Name: Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprenda a fabricar complexos polieletrolíticos com heparina e protamina para liberação controlada de fatores de crescimento osteogênicos. Este método reduz 20 vezes a dose de BMP-2 em aplicações de fusão espinhal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esses estudos foram financiados pelo National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 e NMRC EDG/0022/2008.

1. O alginato Preparação Solution <ol><li> Dissolver 200 mg de alginato de sódio (não irradiado) ou 400 mg de 8 MRad irradiado alginato de sódio em 10 ml dupla de água destilada e agitar durante 1 hora para alginato não-irradiada e 15 min para o alginato irradiado. Guardar a solução de alginato a 4 ° C durante a noite. Filtra-se a solução de alginato com um filtro de seringa de 0,2 um estéril antes da fabricação de microesferas de alginato. </li></ol> 2. O alginato Microbead Fabrication <ol><li> Desinfectar o gerador de talão eletrostática e bomba de seringa com 70% de etanol e colocá-los em uma classe II Biológica Gabinete de Segurança (Figura 1). </li><li> Colocar uma bacia de vidro com uma barra de agitação magnética no interior do gerador talão. </li><li> Defina o eletrodo braço do gerador de talão de 9 cm acima da bacia. </li><li> Conecte o cabo de força do gerador talão para o parafuso serrilhado 2 do eletrodo braço, e despeje 80 ml ​​de solução SrCl2 nobacia. </li><li> Carga de 5 ml de solução de alginato de 0,2 um filtrado para dentro do tubo da seringa e de borracha. Depois de ligar o tubo de borracha para o eléctrodo de braço, ligar a bomba de seringa a 5 ml / h durante 2 minutos para expelir o ar de dentro da tubagem e proporcionar a solução de alginato para a ponta do bocal. Desligue a bomba de seringa. </li><li> Em seguida, liga o encapsulador e, em seguida, a bomba de seringa para iniciar a geração de microesferas. Definir a taxa de fluxo de alginato a 5 ml / hr ea tensão de 5,8 kV na encapsulator. Descartar as micropérolas gerados durante os dois primeiros minutos (ou a solução de alginato de 0,5 ml iniciais bombeado para fora da seringa), uma vez que estas microesferas tendem a ser irregular dimensionada e conformada. </li><li> Recolha microbeads subsequentes na solução de cloreto de 0,2 M de estrôncio. Desligue a bomba de seringa e o encapsulator (nessa ordem) depois bombear o volume pré-planejada de solução de alginato. Repita esse procedimento para lotes posteriores de fabricação microbead. Após a conclusão, vire def a bomba de seringa em primeiro lugar, seguido pelo encapsulador. </li><li> Armazenar as microesferas em 20 ml de solução de cloreto de 0,2 M de estrôncio a 4 ° C durante a noite para completar a ligação transversal e estabilizar o gel. </li></ol> 3. Tamanho Medição de microesferas de alginato <ol><li> Recolha 0,5 ml de microesferas de alginato com uma pipeta de plástico e coloque-o sobre uma lâmina de vidro. Ver as microesferas sob um microscópio óptico com aumento de 10x. Tome dez imagens das microesferas com um microscópio de câmara CCD. Guardar as imagens com barra de escala (500 mm) em formato TIFF com resolução de 2.048 x 1.536. </li><li> Usando as ferramentas de comprimento em ImageJ, medir o tamanho das microesferas e barra de escala (Figura 2). Converter o comprimento a partir de microesferas de pixel para micrómetro. <ol><li> Clique nas ferramentas de linha e desenhar uma linha através do meio do cordão de alginato. </li><li> Clique em &quot;Analisar&quot; na barra de menu e selecione &quot;Measure&quot;. Uma janela pop-up irá aparecer. </li><li&gt; Repita os passos 3.2.1-3.2.2 para medir todas as esferas de alginato dentro da imagem. Medir a barra de escala na imagem. </li><li> Converter o diâmetro do cordão de alginato com o comprimento real por meio da seguinte fórmula: comprimento de drageia de alginato / comprimento da barra de escala x 500 mm. Por exemplo, 1.420 (diâmetro medido pelo ImageJ) / 2.657 (comprimento da barra de escala medido pelo ImageJ) * 500 mm = 267 mm. </li></ol></li><li> Considere o tamanho médio das microesferas de 100 (média ± desvio padrão) medida que o