Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

O objetivo geral deste procedimento é fabricar uma camada de complexação de polieletrólitos. Um transportador que pode aprisionar e regular a liberação de uma ampla gama de fatores de crescimento com um domínio de ligação à heparina. Este método pode responder a perguntas-chave no campo da engenharia de tecidos ortopédicos para aprisionamento eficiente e entrega de fatores de crescimento dedicados.

As principais vantagens dessa técnica é que ela não requer o uso de orgânicos com frequência. Que é conhecido por afetar as atividades biológicas dos fatores de crescimento. Dissolver 200 miligramas de alginato de sódio não irradiado ou 400 miligramas de alginato de sódio irradiado com oito megarad em 10 mililitros de água bidestilada

E agite por uma hora. Armazene a solução de alginato a quatro graus Celsius durante a noite. Filtre a solução de alginato com um filtro de seringa estéril de 0,2 mícron antes da fabricação de microesferas de alginato.

Desinfete o gerador eletrostático de BE e a bomba de seringa com etanol 70% e coloque-os em uma cabine de segurança biológica de classe dois. Em seguida, coloque uma bacia de vidro com uma barra de agitação magnética dentro do gerador BE. Coloque o eletrodo do braço do gerador BE nove centímetros acima da bacia.

Conecte o cabo do eletrodo do gerador BE ao parafuso neuro dois do eletrodo do braço. E despeje 80 mililitros de solução de cloreto de estrôncio na bacia. Em seguida, coloque cinco mililitros de solução de alginato filtrada a 0,2 mícron na seringa em tubo de borracha.

Depois de conectar o tubo de borracha ao eletrodo do braço, ligue a bomba da seringa a cinco mililitros por hora. Por dois minutos. Para expelir o ar dentro da tubulação e entregar a solução de alginato na ponta do bico.

Em seguida, desligue a bomba de seringa. Para iniciar a geração de microesferas, defina o encapsulador para 5.8 quilovolts. Seguido pela bomba de seringa a uma taxa de fluxo de alginato de cinco mililitros por hora.

Descarte as microesferas geradas durante os primeiros dois minutos, pois essas microesferas tendem a ter tamanhos e formatos irregulares. Recolha as microesferas subsequentes na solução de cloreto de estrôncio 0,2 molar. Desligue a bomba da seringa seguida do encapsulador.

Depois de bombear o volume pré-planejado de solução de alginato. Repita isso para lotes subsequentes de fabricação de microesferas. Armazene as microesferas em 20 mililitros de solução de cloreto de estrôncio 0,2 molar a quatro graus Celsius durante a noite para completar a reticulação e estabilizar o gel.

Colete 0,5 mililitros de microesferas de alginato com uma pipeta de plástico. E coloque-o em uma lâmina de vidro. Veja as microesferas sob um microscópio óptico com ampliação de 10x.

Tire 10 imagens das microesferas com uma câmera CCD de microscópio. Salve as imagens com uma barra de escala de 500 mícrons no formato TIFF com uma resolução de 2048 por 1536. Usando as ferramentas de comprimento na imagem J, meça o tamanho das microesferas.

E a barra de escala. Em seguida, converta o comprimento da microesfera de pixels para micrômetros. Clique nas ferramentas de linha e desenhe uma linha no meio do cordão de alginato.

Clique em analisar na barra de menus e selecione medir. Uma janela pop-up aparecerá. Repita essas etapas para medir todos os grânulos de alginato na imagem.

Meça a barra de escala na imagem. Colete as microesferas usando o filtro de nylon de 100 mícrons. E lave as contas com água bidestilada duplamente.

Usando uma espátula, transfira todas as microesferas feitas de 0,1 mililitros da solução de alginato para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e cubra com gaze para evitar o ressecamento. Por fim, esterilize as microesferas por clivagem automática usando o modo líquido ou de acordo com as especificações do fabricante. Adicione 1,5 litros de água destilada à câmara para evitar que as esferas sequem.

Dentro do capuz BSL2, incube as microesferas estéreis com um mililitro de solução esterilizada de dois miligramas por mililitro de protamina por uma hora em temperatura ambiente. Lave as microesferas revestidas de protamina duas vezes com água bidestilada Em seguida, gire para baixo, usando uma centrífuga de bancada a 200 vezes G por três minutos em temperatura ambiente.

Após centrifugação, aspirar a água com uma seringa. Incube microesferas revestidas de protamina com um mililitro de solução esterilizada de 0,5 miligramas por mililitro de heparina por 30 minutos. Isso cria uma camada de complexação de polieletrólitos com afinidade ávida pelos fatores de crescimento de ligação à heparina.

