Name: Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprenda a gerar camundongos retrogênicos por transdução retroviral de células progenitoras de medula óssea para estudar receptores de células T in vivo. Este método permite analisar múltiplos TCRs específicos para diversos antígenos.

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Este trabalho foi suportado por concessões do NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) para MLB, Programa Piloto / Viabilidade do Centro de Pesquisa de Diabetes (P30-DK079638) no BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, AAI Carreiras em Imunologia Fellowship para MB, e The Robert e Janice McNair Foundation.

Declaração de Ética: Todo esforço é feito para manter o desconforto animal ou stress a um mínimo durante a irradiação e na veia da cauda injeções. Os ratos são usados ​​como uma fonte de células nestas experiências; como tal, não existem procedimentos ou manipulações para além da eutanásia. Os ratos serão sacrificados por inalação de CO2, seguido por deslocamento cervical para confirmar a morte. Este procedimento é consistente com as recomendações do Painel sobre a eutanásia da American Veterinary Medical Association. 1. Prepare Retroviral Construir <ol><li> Sub-clone da cadeia do receptor de células T (TCR) alfa e beta, separadas por um ligante 2A, num retroviral 11 de vectores baseado em MSCV (exemplo, pMIAII ou pMIGII) 11. NOTA: O vinculador 2A permite a expressão estequiométrica e concordantes das cadeias alfa e beta de TCR de uma única estrutura de leitura aberta. O vector inclui uma cassete IRES proteína fluorescente (GFP ou ametrine) que é usado pararastrear as células transduzidas e eficiência de transdução. Para um protocolo detalhado consulte Holst et al 11. </li><li> Isolar o plasmídeo de ADN utilizando o kit de preparação de plasma obtidos comercialmente ou de um produto semelhante. Usar uma concentração de trabalho de 1 - 2 mg mL -1. </li></ol> 2. Geração de retrovirais Produtor linhas celulares <ol><li> Utilizar um processo de dois passos para produzir as linhas celulares produtoras retrovirais. NOTA: Para um protocolo detalhado, por favor consulte Holst et al 11.. <ol><li> Gerar retrovírus por transfecção transitória de células 293T com três plasmídeos (pVSVG, PEQ-Pam3 (-e) e vector de interesse 11) e tomar o sobrenadante retroviral a partir de células 293T para transduzir a linha celular produtora retroviral ecotrï¿½ica GP + E86. </li><li> Isolar o top 40% dos que expressam células produtoras GP + E86 fluorescentes por FACS e propagar as células produtoras + E86-GP transdcuced como fonte de vírus. NOTA: A geraçãode produtores de título elevado é crítico para a transdução eficiente de células de medula óssea. Para um protocolo completo, por favor ver Holst et al. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirus-transferência de genes mediada Stem Cell (Dia -5) <ol><li> Descongelar e cultura -1,0 0,5 x 10 6 de cada linha celular produtora GP + E86 em DMEM completo de 10% (vol / vol) de FBS para permitir um crescimento suficiente para duas placas confluentes de 150 mm por dia 0 do presente protocolo. NOTA: O descongelamento 0,5-1,0 x 10 6 de cada linha celular produtora GP + E86 numa placa de 10 centímetros permitirá para 30 - 50% de confluência no dia 5. Isto também permite a 5 dias de cultura, a fim de expandir a GP + E86 linhas de células produtoras de duas placas confluentes de 150 mm por dia 0. <ol><li> A linha celular produtora retroviral cultura em meios de cultura de tecidos completo contendo 5% de soro de vitelo feta, e ciprofloxacina (10 ug / ml) para evitar contaminação por micoplasma. NOTA: Interrompa o uso da ciprofloxacina em generating o sobrenadante virai para a transdução de medula óssea. Evitar o excesso de crescimento da linha celular produtora, como isso vai impactar negativamente a medula óssea eficiência de transdução. </li></ol></li></ol> 4. Os ratinhos dadores Inject com 5-fluorouracilo (5-FU) (dia -3) <ol><li> Pesa-se a ratinhos dadores (5 - 12 semanas