tamanho representativas de cada lote de microesferas. </li></ol> 4. Esterilização <ol><li> Recolher as microesferas utilizando uma peneira de nylon de 100 um e lava-se as pérolas com água destilada duas vezes. </li><li> Com uma espátula, transferir todas as microesferas feitas a partir de 0,1 ml de solução de alginato para um tubo de microcentrifugação de 2 ml e cobrir com gaze para evitar a secagem. </li><li> Finalmente, esterilizar as microesferas por autoclavagem usando o modo de líquido (115 ° C, 15 min) ou em conformidade com mespecificações do ABRICANTE. Adicionar 1,5 L de água destilada para a câmara para impedir os grânulos de secagem. </li></ol> 5. Revestimento de protamina e heparina <ol><li> No interior do capuz NB-2, incubar as micropérolas estéreis, com 1 ml de 2 mg / ml de solução de protamina (esterilizada utilizando um filtro de seringa de 0,2 uM) durante 1 h à temperatura ambiente. </li><li> Após incubação das microesferas durante 1 h (Passo 5.1), recolher 150 uL da solução de protamina para o teste de micro ácido bicinconínico (MicroBCA) (ver secção 6). </li><li> Lavam-se as microesferas de protamina revestidos duas vezes com água duplamente destilada. Girar para baixo usando uma centrífuga de bancada superior a 200 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação, aspirar a água através de uma seringa. </li><li> Incubar protamina micropérolas revestido com 1 ml de 0,5 mg / ml de solução de heparina (esterilizada utilizando um filtro de seringa de 0,2 uM) durante 30 minutos para criar complexo polielectrólito (PEC). </li><li> Após incubação a protamina revestidas microesferas fou 30 min (Passo 5.4), recolher 400 ml da solução de heparina para determinar o teor de heparina (secção 7). </li><li> Após a incubação, lavar a heparina não ligada de PECs por lavagem duas vezes com água duplamente destilada. </li></ol> Conteúdo 6. protamina <ol><li> Realizar o teste MicroBCA de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, adicionar 150 ul de solução de protamina (recolhido antes e após a incubação com microesferas) numa placa de 96 poços. Adicionar 150 uL de solução de trabalho MicroBCA. </li><li> Use solução de albumina (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 e 200 ug / ml) como padrões de calibração. </li><li> Incubar a mistura durante 60 min a 60 ° C. Medir a absorvância com um espectrofotómetro a 562 nm. </li><li> Utilizar a curva padrão para determinar a concentração de protamina de cada amostra desconhecida de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Determinar o teor de protamina das microesferas, subtraindo a quantidade total de protamina nasolução de revestimento (antes da incubação com microesferas) a partir da quantidade de protamina restante na solução de revestimento (após incubação com microesferas). </li></ol> 7. A heparina conteúdo <ol><li> Preparar 10 ml de solução de trabalho por dissolução de 4 mg de azul de toluidina e 20 mg de cloreto de sódio em ácido clorídrico 0,01 N. </li><li> Adicionar 400 ul de amostra (a partir do passo 5.5) para a solução de trabalho a uma razão de 2: 3 e vortex durante 30 seg. </li><li> Adicionar 600 ul de n-hexano (volume equivalente à solução do reagente de trabalho) e agitar com vortex a mistura para extrair o complexo heparina azul de toluidina. </li><li> Aspirar 200 ul da fase aquosa através de uma seringa após a separação de fases. </li><li> Medir a quantidade de azul de toluidina extraiu-un contido na fase aquosa utilizando um espectrofotómetro a 631 nm. </li><li> Prepare soluções padrão de heparina de 0-20 ug / ml. </li><li> Traçar a leitura 631 nm de cada padrão de heparina versus concentração de heparina em mg / meu. Utilizar a curva padrão para determinar a concentração de heparina de cada amostra. </li></ol> 8. confocal Imagem de estrutura de camada por camada <ol><li> Fabricar protamina, heparina e NELL-1 / BMP-2 analógico fluorescente CF-405 protamina (azul), CF 594 heparina (vermelho) e FITC NELL-1 / FITC (verde) BMP-2 + heparina + protamina acordo com o fabricante do folha de dados técnicos. </li><li> Revestimento 100 ug micropérolas com 300 