ol> 3. Recolha e Preparação BMDC e BMDMs para citometria de fluxo <ol> &lt;li&gt; Mantenha todos os buffers a 4 ° C. </li><li> Colheita das células a partir de dia 7 ao dia 10. Para colher as células, em primeiro lugar a transferência de 10 ml do sobrenadante da cultura para um tubo de recolha cónico de 50 ml, em seguida, inclinar o prato verticalmente por aproximadamente 30 graus e lavar o prato pipetando os restantes 10 ml de cultura a partir do topo do prato. Repita esta lavagem 5 vezes, cada vez girar a placa em um terço. </li><li> Transferir os restantes 10 ml de células para o mesmo tubo de recolha e descarte a placa e as células aderentes. NOTA: As lavagens vai remover as células não-aderentes e fracamente aderentes; as células aderentes planas são resistentes às lavagens. Tipicamente, entre 5 - 10 x 10 6 células não-aderentes são esperados a partir de uma placa no dia sete e 2 - 5 x 10 6 células no dia 10, embora Lutz et ai. relatados 10 X 10 6 células no dia 10. As células aderentes não são normalmente tomadas. No entanto, se essas células devem ser comparadas com as células não-aderentes, Eles podem ser removidos como se segue. Adicionar 5 ml de EDTA 0,7 mM em PBS 1X, pH 7,4 para o prato após as células não-aderentes são removidas, incuba-se a 37 ° C durante 5 min, pipeta cima e para baixo para remover as células aderentes e recolher num tubo separado. </li><li> Girar as células coletadas em 314 g durante 5 minutos e aspirar o sobrenadante. Ressuspender em 5 ml de meio estéril BMC a 4 ° C, vortex suavemente para misturar, e contar usando o azul de tripano e um hemocitómetro. NOTA: Cada prato irá dar origem a 5 - 10 x 10 6 células não aderentes a partir de uma cultura de 7 dias. A partir de agora, realizar todas as etapas, a 4 ° C. </li><li> Para a análise de citometria de fluxo, a transferência de 2 x 10 5 células por cada amostra em 5 mL de poliestireno tubos de fundo redondo, adicionar 300 mL de tampão de FACS a 4 ° C (1x salina tamponada com fosfato, EDTA a 2 mM e 2% de albumina de soro de bovino) a cada amostra. </li><li> Girar para baixo células a 314 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. Observar um sedimento visível branco, opaco nofundo do tubo. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de receptor de Fc não marcado Ab para bloquear o receptor de Fc de ligação (10/01 Uso sobrenadante de 2.4G2 produzir a linha celular de mieloma) e incubar durante 20 min a 4 ° C. Em seguida adicionar 300 uL de tampão de SCAF a cada amostra, com cuidado vórtice, então girar para baixo as células a 314 xg durante 5 min e o sobrenadante aspirado. </li><li> Ressuspender as células em 100 ul de CD11c-PeCy7 a 0,2 ug / ml, azul Gr1-Pacífico a 0,25 ug / ml, MHCII-APC em 0,05 ug / ml, e FL-HA em aproximadamente 2 ug / mL para identificar macrófagos e células dendríticas. NOTA: FL-HA foi preparado em casa usando fluoresceína e sal de sódio ácido hialurônico galo pente como descrito anteriormente 21. </li><li> Incubar durante 20 min a 4 ° C para permitir a ligação à superfície da célula. Adicionar 300 ul de tampão de SCAF a cada amostra, com cuidado vórtice, então girar para baixo as células a 314 xg durante 5 minutos a 4 ° C e o sobrenadante aspirado. NOTA: Se biotinylated anticorpos são utilizados em 3,8, repetir 3,8-9 com estreptavidina fluorescente. </li><li> Lavar as células com 300 uL de um outro tampão de SCAF, suavemente vortex para misturar e girar para baixo as células a 314 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 200 ul de tampão FACS contendo 0,1-0,2 ug por mL de iodeto de propídio ou DAPI para marcar as células não viáveis. As células estão prontas para análise por citometria de fluxo 22. NOTA: Ver Resultados e Figura 3 para obter detalhes sobre as populações e como as células foram fechado. </li></ol>