de idade) para determinar a quantidade de 5-FU necessária. Usando camundongos com idade inferior a 5 semanas de idade resulta em baixo rendimento de medula óssea. Para assegurar a expressão de uma única TCR, utilizar uma estirpe de ratinhos deficientes em células T, tais como SCID, pano ou alfa de TCR ratinhos deficientes como dadores de medula óssea. </li><li> Trabalhando no capuz de cultura de tecidos, diluir o estoque de 5-FU com PBS esterilizado a fim de fazer uma quantidade suficiente de 10 mg mL-1 de solução de trabalho de 5-FU para proporcionar 0,15 mg de 5-FU por grama de peso corporal. </li><li> Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha 37 G, intraperitoneal injectar 0,15 mg de 5-FU por grama de peso do corpo por murganho dador. NOTA: Use o mouse 1 doadores por um destinatário para iniciar e ajustaro número de ratinhos dadores de acordo com o rendimento celular. Um método alternativo para o tratamento com 5-FU para o enriquecimento e isolamento de células progenitoras de medula óssea é a selecção negativa de células positivas como descrito em linhagem Viret et ai. </li></ol> 5. Procedimento de Extracção de Medula Óssea (Dia 0) <ol><li> Obter tesouras de dissecação e pinças para isolamento óssea. Prepare meios (HBSS suplementado com FCS a 5% (vol / vol)) para recolher ossos em um tubo de 50 ml. Manter 50 ml cónico contendo media no gelo. Eutanásia ratos por inalação de CO2, seguido por deslocamento cervical para confirmar a morte. Comprima pata para garantir que não haja reflexos são detectados. </li><li> Esterilizar o local da cirurgia e instrumentos cirúrgicos com etanol ou metanol. Remova o fêmur, tíbia, úmero e cintura pélvica com cuidado pelo primeiro corte e sob a cintura pélvica. Cortar para trás para baixo ao longo do fêmur à tíbia. Remover todo o tecido circundante usando tesouras e pinças para obter ossos limpos. Guardaossos hidratadas em HBSS + 5% (vol / vol) de FBS. </li><li> Separar os ossos através do corte nas articulações, certificando-se de cortar ambas as extremidades fora de cada osso. Inserir uma agulha de calibre 25 ligada a uma seringa de 10 ml contendo HBSS + 5% (vol / vol) de FBS. Aplique pressão e lave tudo de medula óssea através de um descanso coador de 70 mícrons em um cônico de 50 ml. </li><li> Periodicamente, empurrar a medula óssea através do filtro de 70 um utilizando o êmbolo de uma seringa de 1 ml ou 3 ml. Lavar o filtro com HBSS + 5% (vol / vol) de FBS. Isto irá assegurar uma suspensão de célula única que é livre de fragmentos de osso e de tecido. Manter as células estéreis realizando o procedimento em uma capa estéril. </li><li> Centrifugar as células da medula óssea a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 6. Medula Óssea Cultura (Dia 0) <ol><li> Decantar ou aspirar mídia e sedimento de células ressuspender em tampão de 1 ml de amônio base de cloreto de lise de sangue vermelho (ou RBC tampão de lise equivalente) por tubo de 50 ml. Depois de 1 min de incubação a salatemperatura, extinguir o tampão de lise de glóbulos vermelhos por adição de 10 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS. </li><li> células centrifugar a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Decantar ou aspirar o sobrenadante e ressuspender medula óssea em 5 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS. Contar as células com uma câmara de contagem de Neubauer. NOTA: rendimento geral deve ser aproximadamente 5-10 x 10 6 culas por rato; No entanto, o rendimento pode variar entre diferentes estirpes de ratinhos. </li><li> Células da medula óssea placa a uma densidade de 4 x 10 7 culas por placa de 150 mm em 30 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS suplementado com IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1). NOTA: Use citocinas recém-descongeladas-alíquotas. Não utilizar citocinas que foram congeladas e descongeladas mais do que uma vez ou mantidas a 4 ° C durante mais de 2 semanas. </li><li> Incubar a medula óssea durante a noite (aproximadamente 24 