ul de análogo fluorescente (método de revestimento tal como descrito no 5,3-5,6) CF-405 protamina (azul) (2 mg / mL, incubação de 1 hora), CF 594 heparina (vermelho) (0,5 mg / ml, 30 min) e marcado com FITC NELL-1 / marcado com FITC (verde) BMP-2 (1,5 mg / ml, durante a noite). Lavam-se as microesferas por duas vezes com água destilada para eliminar a não ligado fluorescente protamina, heparina e NELL-1 / BMP-2. </li><li> Observar a estrutura camada-por-camada (Figura 3) usando um microscópio confocal de ampliação 10X. 7 </li></ol> 9. BMP-2e NELL-1 Captação e Lançamento <ol><li> Carregar 13,3 ul de 1,5 mg / ml de solução de BMP-2 ou NELL-1 em 100 g de PEC. Incubar PEC a 4 ° C sob agitação durante 30 rpm 10 h. </li><li> Mergulhar as microesferas em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) a 37 ° C com agitação constante (30 rpm). </li><li> Recolha de 1 ml do sobrenadante e substitui-la com 1 ml de PBS, depois 1, 3, 6, 10 e 14 dias. </li><li> Avaliar a absorção e libertação eficiência de BMP-2, utilizando o método de ELISA de acordo com o protocolo do fabricante. Avaliar a absorção e libertação de eficiência NELL-1 usando o método de ensaio de proteína carboxibenzoílo quinolina-2-carboxaldeído (CBQCA) de acordo com o protocolo do fabricante. </li><li> Determinar a libertação cumulativa no momento (t): libertação cumulativa no momento (t) = Lançamento no momento (t) + versão anterior no momento (t-1). </li><li> Traçar libertação cumulativa de BMP-2 e NELL-1 contra o tempo. </li></ol> 10. in vitro A bioactividadede NELL-1 Nota: A bioactividade de NELL-1 libertado da PEC foi avaliada medindo a sua capacidade para aumentar a expressão de fosfatase alcalina (ALP) nas células estaminais de medula óssea de coelho (rBMSC). <ol><li> Semente 20000 rBMSCs por poço numa placa de 24 poços, permitindo-lhes crescer durante um dia com 1 ml de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C e CO2 a 5%. </li><li> Após 24 h, substituir o meio com 1 ml de um meio osteogénico (DMEM suplementado com 10% de FBS, 2% de penicilina estreptomicina, / ml de ácido ascórbico a 50 ^ g, 10 mmol / L de beta-glicerofosfato, e 10 -8 mol / L dexametasona ) durante 7 dias a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Coloque 300 ug PEC-NELL-1 (a partir do passo 8.2) e PEC dentro inserções de cultura de células (inserção TC) para manter os PEC em separado a partir das células (isto evita a lavagem de micropérolas PEC durante a mudança de meio osteogénico). Lugar TC inserir no 24 bem plcomeu por 14 dias. </li><li> Uma vez a cada três dias, aspirado 1 ml de meio osteogênico, colocando uma agulha fora da inserção TC, e substituir com 1 ml de meio osteogênico fresco. </li><li> Após 7 e 14 dias de incubação, determinar a actividade de ALP com um kit de ensaio de ALP em conformidade com o protocolo do fabricante do kit. <ol><li> Lisar as células com tampão de ensaio contendo 0,1% de Triton X-100 a 4 ° C durante 10 min. Raspar células aderidas usando um raspador de células. Incubar suspensão de células a 4 ° C sob agitação durante pelo menos 60 min. </li><li> Centrifugar a suspensão de células a 2500 x g a 4 ° C durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante para o ensaio de ALP. </li><li> Adicionar 50 uL de solução padrão de fosfatase alcalina diluída em série 200-0 ng / ml para os poços de uma placa de 96 poços. Os valores finais do padrão de fosfatase alcalina são 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 e 0 ng / poço. </li><li> Adicionar o sobrenadante do passo 10.5.2 (50 uL / ​​poço) e dilui-se com diluição bpode ser prejudicado. </li><li> Adicionar 50 ul de solução de fosfato (pNPP) substrato de p-nitrofenilo em cada poço. Misturar os reagentes agitando cuidadosamente a placa durante 30 segundos. Incubar a mistura durante 30 min no escuro. Medir a absorvância a 405 nm pelo leitor de placas. </li><li> Calcular a actividade de ALP usando a curva de calibração. </li></ol></li><li> Determinar o teor de proteína utilizando o kit de ensaio de proteínas MicroBCA de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar a actividade ALP dividindo a