Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

O objetivo geral deste procedimento é gerar e distinguir macrófagos semelhantes a alveolares de células dendríticas em culturas in vitro de células da medula óssea murina suplementadas com GM-CSF. Esse método in vitro pode ajudar a responder questões-chave sobre a função de células dendríticas ou macrófagos. A principal vantagem da técnica é que ela pode gerar números suficientes de células e é capaz de distinguir entre células dendríticas e macrófagos semelhantes a alveolares.

As implicações dessa técnica podem estender-se à terapia da proteinose pulmonar, pois facilita a obtenção de macrófagos semelhantes aos alveolares, que podem ser utilizados para tratar essa doença. Geralmente, indivíduos novos nesse método precisarão de prática para isolar os ossos limpos e realizar a lavagem da medula óssea. A demonstração visual desse método é útil, pois nem todas as técnicas são facilmente compreendidas apenas por meio de instruções escritas.

Quinze minutos antes de iniciar a dissecação, ligue uma cabine de segurança biológica para purificar o ar da cabine e estabilizar o fluxo de ar, e limpe a superfície da cabine com etanol 70%. Quando a cabine estiver pronta, coloque um camundongo em cima de uma ou duas folhas de papel-toalha na posição prona e pulverize o animal com etanol 70%. Em seguida, com a mão não dominante, levante a pele ao redor da região torácica e use uma tesoura para fazer uma incisão.

Segurando ambas as extremidades da incisão, puxe cuidadosamente até que as duas pontas da incisão se encontrem no estômago. Em seguida, posicione o camundongo em posição supina e use uma das mãos para puxar a metade inferior da pele para baixo até que as pernas fiquem expostas. Segurando o pé, corte os tendões de Aquiles acima da articulação do tornozelo e os ligamentos que conectam os músculos ao pé na extremidade inferior da tíbia, para soltar o pé dos ossos da perna.

Mantendo a perna elevada, remova os músculos e ligamentos ao redor da articulação do joelho na extremidade inferior do fêmur para separar os músculos da coxa da perna inferior. Usando uma pinça, puxe suavemente os músculos soltos das superfícies fibular e femoral. Em seguida, pressionando a tesoura na posição aberta na articulação do quadril, gire a perna e puxe suavemente o fêmur para separar o osso da perna da articulação do quadril, ao mesmo tempo em que corta a perna livre do corpo.

Segurando agora a perna pela extremidade do quadril com uma pinça estéril, use outra pinça para remover o pé pela extremidade do tornozelo. Em seguida, segurando a extremidade distal do fêmur com uma pinça e a extremidade proximal da tíbia e da fíbula com outra, dobre cuidadosamente a tíbia e a fíbula na direção oposta à articulação do joelho, para separar a perna inferior do fêmur e da patela. Use a pinça para remover os ligamentos, músculos e a fíbula remanescentes dos ossos da perna inferior e coloque a tíbia limpa sobre a tampa invertida de uma placa de Petri contendo um a dois mililitros de HBSS/FCS.

Segurando a extremidade inferior do fêmur com um par de pinças e a patela com outro, dobre o joelho e os tecidos circundantes em direção oposta para remover a articulação. Em seguida, remova quaisquer tecidos conjuntivos remanescentes do fêmur e coloque o osso na tampa invertida da placa de Petri. Quando todos os ossos tiverem sido coletados, use pinças para limpar qualquer tecido residual ainda aderido aos ossos e imerja os ossos em 10 mililitros de HBSS/FCS na base da placa de Petri.

Mantendo o recipiente parcialmente protegido com uma tampa estéril, corte cada osso limpo ao meio com uma tesoura. Em seguida, use uma seringa de um mililitro, equipada com uma agulha de 26,5 gauge, para injetar um mililitro de HBSS/FCS do recipiente na extremidade de cada fragmento ósseo, até que toda a medula vermelha tenha sido liberada. Passe quaisquer agregados visíveis de medula óssea pela seringa várias vezes para obter uma suspensão de células únicas, seguido de mistura completa com uma pipeta de 10 mililitros.

Transfira as células para um tubo de coleta e enxágue a placa de Petri uma vez com cinco mililitros de HBSS/FCS para recolher quaisquer células residuais. Em seguida, reúna o enxaguatório no tubo de coleta e coloque as células no gelo. Para montar um cultivo de células da medula óssea, centrifugue as células coletadas e aspire o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur estéril acoplada a sucção a vácuo.

Solte o pellet rico em glóbulos vermelhos batendo levemente. Em seguida, adicione 10 mililitros de tampão de lise de hemácias e re-suspenda as células com vortex. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, interrompa a lise com 10 mililitros de HBSS/FCS e centrifugue as células, re-suspendendo o pellet em meio de células da medula óssea.

Conte o número de células viáveis pelo método de exclusão com azul de tripano e transfira as células necessárias para um novo tubo com meio de células da medula óssea. Em seguida, recolha as células por centrifugação e reconstitua o sedimento em uma diluição de quatro milhões de células por mililitro em meio de células da medula óssea contendo 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF. A seguir, adicione 9,5 mililitros de meio de células da medula óssea suplementado com 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF a uma placa de Petri bacteriológica estéril por cultura e adicione 500 microlitros de células ao centro de cada placa.

Incube as células a 37 graus Celsius e cinco por cento de CO2. No terceiro dia, adicione 10 mililitros de meio fresco de medula óssea suplementado com 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF a cada cultura, tomando cuidado para minimizar qualquer perturbação nas células. No sexto dia, transfira cuidadosamente 10 mililitros do sobrenadante da cultura celular para um tubo cônico estéril de 50 mililitros.

Centrifugue as células e re-suspenda o pellet em 10 mililitros de meio fresco para células da medula óssea, contendo 20 nanogramas por mililitro de GM-CSF. Em seguida, vorte a suspensão celular suavemente e devolva as células à placa de cultura. No dia um, as células da medula óssea são pequenas e esparsas, mas no dia três, o número e o tamanho das células aumentaram, e algumas já começaram a aderir.

No sexto dia, há mais células e são observadas frações aderentes e não aderentes. O cultivo pode ser colhido do sétimo ao décimo dia e selecionado por tamanho e células vivas, com uma porcentagem maior de células positivas para CD11c obtida a partir dos cultivos do décimo dia. No sétimo dia, a fração não aderente coletada é fortemente enriquecida por células com morfologia dendrítica.

As populações positivas para CD11c e negativas para GR1, coletadas no sétimo e décimo dia, podem ser divididas em três populações principais. Macrófagos, células dendríticas imaturas e células dendríticas maduras, com base na expressão de MHCII e na ligação com FL-HA. Curiosamente, MerTK, embora considerado um marcador de macrófagos, apresenta expressão acentuada tanto nas populações de macrófagos quanto de células dendríticas imaturas, coletadas nos dias sete e dez, com baixo nível de expressão observado nas células dendríticas maduras.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de utilizar técnicas estéreis durante toda a coleta da medula óssea e o cultivo celular. Após este procedimento, as células também podem ser separadas para examinar as populações celulares individualmente, ou podem ser estimuladas com agentes inflamatórios e posteriormente analisadas quanto à sua produção de citocinas por meio de coloração intracelular e citometria de fluxo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células da medula óssea e cultivá-las em GM-CSF para gerar tanto células dendríticas quanto macrófagos semelhantes aos alveolares.