horas) a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol><ol><li> A placa 3 x 10 6 células produtoras retrovirais por placa de 150 mm em 18 ml de DMEM completo 20% (vol / vol) de FBS. </li><li> Incubar as células produtoras retrovirais a 37 ° C durante a noite. Antecipar uma placa de 150 mm por 15 milhões de células da medula óssea (cerca de 2 - 3) Os ratinhos dadores. </li></ol> 8. Retroviral O sobrenadante (Dia 1) <ol><li> No dia seguinte (aproximadamente 24 horas mais tarde), recolher o sobrenadante retroviral a partir das placas de produtores (criado no passo 7) pela elaboração do sobrenadante retroviral diretamente fora da placa de 150 mm com uma seringa de 10 ml e filtrar através de um 0,45 -μm filtro de seringa. </li><li> Cuidadosamente substituir o sobrenadante retroviral removido com 18 ml de DMEM fresco completo de 20% (vol / vol) de FBS. </li><li> Suplementar o sobrenadante retroviral filtrada com IL-3 (20 g mL-1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) e brometo de Hexadimetrina (polibreno) (6 &amp;# 956; g ml -1). NOTA: O brometo de Hexadimetrina deve ser feita a cada 2 meses para evitar uma queda na eficácia de transdução retroviral. </li></ol> 9. Medula Óssea Harvest (Dia 1) <ol><li> Depois de completar o passo 8.3, a colheita das células de medula óssea a partir do Passo 6.4 e transferir o meio contendo células não aderentes em tubos estéreis de 50 ml. </li><li> Lavar as placas vigorosamente com 10 ml de PBS e em recolher a 50 mL cónico a partir do passo 9.1. Se necessário, repita o passo de lavagem. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C, decanta-se o sobrenadante, ressuspender as células em um pequeno volume (1 - 3 ml de DMEM completo) a 20% (vol / vol) de FBS, e contar. Antecipar 50 - recuperação de 75% a partir do dia 0. Ressuspender medula óssea a 1 x 10 6 células por 1 ml de sobrenadante retroviral contendo citocinas e brometo de Hexadimetrina. </li></ol> 10. Medula Óssea Transdução (Dia 1) <ol><li> Placa do sobrenadante / ma óssea retroviralrrow mistura a um volume de 3 ml por poço numa placa de cultura de tecidos de seis poços. Enrole as placas em plástico para minimizar a troca de gás durante a centrifugação na etapa 10.2. </li><li> Rodar as placas de seis poços embrulhadas em 1000 xg durante 60 min a 37 ° C. </li><li> Após a rodada é concluída, retire o filme plástico e coloque as placas em uma incubadora a 37 ° C CO 2 durante 24 h. </li></ol> 11. Retroviral sobrenadante e Transdução (Dia 2) <ol><li> Após 24 horas, recolher o sobrenadante viral fresco a partir da linha celular produtora viral. Filtra-se o sobrenadante retroviral, utilizando uma seringa de 10 ml e um filtro de seringa de 0,45? M. Suplementar o sobrenadante filtrado retroviral com IL-3 (20 g mL-1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) e brometo de Hexadimetrina (6 g ml -1). </li><li> Em seguida, remover cuidadosamente com uma pipeta ou aspirar os melhores 2 ml de meio de cada poço da placa de seis poços contendo as células da medula óssea. NOTA: trabalhar com cuidado para não aspirar a medula óssea, o que é normalmente concentrada no meio do poço. Alternativamente, o sobrenadante é removido pode ser centrifugada para recuperar as células de medula óssea perdida. </li><li> Para cada poço na medula óssea placa de 6 poços adicionar 3 ml de sobrenadantes contendo citoquinas frescas virais e brometo de Hexadimetrina. Enrole as placas em plástico, e repetir a transdução de centrifugação a 1000 xg durante 60 min a 37 ° C. Desenrole as placas e incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite (cerca de 24 hr). </li></ol> 12. A adição de DMEM fresco suplementado (dia 3) <ol><li> Após 24 h, remover os melhores 2 ml de meio de cada poço da placa de seis poços contendo as células da medula óssea, como no passo 11.2. Substituir a mídia removido com DMEM fresco de 20% (vol / vol) de FBS suplementado com concentrações finais de IL-3 (20 g mL-1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) . </li><li> Incubar medula ósseaplacas a 37 ° C incubadora de CO 