Após a incubação, aspire a hepraína usando uma seringa. E lave a heparina não ligada dos complexos polieletrolíticos lavando duas vezes com água bidestilada duplamente. Carregue 13,3 microlitros de 1,5 miligrama por mililitro de proteína morfogenética óssea 2 ou solução de molécula 1 semelhante a NELL em 100 microgramas do complexo polieletrolítico.

Incubar o complexo polieletrolítico a quatro graus Celsius abaixo de 30 RPM, agitando por 10 horas. Em seguida, mergulhe as microesferas em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, a 37 graus Celsius com agitação constante. Colete um mililitro do sobrenadante e substitua-o por um mililitro de PBS após um, três, seis, 10 e 14 dias.

Avalie a eficiência de absorção e liberação da molécula um semelhante a NELL usando o método de ensaio de proteína CBQCA de acordo com o protocolo do fabricante. Como alternativa, execute o elisa. A bioatividade da molécula um semelhante a NELL liberada do complexo polieletrolítico é avaliada medindo sua capacidade de aumentar a expressão de fosfatase alcalina em células-tronco da medula óssea de coelho.

Semeie 20.000 células-tronco da medula óssea de coelho por poço em uma placa de 24 poços. E deixe-os crescer por um dia com um mililitro de meio de águia modificado de dulbecco mais 10% de soro bovino fetal a 37 graus Celsius e 5% de CO2. Após 24 horas, substitua o meio por um mililitro de meio osteogênico por sete dias a 37 graus Celsius.

E 5% de CO2. Coloque 300 microgramas de complexo polieletrolítico e complexo polieletrolítico NELL como molécula um dentro de inserções de cultura de células para manter os complexos separados das células. Coloque o inserto na placa de 24 poços para evitar a lavagem das microesferas do complexo polieletrolítico durante a troca do meio osteogênico.

Uma vez a cada três dias, aspire um mililitro do meio osteogênico colocando uma agulha fora da inserção. E substitua por um mililitro de meio osteogênico fresco. Após sete e 14 dias de incubação, determinar a atividade da fosfatase alcalina com um kit de ensaio de fosfatase alcalina.

De acordo com o protocolo do fabricante do kit. Embale os complexos polieletrolíticos nos poros de um andaime de fosfato de cálcio de policaprolactona de grau médico bioabsorvível. Usando uma espátula esterilizada dentro de uma câmara BSL2.

Adicione uma solução de 1,5 miligrama ou mililitro de proteína morfogenética óssea dois ou molécula semelhante a NELL um ao andaime embalado com complexo de polieletrólitos. E incube durante a noite a 4 graus Celsius. As microesferas de alginato são inspecionadas ao microscópio para monitorar seu tamanho e morfologia.

As microesferas de alginato não irradiadas são esféricas e a contraparte irradiada é em forma de lágrima. A distribuição de tamanho é um fator importante de absorção do fator de crescimento. E a redução no tamanho aumenta a proporção superfície/área.

Ao medir microesferas de alginato com o software de imagem J, uma média de 100 microesferas fornece uma boa estimativa da distribuição de tamanho em cada correspondência de microesferas. Como a absorção do fator de crescimento depende da técnica de revestimento adequada, a espessura da camada de cada revestimento é observada por microscopia confocal. Aqui, imagens confocais de microscopia de varredura a laser de microesferas de alginato incubadas com análogos fluorescentes de protamina, heparina, molécula semelhante a NELL um e proteína morfogenética óssea dois são mostradas.

A atividade da fosfatase alcalina é usada para medir a bioatividade do fator de crescimento liberado. Um aumento de 2,2 vezes na atividade da fosfatase alcalina foi observado após a incubação com a molécula tipo NELL do complexo polieletrolítico um no dia 14. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as concentrações de alginato afetam a estabilidade das microesferas. Para alginatos irradiados, exigimos quatro por cento de vias. Para contrapartes não irradiadas, exigimos uma porcentagem de duas vias.

Seguindo esses procedimentos, podemos aumentar ainda mais a carga do fator de crescimento por meio de revestimento multicamada. Essa técnica permite que pesquisadores no campo da engenharia de tecidos explorem a entrega do fator de crescimento em outros modelos de doenças. Depois de assistir a este vídeo, você pode fabricar complexo de polieletrólitos com distribuição de tamanho estreita.