<ol><li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+lineage+phenotypes+and+osteoclastogenesis--complexity+in+the+control+by+GM-CSF+and%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and.</a> Bone. 40 (2), 323-336 (2007).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand-generated+murine+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cells+differ+in+their+capacity+to+prime+naive+CD8+T+cells+and+to+generate+memory+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo.</a> J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+culture+method+starting+with+early+growth+factors+permits+enhanced+production+of+functional+dendritic+cells+from+murine+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes.</a> J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).</li>
<li>Brasel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+synergizes+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+granulocyte+colony-stimulating+factor+to+mobilize+hematopoietic+progenitor+cells+into+the+peripheral+blood+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice.</a> Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).</li>
<li>Segura, E., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+dendritic+cells+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory dendritic cells in mice and humans.</a> Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).</li>
<li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+innate+immune+receptor+Dectin-1+upon+formation+of+a+%27phagocytic+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse.</a> Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).</li>
<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+of+cellular+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation.</a> Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).</li>
<li>Vander Lugt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+dendritic+cells+for+enhanced+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation.</a> Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).</li>
<li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+alveolar+macrophage+differentiation+and+innate+immunity+in+the+lung+through+PU.1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1.</a> Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+Macrophage-CSF+Dependent+Macrophage+Responses+by+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models.</a> J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Poon, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+Binding+Identifies+a+Functionally+Distinct+Alveolar+Macrophage-like+Population+in+Bone+Marrow-Derived+Dendritic+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures.</a> J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li>
<li>Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cells+solicit+their+own+help+from+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">cells solicit their own help from T cells.</a> J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).</li>
<li>de Belder, A. N., Wik, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+properties+of+fluorescein-labelled+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate.</a> Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).</li>
<li>Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+ligand+activation+of+murine+bone+marrow-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells.</a> Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).</li>
<li>Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells%3A+%27Exhausted%27+or+Alert+and+Waiting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li>
<li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li>
<li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li>
<li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse financeiros.

Neste artigo, é proporcionado um método para a geração de macrófagos e células dendríticas derivadas de GM-CSF a partir de uma única cultura de medula óssea de ratinho que é adaptado de Lutz et ai. 6. Expressão MHCII e FL-HA distingue entre DC imaturas e macrófagos de ligação nesta cultura (ver Figura 3C), que anteriormente tem sido difícil. Isto, juntamente com outro relatório Helft et al. 19, demonstra a heterogeneidade dentro de GM-CSF induzidas culturas BMDC q...