2 durante mais 24 h. </li></ol> 13. Colheita transduzidas de Medula Óssea (dia 4) <ol><li> Após 24 horas, recolher as células da medula óssea a partir das placas de seis poços. Lavam-se as placas com PBS vigorosamente para remover todas as células não-aderentes. <ol><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min a 4 ° C e decanta-se o sobrenadante. </li><li> Ressuspender a medula óssea em um pequeno volume (1 ml) de PBS + 0,5% (vol / vol) de FBS inactivado pelo calor. Manter as células no gelo. </li></ol></li><li> Retirar uma amostra de 10 ul de cada condição de medula óssea e contar as células utilizando uma câmara de contagem de Neubauer. Assumindo 1-2 dador por destinatário, o rendimento será suficiente para transferir, pelo menos 4 x 10 6 culas por rato destinatário. Ressuspender a medula óssea em um volume suficiente de PBS + 0,5% (vol / vol) de FBS inactivado pelo calor a injectar 200 - 300 ul por rato. <ol><li> Injectar pelo menos 2 x 10 6 células, com uma eficácia de transduçãode 25% (pode injectar-se a 8 x10 6 células) por rato por via intravenosa. NOTA: Rotineiramente injectar cinco ratos receptores por duas placas de 6 poços de células de medula óssea. Se o rendimento é substancialmente inferior, mais ratinhos dadores deve ser utilizado até que o número de medula óssea suficiente pode ser obtida. A fim de alcançar a reconstituição óptima, pelo menos 5 x 10 5 transduzidas (fluorescente positivo) deve ser injectada em cada destinatário. </li></ol></li><li> Com uma micro pipeta, tomar uma amostra de 10-ul de cada condição de medula óssea e analisar a eficiência de transdução por citometria de fluxo com base na expressão do marcador fluorescente (Figura 1A) 11. NOTA: De um modo geral, a percentagem de células positivas fluorescentes é entre 25% e 70%, dependendo da construção e titulação retroviral. O número de células de medula óssea transduzidas necessário reconstituir um rato irradiam sub-letalmente pode variar, dependendo da eficiência de transdução. Quanto menor o transduction eficiência, as células de tutano de osso mais necessária e, inversamente, quanto maior a medula óssea eficiência de transdução, o menor número de células necessário para a reconstituição. eficiência de transdução abaixo de 25% é a ideal e pode resultar em reconstituição e sobrevivência insuficiente. A fim de assegurar a recuperação da medula óssea ótima e eficiência de transdução, usar a mídia e citocinas recém-preparadas de cultura de tecidos. Quando se expressa um novo TCR utilizando o sistema retrogenic, a selecção de TCR que in vivo é desconhecida. Dependendo de cada indivíduo afinidade de TCR, de TCR selecção no timo e expressão da célula T periférica 17 variará. </li></ol> 14. rato irradiação, Bone Marrow Injection e Cuidados <ol><li> Irradiar camundongos um dia antes da injecção de medula óssea (mesmo dia que passo 13). Use as seguintes doses: camundongos C57BL / 6 (e outras estirpes do tipo selvagem), 900 rads; RAG1 - / - ratos, 500 rads; SCID, 300 rads). <ol><li> ratinhos receptores lugar sobre amoxicilina (50 mg / kg / dia) ou outro antibiótico de tratamento de água, antes da irradiação, e continuar a antibióticos para as primeiras duas semanas após a injecção de medula óssea. NOTA: dose de irradiação óptimo pode ter que ser determinadas empiricamente. </li></ol></li><li> Para injecção, carregar as células do Passo 13.1 para uma seringa de 1 ml com agulhas grossas imediatamente antes da injeção, em seguida, mudar a agulha de calibre 27 para injecção, expelir o ar para evitar embolia aérea. camundongos calor sob uma lâmpada de aquecimento e injetar 0,2 ml de medula óssea por rato por via intravenosa. NOTA: Não deixe que as células se sentar na seringa por qualquer período de tempo ou as células vão resolver. </li><li> Monitorar os camundongos semanalmente para garantir que eles permaneçam saudáveis. </li><li> Depois de 5 - 6 semanas, os ratinhos sangrar para verificar para reconstituição com base de GFP + / + ametrina e co-expressão de TCR (Figura 1B) 11. </li></ol>