actividade de ALP em teor proteico. </li></ol> Viabilidade 11. celular <ol><li> Incubar 200 mg de PEC-NELL-1 com 1 ml de DMEM + 10% FBS a 37 ° C durante 24 h para a 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) ensaio. </li><li> Semente rBMSCs 2.000 por cavidade (em 100 ul de DMEM com FBS a 10%) numa placa de 96 poços e incuba-se durante 1 dia a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Substituir DMEM + FBS a 10% com 100 ul de extracto de PEC-NELL-1 / PEC e incubara 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Após 1 dia ou 3 dias de incubação, adicionar 10 uL de 5 mg de solução de MTT / ml e ainda mais incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 4 h na escuridão. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de DMSO a cada poço para dissolver cristais de formazano. </li><li> Determinar a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de microplacas. </li><li> Calcula-se a taxa de crescimento relativa: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" /></li></ol> 12. Embalagem para Andaime e BMP-2 &amp; NELL-1 Carregando <ol><li> Embalar os PEC para dentro dos poros de um Policaprolactona de grau médico bioreabsorvï¿½el - fosfato de tri-cálcio (mPCL-TCP) andaime utilizando uma espátula esterilizada dentro de uma câmara de NBS-2. </li><li> Adicionar 1,5 mg / ml, solução de BMP-2 ou NELL-1 para o andaime mPCL-TCP embalado com PEC e incubar durante a noite a 4 ° C. </li></ol>

<ol><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NELL-1+based+demineralized+bone+graft+promotes+rat+spine+fusion+as+compared+to+commercially+available+BMP-2+product%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product.</a> Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).</li>
<li>Anderson, C. L., Whitaker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+associated+with+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+%28infuse%29+in+posterolateral+lumbar+spine+fusion%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report.</a> Spine. 37, 502-506 (2012).</li>
<li>Glassman, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBMP-2+versus+iliac+crest+bone+graft+for+lumbar+spine+fusion%3A+a+randomized%2C+controlled+trial+in+patients+over+sixty+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age.</a> Spine. 33, 2843-2849 (2008).</li>
<li>Tannoury, C. A., An, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+with+the+use+of+bone+morphogenetic+protein+2+%28BMP-2%29+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery.</a> Spine J. 14, 552-559 (2014).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+performance+of+a+polycaprolactone-based+scaffold+used+as+fusion+cage+device+in+a+large+animal+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery.</a> Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).</li>
<li>Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioactivity+of+rhBMP-2+delivered+with+novel+polyelectrolyte+complexation+shells+assembled+on+an+alginate+microbead+core+template%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template.</a> J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+Complex+Carrier+Enhances+Therapeutic+Efficiency+and+Safety+Profile+of+Bone+Morphogenetic+Protein-2+in+Porcine+Lumbar+Interbody+Fusion+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model.</a> Spine. 40, 964-973 (2015).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+rhBMP-2+into+self-assembled+polyelectrolyte+complexes+promotes+anatomic+localization+of+new+bone+in+a+porcine+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery.</a> Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Protamine-Based+Polyelectrolyte+Carrier+Enhances+Low-Dose+rhBMP-2+in+Posterolateral+Spinal+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion.</a> Spine. 40, 613-621 (2015).</li>
<li>Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tricalcium+phosphate+particles+as+a+controlled+release+carrier+of+osteogenic+proteins+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).</li>
<li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

Nós não temos nenhum conflito de interesses.