Vários métodos de cultura in vitro foram descritas para gerar macrófagos de osso derivadas de medula (BMDMs) e DCs derivadas da medula óssea (BMDCs) utilizando um ou uma combinação de factores de crescimento. BMDMs pode ser gerado através da cultura de células da medula óssea utilizando um factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) ou GM-CSF a 1,2. Para BMDCs, a adição de ligando de FLT3 para a cultura de medula óssea dá origem a DCs clássicos e plasmocitoides não aderentes (CD11c alta MHCII alta e CD11c Lo /, B220 +, respectivamente), após 9 dias de cultura em 3,4. Em contraste, células não-aderentes gerado após 7 a 10 dias em cultura com GM-CSF sozinho 5,6, GM-CSF e IL-4 7, ou GM-CSF e o ligando de FLT3 8,9 gerar BMDCs assemelha-se mais estreitamente DCs inflamatórias (alta CD11c, CD11b MHCII alta +) 10. Embora estas culturas in vitro são utilizados para gerar ou macrófagosDCs, não é claro se cada cultura dá origem a populações puras. Por exemplo, embora as células aderentes nas culturas de GM-CSF são descritos para ser macrófagos 5, as células não aderentes a partir da mesma cultura são utilizados como DCs 6,11-13, com o pressuposto de que eles são homogéneos e qualquer variabilidade observada é devido a diferentes fases do desenvolvimento 14,15. Além disso, estudos têm encontrado GM-CSF a ser um factor de crescimento essencial para o desenvolvimento de macrófagos alveolares in vivo 16,17, e pode ser utilizado in vitro para gerar macrófagos alveolares do tipo 16,17,18. Para além de adesão, os procedimentos para a produção de macrófagos e células dendríticas a partir de GM-CSF tratado culturas de medula óssea são muito semelhantes, sugerindo heterogeneidade pode existir dentro de GM-CSF culturas de medula óssea. Este facto parece ser o caso, como dois trabalhos relatam a presença de BMDMs na fracção não-aderente de culturas BMDC. Em um papel, que identified uma população de células como CD11c +, CD11b +, MHCII mid, MerTK + e CD115 +, que expressa uma assinatura a expressão de genes que se assemelhava mais estreitamente macrófagos alveolares e tinha uma capacidade reduzida de activar células T 19. O segundo papel utilizado MHCII e FL-HA para identificar uma população de macrófagos-like alveolar (CD11c +, MHCII média / baixa, FL-HA alta), que era distinta da imaturo (CD11c +, MHCII mid, FL-HA baixo) e madura DCs (CD11c +, MHCII alta), tanto fenotipicamente e funcionalmente 18. Estes papéis ambos ilustram que as culturas GM-CSF BMDC são heterogêneas, contendo tanto populações DC, indicando que deve ser tomado cuidado ao interpretar os dados a partir de culturas BMDC macrófagos e. Este protocolo descreve como isolar medula óssea, as células de medula óssea de cultura em GM-CSF, e identificar o macrófago alveolar semelhantepopulação dos DCs imaturos e maduros na cultura de medula óssea por citometria de fluxo utilizando FL-HA de ligação e expressão MHCII. Este procedimento é baseado no procedimento estabelecido de Lutz et ai 6 e é capaz de gerar 5 -. 10 X 10 6 células não aderentes no dia 7 de uma cultura de 10 ml. A cultura é utilizável a partir de 7 a 10 dias e produz uma população heterogénea de macrófagos, DC imaturas e maduras, bem como alguns progenitores no dia 7. Isto proporciona um método simples para isolar e cultivar in vitro macrófagos alveolares semelhantes em grandes quantidades.

<table><tbody><tr><td>Citômetro de Fluxo</td><td>BD&nbsp;</td>Microscópio Invertido Automatizado <td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Centrífuga DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Armário de Biossegurança <td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de Calibre 26 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico de 50 ml&nbsp;</td><td>Tubos Eppendorf da marca Corning</td><td>357070</td><td>*Falcon</td></tr><tr><td>(1.5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tubos de poliestireno de fundo redondo Ferramentas de dissecação</td><td>de 352052</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de ciência fina&nbsp;</td><td>*Vários&nbsp;</td><td>*Tesoura de dissecção, pinça dumont e pinça padrão&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocitômetro&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Estéril 100 mm x 15 mm Placa de Petri</td><td>Corning</td><td>351029</td> <td>* Falcon marca</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol Thermo</td><td>Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Amônio</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Albumina</td><td>Fisher Bioreagentes</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Solução Salina Balanceada</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico ácido</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Monobásico</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Potássio</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Pente de Galo Hialuronato de Sódio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Usado para fazer hialuronano fluoresceinado</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>Sem piruvato de sódio, sem glutamina. Mídia quente para 37&nbsp; &#176; C antes de usar.</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>5271-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio Dibasic</td><td>Sigma</td><td>50876-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetil) aminometano</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Sigma</td><td></td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Receptor Anti-Fc (não marcado), Sobrenadante de cultura de tecidos</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>Clone: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Clone: N418</td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Clone: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anti-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Clone: M5 / 114.15.2</td></tr><tr><td>Biotinilado Anti-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>IgG policlonal de cabra</td></tr><tr><td>estreptavidina PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol)</td> <td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

geração e identificação de gm-csf macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de medula Óssea

