Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste experimento é identificar a espécie de material botânico utilizando espectrometria de massas com ionização ambiental. Em conjunto com análise estatística multivariada. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de química e biologia, como, por exemplo, qual espécie de planta você possui com base em sua impressão química.

E você também pode obter informações sobre as moléculas bioativas presentes no tecido vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que é necessária uma preparação mínima da amostra para a análise, e os dados podem ser adquiridos em poucos minutos. Este método também pode ser utilizado para resolver outros problemas na química.

Por exemplo, rastrear intermediários e produtos de reações em síntese orgânica, analisar matrizes complexas de diferentes tipos e realizar análise de fase de vapor. Para preparar o material fresco da folha de kratom, utilize um furador de seis milímetros de diâmetro para criar fragmentos uniformes do material foliar de kratom da planta M. speciosa. Repita este processo cinco vezes.

Para extrair o pó de kratom, trabalhe em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e suspenda uma pequena quantidade de pó de kratom Bali em um mililitro de uma mistura de solvente etanol-água na proporção um para um. Repita este processo cinco vezes. Submeta as amostras de extrato de pó de kratom Bali à sonicagem em banho ultrassônico por 30 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, centrifugue as amostras do extrato de pó de kratom Bali por dois minutos a 750 vezes G à temperatura ambiente. Decante o solvente do pó residual para análise subsequente. Para preparar as sementes de datura, corte ao meio uma semente de D. stramonium no plano transversal utilizando uma lâmina de barbear.

Repita este processo utilizando cinco sementes diferentes. Após configurar os parâmetros do espectrômetro de massas ou MS conforme descrito no protocolo textual, pressione Iniciar Execução no software de controle do espectrômetro de massas para analisar a folha de kratom. Suspenda o resíduo da planta de folha de kratom entre a fonte de íons e a entrada do espectrômetro de massas com pinças até que um espectro seja obtido.

Repita este procedimento cinco vezes com porções separadas de material vegetal. Para calibrar o espectro com polietileno glicol 600, abreviado como PEG, mergulhe a extremidade fechada de um tubo capilar de ponto de fusão no padrão de PEG. Suspenda o capilar revestido entre a fonte de íons e a entrada do espectrômetro de massas.

Selecione o botão Parar para encerrar a execução analítica. Pressione Iniciar Execução no software de controle do espectrômetro de massas para analisar a folha de kratom seca. Com uma pinça, posicione uma pequena quantidade do material da folha seca entre a fonte de íons e a entrada do espectrômetro de massas até obter um espectro.

Repita a aquisição cinco vezes, analisando um novo material vegetal a cada vez. Calibre o espectro com PEG como antes e, em seguida, selecione o botão Parar para encerrar a análise. Para analisar o pó de kratom, pressione Iniciar Execução no software de controle do espectrômetro de massas.

Mergulhe a extremidade fechada de um capilar de ponto de fusão no pó de kratom. Suspenda o capilar revestido entre a fonte de íons e a entrada do espectrômetro de massas até obter um espectro. Repita a análise cinco vezes, utilizando um novo capilar a cada vez, seguido por calibração com PEG.

Para analisar o extrato de kratom, mergulhe a extremidade de um tubo capilar no extrato. Suspenda o tubo capilar no porta-amostras 12 sobre o trilho linear do espectrômetro de massas. Repita cinco vezes, utilizando um extrato diferente a cada vez.

Pressione Iniciar Execução no software de controle do espectrômetro de massas. Usando o painel de controle, selecione o botão de avanço para mover o trilho linear através do feixe de íons a uma taxa de um milímetro por segundo para coletar os espectros. Calibre o espectro com PEG como anteriormente e pressione Parar para encerrar a execução analítica.

Para analisar as sementes de datura, pressione Iniciar Execução no software de controle do espectrômetro de massas. Com pinça, segure metade da semente de datura entre a fonte de íons e a entrada do espectrômetro de massas até que um espectro seja coletado. Certifique-se de que o lado cortado esteja voltado para a fonte de íons.