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<li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

No protocolo, detalhamos vários passos críticos para garantir a saúde da medula óssea ideal, eficiência de transdução e reconstituição. Primeiro passo crítico é a geração e manutenção das células produtoras viral GP + E86. Use linhas celulares produtoras passagem precoce e manter a 80% de confluência ou inferior antes de ser utilizado. Ao fazer células produtoras viral GP + E86 frescos, garantir as células 293T são passagem precoce e crescente em cultura durante 24-48 horas. Chapeamento de muitas células GP + E86 durant...

Receptor de células T (TCR) repertório de ratinhos e seres humanos tem sido estimado em 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR únicos respectivamente 1,2. Esta grande diversidade permite que as células T a reconhecer uma vasta gama de epitopos de antigénios derivados de auto-péptidos, bem como a partir de agentes patogénicos apresentados pelo complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sobre as células apresentadoras de antígenos (APCs). As diferenças sutis nas interações das TCRs com complexos exclusivos péptido-MHC ditar se uma célula T vai sofrer apoptose, anergia, activação, diferenciação, produção de citocina ou citotoxicidade. No entanto, devido ao grande repertório de TCR, como análise de um TCR específico irá responder a um antigénio particular, exige o uso de sistemas de TCR únicos. Vários ratinhos transgénicos TCR ter sido gerada, a fim de estudar a função de um único TCR num modelo in vivo 3-9. No entanto, é preciso tomar cuidado para ratinhos transgénicos TcR incluindo oo custo, o período de tempo para gerar um único ratinho transgénico e o assim chamado efeito fundador da inserção do transgene no ADN da linha germinal aleatória 10. Assim, relativamente poucos ratinhos transgénicos TCR ter sido gerado para um dado antigénio e as implicações funcionais de alta e baixa afinidade do TCR para o mesmo epitopo raramente são abordados. Para abordar a necessidade de uma abordagem rápida para a tela e estudar vários TCRs individualmente ou em combinação, ratinhos retrogenic ( &quot;retro&quot; de retrovírus e &#39;genicas&#39; de transgénica) têm sido utilizadas como uma alternativa para ratinhos transgénicos TcR 11-13. O motivo de consenso péptido 2A encontrado dentro de vários vírus consistem de uma 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, em que a clivagem ocorre entre a glicina da 2A e a prolina do 2B de cis actuando atividade hidrolase, resultando em pular do ribossoma durante a tradução 10,14-16. Para um diagrama detalhado mostrando a Cleavage dos vários péptidos 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consulte referências 10 - 12. Desta maneira, 2 cistrões (TCR alfa e beta de TCR) pode ser ligado resultando em tradução estequiométrica num único vector. Utilizando esta abordagem, somos capazes de expressar e comparar diretamente vários TCRs específicas de antígeno in vivo.

<table><tbody><tr><td>DMEM, glicose alta + glutamina</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>Modificação de Dulbecco do meio de Eagle com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biological</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-Versene</td><td>Lonza</td><td>17-161F</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &#181; m filtro de seringa</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma</td><td>H9268-10G</td><td>Estéril Filtrado em dH2O</td></tr><tr><td>Ciprofloxacina&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAJ61970-06</td><td></td></tr><tr><td>5-fluorouracil (5-FU)</td><td>VWR</td><td>AAA13456-06</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos não essenciais</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solução</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strept</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>150 mm placas de cultura de tecidos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>639160</td><td></td></tr><tr><td>Placa plana de 6 poços tratada com cultura Tisue</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>70 &#181; m filtros de células de nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-3</td><td>Invitrogen</td><td>PMC0033</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>Fator</tr> de <tr><td>Células-Tronco de Camundongo</td> PHC0063 <td>Invitrogen</td><td>PMC2113L</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-D13-CM</td><td></td></tr><tr><td>HANKS Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>21020147</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringa de 10 ml</td><td>BD</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>BD Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td></td> 309659 <td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2 BD Agulha de Deslizamento de Precisão</td><td>BD</td><td></td><td></td>305109</tr><tr><td>30 G x 1/2 BD Agulha de Precisão</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

transdução retroviral de células de medula Óssea progenitoras para gerar células t receptor retrogenic mice

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

A sinalização do receptor de células T (TCR) é essencial no desenvolvimento e diferenciação de células T no timo e na periferia, respectivamente. A vasta gama de TCRs prova que o estudo de uma resposta antigênica específica é difícil. Portanto, camundongos transgênicos TCR foram feitos para estudar a seleção positiva e negativa no timo, bem como a ativação, proliferação e tolerância de células T periféricas. No entanto, relativamente poucos camundongos transgênicos TCR foram gerados especificamente para qualquer antígeno. Assim, faltam estudos envolvendo TCRs de afinidades variadas para o mesmo peptídeo antigênico. A geração de uma nova linha transgênica TCR pode levar seis ou mais meses. Além disso, qualquer retrocruzamento específico pode levar mais seis meses. A fim de permitir a geração e triagem mais rápida de múltiplos TCRs, foi estabelecido um protocolo para transdução retroviral da medula óssea com expressão estequiométrica das cadeias TCRα e TCRβ e a geração de camundongos retrogênicos. Cada camundongo retrogênico é essencialmente um fundador, praticamente negando um efeito fundador, enquanto o período de tempo para gerar um TCR retrogênico é reduzido de seis meses para aproximadamente seis semanas. Aqui apresentamos uma alternativa rápida e flexível aos camundongos transgênicos TCR que podem ser expressos em qualquer fundo escolhido com qualquer TCR específico.