Este protocolo apresenta um método para a preparação de CPE através de camada-por-camada de auto-montagem. A estrutura de camada-por-camada é visualizada utilizando análogos fluorescentes de protamina, heparina, BMP-2 e NELL-1 e microscopia confocal. Captação e testes de libertação mostram que heparinas de PEC medeia a captação fator de crescimento osteogénico e solte. A eficiência de absorção do método de PEC é: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. O transportador PEC tem uma melhor modulação da libertação NELL-1 (...

A incidência de pseudoartrose tem sido relatada como sendo tão elevado como 10 a 45% em fusão espinal degenerativa e revisão cirurgias espinhais 1. Para reduzir a taxa de pseudoartrose durante a fusão da coluna e outras cirurgias reconstrutivas ósseas, factores de crescimento osteogénico, tais como BMP-2, Nell-1 e um factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) foram introduzidos para promover a osteogénese de novo. Entre estes, BMP-2 é uma escolha popular para a fusão espinhal 2. Embora a potência de BMP-2 na indução e facilitando a formação de osso novo foi bem estabelecido 3; complicações clinicamente significativos, tais como a formação heterotópica de osso, seroma e formação de hematoma, resposta inflamatória, radiculite, osteólise corpo vertebral, e ejaculação retrógrada continuam a ser questões de preocupação devido às quantidades suprafisiológicas utilizados 4,5. Por isso, diminuindo a dose de PMO-2 continua a ser uma estratégia relevante em pelotenta a minimizar os efeitos colaterais. Além disso, sistemas de veículo eficazes são necessários para suprimir a libertação brusca inicial de BMP-2 observado em sistemas veiculares de esponja de colagénio contemporânea e aumentar ainda mais a entrega prolongada e localizada desta citoquina potente. A auto-montagem da camada-por-camada da alternância polielectrólitos catiónicos e aniónicos podem ser utilizados como um método sintonizável para construir-se complexos de polielectrólitos na superfície de matrizes de andaime ou materiais implantáveis ​​6. A este respeito, a heparina (conhecida por ter a maior densidade de carga negativa de todos os agentes biológicos) tem sido reconhecido que se ligam avidamente com uma variedade de factores de crescimento através de domínios de ligação a heparina e electrostáticas. Com efeito, a heparina tem sido mostrada a prolongar a meia-vida e assim potenciar a bioactividade de vários factores de crescimento. Com base nisso, o nosso grupo de um protocolo adaptado de auto-montagem da camada-por-camada para o fabrico de um complexo à base de polielectrólito heparina (PEC) que<html> cargas e preserva as bioatividades de fatores de crescimento osteogénico durante a imobilização 7,8. O núcleo microesferas de alginato foi fabricado por reticulação de resíduos de alginato com catiões divalentes de cálcio ou estrôncio α-L-guluronato (L). O núcleo é uma matriz de alginato biodegradável andaime; que depois da implantação, é reabsorvido no leito de fusão proporcionando espaço para crescimento ósseo. A poli-L-lisina (PLL) ou protamina é utilizada como a camada de catiónico para entrelaçar com tanto a matriz de andaime (neste caso, o núcleo de alginato transportador micropérola) e a heparina carregada negativamente; enquanto que as funções da camada de heparina aniónico para estabilizar e localizar factores de crescimento carregados. A camada tripla PEC foi mostrada para aumentar a capacidade de carga do factor de crescimento num modelo suíno 9. Recentemente, os transportadores de PEC tenham sido demonstrado com sucesso para reduzir a dose eficaz de BMP-2 em pelo menos 20 vezes em ratos 10 e modelos de suíno de fusão vertebral 8. ntent &quot;&gt; Aqui, nós relatamos os métodos de PECs de fabricação para a entrega do fator de crescimento reforçada em fusão espinhal e as outras cirurgias ósseas de reconstrução utilizando BMP-2 como um factor de crescimento osteogénico modelo.