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Os macrófagos e as células dendríticas (CDs) são células imunes inatas encontradas em tecidos e órgãos linfóides, que desempenham um papel fundamental na defesa contra agentes patogénicos. No entanto, eles são difíceis de isolar em quantidade suficiente para estudá-los em pormenor, por conseguinte, os modelos in vitro têm sido desenvolvidos. Culturas in vitro de osso derivadas de medula macrófagos e células dendríticas são bem estabelecidos e métodos úteis para estudos imunológicos. Aqui, um método para a cultura e identificação de ambas as DCs e macrófagos a partir de uma única cultura de células da medula óssea primário do rato utilizando o factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos de citocinas (GM-CSF) é descrita. Este protocolo é baseado no procedimento estabelecido pela primeira vez desenvolvido por Lutz et al. em 1999 para DCs derivadas de medula óssea. A cultura é heterogênea, e MHCII e ácido hialurônico fluoresceína (FL-HA) são usadas para distinguir macrófagos de DCs imaturos e maduros. Estes GM-CSF macrófagos derivados próvide uma fonte conveniente de macrófagos derivados in vitro que se assemelham estreitamente macrófagos alveolares em ambos fenótipo e função.

Um fluxograma que resume os passos principais deste método é apresentado na Figura 1. A densidade e morfologia da cultura de medula óssea em alturas diferentes da cultura são mostrados na Figura 2. No dia 1, as células são pequenos e escassas mas por dia 3, há mais células, algumas são maiores e alguns já começaram a aderir. Ao dia 6, há um aderente definitiva e a fracção não-aderente (Figura 2A). A cultura pode ser colhida a partir do d...

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar e distinguir macrófagos semelhantes a alveolares de células dendríticas em culturas in vitro de células da medula óssea murina suplementadas com GM-CSF. Esse método in vitro pode ajudar a responder questões-chave sobre a função de células dendríticas ou macrófagos. A principal vantagem da técnica é que ela pode gerar números suficientes de células e é capaz de distinguir entre células dendríticas e macrófagos semelhantes a alveolares.As implicações dessa técnica podem estender-se à terapia da proteinose pulmonar, pois facilita a obtenção de macrófagos semelhantes aos alveolares, que podem ser utilizados para tratar essa doença. Geralmente, indivíduos novos nesse método precisarão de prática para isolar os ossos limpos e realizar a lavagem da medula óssea. A demonstração visual desse método é útil, pois nem todas as técnicas são facilmente compreendidas apenas por meio de instruções escritas.Quinze minutos antes de iniciar a dissecação, ligue uma cabine de segurança biológica para purificar o ar da cabine e estabilizar o fluxo de ar, e limpe a superfície da cabine com etanol 70%. Quando a cabine estiver pronta, coloque um camundongo em cim

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

O artigo descreve a adaptação prontamente...

Investigação de polarização de macrófagos Usando medula macrófagos derivados

Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.

Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

Demonstramos como identificar e isolar 6 subconjuntos de progenitores mieloides de murino medula óssea usando uma combinação de magnética e fluorescência classificação (MACS e FACS). Este protocolo pode ser usado para ensaios em vitro cultura (culturas metilcelulose ou líquido), na vivo experiências de transferência adotiva e análises de RNA/proteína.

Identificação e isolamento de oligopotentes e confirmada por linhagem mieloides progenitores da medula óssea de rato

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Este protocolo descreve um método não enzimático e direto para isolar células da medula óssea de camundongos neonatais de 7 a 9 dias de idade e gerar macrófagos diferenciados usando um sobrenadante de células L929 como fonte de fator estimulador de colônias de granulócitos (M-CSF). Os macrófagos derivados da medula óssea foram posteriormente analisados quanto aos antígenos de superfície F4/80, CD206, CD11b e competência funcional.

Isolamento da medula óssea de camundongos neonatais e preparação de macrófagos derivados da medula óssea

Aprenda a gerar e distinguir macrófagos alveolares de células dendríticas usando culturas de medula óssea murina com GM-CSF. Este método in vitro permite obter números celulares suficientes para estudos imunológicos.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

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