Osso eficiência de transdução de medula é verificada no passo 13.3 do protocolo antes de a medula óssea é injectado no IV na veia da cauda Na medula óssea representante transdução figura (Figura 1A), cerca de 10 uL da medula óssea colhidas foi adicionado a 100 ul de PBS e analisadas quanto à expressão ametrina. Geralmente, a percentagem de células positivas fluorescentes é entre 25% e 70%, dependendo da construção e titulação retroviral. Após a injecção da medula óssea d...

Apresentamos um protocolo rápido e flexível para um único sistema de expressão in vivo baseado em receptor de células T (TCR) retroviral. Vetores retrovirais são usados para transduzir células progenitoras da medula óssea para estudar o desenvolvimento de células T e a função de um único TCR in vivo como uma alternativa aos camundongos transgênicos TCR.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

O objetivo deste procedimento é gerar camundongos retrogênicos para determinar a função in vivo de múltiplos receptores de células T. Isso é realizado utilizando um construto retroviral que codifica as cadeias alfa e beta do receptor de células T, ligadas por um motivo consenso de peptídeo 2A. Este método pode realmente ajudar a responder perguntas-chave na área de imunologia, pois ao testar múltiplos TCRs específicos para diversos antígenos, é possível determinar sua função in vivo.A principal vantagem dessa técnica é que, uma vez concluído o construto retroviral, o compartimento de linfócitos T dos camundongos retrogênicos será reconstituído em aproximadamente sete semanas. Além disso, cada camundongo retrogênico é essencialmente um fundador, de modo que, ao analisar múltiplos camundongos, o efeito fundador é eliminado. A demonstração desta parte do procedimento será feita pela Dra. Maria Bettini.Prepare-se para a extração da medula óssea colocando tesoura e pinça de dissecação estéreis na área cirúrgica e resfriando o meio de dissecação em um tubo cônico de 50 mililitros sobre gelo. Após eutanasiar o camundongo e confirmar a morte por dislocação cervical, use a tesoura de dissec

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.

Produção de retrovírus replicação defeituosa por transfecção transiente das células 293T

Demonstramos aqui que a reprogramação epigenética via transferência nuclear de células somáticas (TNCS) pode ser usado como uma ferramenta para gerar modelos de ratos com pré-definidos receptor de células T (TCR) especificidades. Estes ratos transnuclear expressar a TCR correspondente do seu lócus endógeno sob o controle do promotor endógeno.

Ratos Transnuclear com pré-definidos T Especificidades receptor da célula contra a Toxoplasma gondii Obtidos Via TNCS

Nós apresentamos um protocolo para a produção de antígenos específicos do mouse células T usando transdução...

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

Um sistema eficiente de estrutura e análise da função de um gene em...

Produção recombinante Retroviral e infecção de células B

A geração e caracterização de células T específicas de tumor utilizando ratinhos humanizados é descrita aqui. Tecido do timo humano e geneticamente modificadas de células-tronco hematopoiéticas são transplantadas em ratos imunocomprometidos. Isto resulta na reconstituição de um sistema imune humano permitindo engenharia para exame in vivo de anticorpos anti-tumorais respostas imunes.

Utilizando o rato como um BLT humanizado baseado Stem Modelo Gene Therapy célula tumoral

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Este manuscrito fornece uma descrição da metodologia usada para estabelecer modelos de camundongos de transdução-transplante. Um relato detalhado é dado de erros técnicos a serem evitados ao realizar transplantes de medula óssea. Deve-se obter uma compreensão clara da importância do alto título viral, transfecção/transdução e irradiação.

Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Aprenda a gerar camundongos retrogênicos por transdução retroviral de células progenitoras de medula óssea para estudar receptores de células T in vivo. Este método permite analisar múltiplos TCRs específicos para diversos antígenos.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

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