<table><tbody><tr><td>Ciências da Vida Acrodisc 25&nbsp; mm Filtro de Seringa com 0.2&nbsp; &micro; m Supor Membrana</td><td>PALL&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>Solução estéril de protamina, heparina por ultrafiltração</td></tr> placa <tr><td>de 24 poços</td><td>Cell Star&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços Nuclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazólio Brometo), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>Meça a citotoxicidade de PEC-NELL-1</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Precipitado CF-405 Protamina marcada</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>Meça a citotoxicidade do kit de</td></tr><tr><td>ensaio de ensaio de fosfatase alcalina (ALP)</td> PEC-BMP-2 <td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>Reagente de parada na rotulagem FITC</td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido anidro (DMSO)</td> <td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Solvente para isotiocianato fluorescente I</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido ( DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Dissolve&nbsp; formazan&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>Esterilize grânulos de alginato a vapor</td></tr><tr><td>Beta-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (Kit de Enxerto Ósseo Infundido Grande II)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, EUA</td><td>7510800</td><td>Fator de Crescimento Osteogênico, a diálise é necessária para remover o componente estabilizador que interfere no acoplamento FITC</td></tr><tr><td>Carboxibenzoil quinolina-2-Carboxaldeído (CBQCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>Para quantificar a proteína NELL-1</td></tr><tr><td>Cell Strainer (100&nbsp; &micro; m)</td><td>BD Science</td><td>352360</td><td>Hold PEC para ALP assay</td></tr><tr><td>Cell Scraper 290&nbsp; mm Largura da lâmina 20&nbsp; mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>Separe a célula da placa de 24 poços</td></tr><tr><td>CF 405S, éster succinimidil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>Corante fluorescente azul para marcação de protamina</td></tr><tr><td>CF 594, Hidrazida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>Corante fluorescente vermelho escuro para marcação de heparina</td></tr><tr><td>Centrífuga</td> Microscópio confocal <td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Componente do meio de crescimento osteogênico</td></tr><tr><td>Dextran Colunas de Dessalinização</td><td>Pierce (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D System</td><td>DBP200</td><td>Determine a liberação de BMP-2</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino FBS</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Fluoesceína Isotiocianato, Isômero I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>Corante fluorescente verde para rotulagem NELL-1 e BMP-2</td></tr><tr><td>Inserções de Cultura de Células ThinCert, Para placas de 24 Poços,</td><td>Greiner&nbsp;</td> Estéril;<td>662630</td><td>Previne a lavagem do PEC ao trocar o meio osteogênico</td></tr><tr><td>Bomba de seringa Havard Appartus (11 plus)</td> <td>Aparelho Havard</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-hexano (>99%)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Liga-se ao fator de crescimento osteogênico com domínio de ligação à heparina</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (37%)</td> <td>Merck</td><td>100317</td><td>Pasta de</td></tr><tr><td>incubadora</td><td></td> altamente corrosiva <td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína MicroBCA</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>para ensaios ALP e microBCA</td></tr><tr><td>Encapsulador de células Nisco</td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>Unidade de encapsulamento VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Olympus</td><td>Andaime IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP (Tamanho do poro é 1.3&nbsp; mm)</td> <td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>Hold PEC para estudo in vivo</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina 10.000 unidade/ml, 100&nbsp; ml</td><td>Hyclone Cell Culture</td><td>SV30010</td><td>Antibiótico</td></tr><tr><td>10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x,</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina de grau ultrapuro MW 15.000-30.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td>Polication</td></tr><tr><td>Protamine Sulfato sal, de Salmão</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Polycation</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Diálise de Pele de Cobra 3.500 MWCO 22&nbsp; mm x 35 pés</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>Remova o FITC não reagido por diálise</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>US Biological</td><td>S4000</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Carbonato de Sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>Buffer</td></tr><tr><td>Cloreto de Estrôncio Reticulador hexa-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255521</td><td>para espátula de alginato</td></tr><tr><td></td><td>3dia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringa de 5 ml</td><td>Terumo</td><td>140425R</td><td>O diâmetro da seringa afeta a taxa de fluxo</td></tr><tr><td>75 cm2 Frasco de cultura de células Pescoço inclinado</td><td>Corning</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>Toluidina Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52040</td><td>Ensaio</td></tr> <tr>de heparinaCultura de células de <td>tripsina 1x</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Alginato de sódio</td><td>Novamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>Material do núcleo de microesferas</td></tr></tbody></table>

complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica factor de crescimento domínio

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Durante cirurgias ósseas reconstrutivas, quantidades suprafisiológicas de fatores de crescimento são empiricamente carregado em andaimes para promover a fusão óssea bem sucedido. Grandes doses de agentes biológicos muito potentes são necessários devido ao factor de instabilidade do crescimento, como resultado da degradação enzimática rápida, bem como as ineficiências transportadora na localização de uma quantidade suficiente de factor de crescimento em locais de implante. Assim, estratégias que prolongam a estabilidade de factores de crescimento, tais como BMP-2 / NELL-1, e controlar a sua libertação pode realmente diminuir a dose eficaz e, assim, reduzir a necessidade de doses mais elevadas durante as futuras cirurgias de regeneração óssea. Isto por sua vez irá reduzir os efeitos secundários e os custos de factores de crescimento. PEC auto-montadas têm sido fabricados para proporcionar um melhor controlo de PMO-2 / NELL-1 entrega através de ligação à heparina e outro factor de crescimento bioactividade potenciam reforço, em estabilidade in vivo. Aqui, ilustramos a simplicidade de fabricação PEC que auxilia na DELIVERY de uma variedade de factores de crescimento durante cirurgias reconstrutivas ósseas.

No nosso transportador, protamina foi escolhido como substituto de poli-L-lisina, uma vez que tem propriedades químicas semelhantes e é aprovado pela FDA como um antídoto de heparina. resultados da microscopia óptica mostrou que as microesferas não-irradiados foram de forma esférica com um diâmetro de 267 ± 14 pM. (0,35 mm de bocal, taxa de fluxo de 5 ml / h e 5,8 kV). A maioria das micropérolas são irradiados de forma de lágrima. O diâmetro medido na parte turno das microesferas irradia...