Repita este procedimento cinco vezes, analisando uma nova metade de semente a cada vez. Conclua a análise com a calibração de PEG e pressione Parar para encerrar a execução analítica. Após realizar o processamento de dados conforme descrito no protocolo textual, realize a análise de componentes principais navegando até a seção Classificar do software de análise espectral, na aba Configuração, e criando classes para o processamento de dados ao selecionar Adicionar Classe.

Importe os arquivos de texto de dados selecionando Adicionar Arquivos. Atribua os arquivos de dados à classe apropriada de planta selecionando Arquivos de Texto e Definir Classe para Arquivos Selecionados. Selecione as massas características para discriminação a partir da MS do conjunto de treinamento e defina o percentual de limite para 1%. Em seguida, defina uma tolerância de massa para 10 e selecione Criar Vetores a partir dos Arquivos de Dados.

Na seção Computar, realize a análise de componentes principais marcando a caixa para Gráfico PCA 3D e selecione Calcular. Execute a validação cruzada leave-one-out selecionando Validar. Em seguida, gere o mapa de calor dos dados acessando a aba Plotagem de Frequência do software de análise espectral e selecionando Mapa de Calor.

Selecione os dados salvos de Limiar para definir o limiar de abundância em 1%. Exporte o mapa de calor para uma planilha ao selecionar Salvar mapa de calor no Excel. No programa de planilha, salve o mapa de calor exportado como um arquivo de texto. Em seguida, para realizar a análise de agrupamento hierárquico, importe o mapa de calor como um arquivo de texto no software Cluster 3.0.

No separador Hierárquico do Cluster 3.0, nas caixas de seleção Genes e Matrizes, marque Agrupar e Calcular pesos. Defina o valor de corte em 0,1 e o expoente como um. Selecione o agrupamento por ligação simples para realizar a análise.

Por fim, visualize o arquivo de dados cdt gerado na visualização de árvore Java. São apresentados aqui espectros representativos no modo de íons positivos com ionização suave de produtos de kratom. Compostos previamente isolados de M. speciosa foram identificados.

Incluindo biomarcadores psicoativos Mitraginina e 7-Hidroxi-mitraginina. São apresentados aqui espectros representativos em modo de ionização suave com ionização positiva de sementes de datura. Compostos previamente isolados de datura foram identificados, incluindo os biomarcadores psicoativos Atropina e Escopolamina.

Representações em mapa de calor dos dados espectrométricos de massa são ilustradas aqui. Um gráfico de análise de componentes principais, ou PCA, dos dados de kratom e datura é apresentado. O gráfico PCA mostra claramente que os dados de kratom e os dados de datura estão bem separados entre si.

A análise de PCA também revelou que as variedades individuais de kratom e as diferentes espécies de datura podem ser identificadas e diferenciadas entre si. São apresentados os resultados da análise de agrupamento hierárquico, ou HCA, dos dados espectrais de massa do kratom e da datura. Os resultados da HCA revelaram diferenciação entre classes, espécies e variedades, baseando-se exclusivamente em dados obtidos por espectrometria de massas de alta resolução com análise direta em tempo real, confirmando os resultados da análise de PCA.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em menos de uma hora, dependendo do número de amostras que você tiver, se for feita corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar análise direta e espectrometria de massas em tempo real para analisar amostras complexas e como utilizar o processamento de análise estatística dos dados para obter informações sobre as espécies. Ao tentar este procedimento, é importante segurar a amostra no feixe de íons por um tempo apropriado, a fim de adquirir um espectro de massas completo da amostra.

Essa técnica permitiu que pesquisadores em diversas áreas, incluindo Omica de Plantas, Perícia Criminal, Química Orgânica e Analítica, explorassem a análise de voláteis emitidos por plantas, identificassem alternativas legais para substâncias entorpecentes e monitorassem produtos de reação em tempo real.