Complexos polieletrolíticos automontados (PEC) fabricados a partir de heparina e protamina foram depositados em grânulos de alginato para aprisionar e regular a liberação de fatores de crescimento osteogênicos. Essa estratégia de entrega permite uma redução de 20 vezes da dose de BMP-2 em aplicações de fusão espinhal. Este artigo ilustra os benefícios e a fabricação de PECs.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar uma camada de complexação por polieletrólitos. Um transportador que pode aprisionar e regular a liberação de uma ampla gama de fatores de crescimento com domínio de ligação à heparina. Este método pode responder a questões fundamentais na área de engenharia de tecidos ortopédicos, para o aprisionamento e entrega eficientes de fatores de crescimento específicos.As principais vantagens desta técnica são que ela não requer o uso de substâncias orgânicas com frequência, o que é sabido afetar as atividades biológicas dos fatores de crescimento. Dissolva 200 miligramas de alginato de sódio não irradiado ou 400 miligramas de alginato de sódio irradiado com oito megarads em 10 mililitros de água bidestilada.Agite durante uma hora. Armazene a solução de alginato a quatro graus Celsius durante a noite. Filtre a solução de alginato com um filtro de seringa estéril de 0,2 mícron antes da fabricação de microesferas de alginato.Desinfete o gerador eletrostático de BE e a bomba de seringa com etanol 70% e coloque-os dentro de uma cabine de segurança biológica classe dois. Em seguida, coloque uma bacia de vidro com um bastão magnético dentro do gerador de BE. Posicione o eletrodo do braço do gerador de BE a nove centímetros acima da bacia.Conecte o cabo do eletrodo do gerador BE ao parafuso neurológico dois do eletrodo do braço. E despeje 80 mililitros de solução de cloreto de estrôncio na bacia. Em seguida, carregue cinco mililitros de solução de alginato filtrada em 0,2 mícron na seringa do tubo de borracha.Após conectar o tubo de borracha ao eletrodo do braço, ligue a bomba de seringa em cinco mililitros por hora. Durante dois minutos. Para expelir o ar no interior da tubulação e conduzir a solução de alginato até a ponta do bico.Em seguida, desligue a bomba de seringa. Para iniciar a geração de microesferas, ajuste o encapsulador em 5,8 quilovolts. Em seguida, ligue a bomba de seringa com uma taxa de fluxo de alginato de cinco mililitros por hora.Descarte as microesferas geradas durante os primeiros dois minutos, pois essas microesferas tendem a ter tamanho e forma irregulares. Colete as microesferas subsequentes na solução de cloreto de estrôncio 0,2 molar. Desligue a bomba de seringa seguida pelo encapsulador.Após bombear o volume previamente planejado da solução de alginato, repita este procedimento para os lotes subsequentes de fabricação de microesferas. Armazene as microesferas em 20 mililitros de solução de cloreto de estrôncio 0,2 molar a quatro graus Celsius durante a noite para completar a reticulação e estabilizar o gel.Colete 0,5 mililitros de microcápsulas de alginato com uma pipeta plástica e coloque-as sobre uma lâmina de vidro. Observe as microcápsulas em um microscópio óptico com aumento de 10x.Obtenha 10 imagens dos microesferas com uma câmera CCD de microscópio. Salve as imagens com uma barra de escala de 500 mícrons em formato TIFF com resolução de 2048 por 1536. Utilizando as ferramentas de comprimento do ImageJ, meça o tamanho das microesferas.E a escala. Em seguida, converta o comprimento da microesfera de pixels para micrômetros. Clique nas ferramentas de linha e desenhe uma linha através do centro da esfera de alginato.Clique em analisar na barra de menu e selecione medir. Uma janela pop-up será exibida. Repita esses passos para medir todas as microesferas de alginato dentro da imagem.Meça a barra de escala na imagem. Colete as microesferas utilizando o filtro de náilon de 100 mícrons. E lave as esferas com água destilada duplamente.Usando uma espátula, transfira todas as microesferas produzidas a partir de 0,1 mililitro da solução de alginato para um tubo microcentrífugo de dois mililitros e cubra com gaze para evitar secagem. Por fim, esterilize as microesferas por autoclavagem, utilizando o modo líquido ou conforme as especificações do fabricante. Adicione 1,5 litro de água destilada à câmara para impedir que as esferas sequem.Dentro da capela BSL2, incubar as microesferas estéreis com um mililitro de solução esterilizada de protamina a dois miligramas por mililitro durante uma hora à temperatura ambiente. Lavar as microesferas recobertas com protamina duas vezes com água bidestilada. Em seguida, centrifugar utilizando uma centrífuga de bancada a 200 × g durante três minutos à temperatura ambiente.Após a centrifugação, aspire a água utilizando uma seringa. Incube microesferas revestidas com protamina com um mililitro de solução esterilizada de heparina a 0,5 miligramas por mililitro durante 30 minutos. Isso cria uma camada de complexação por polieletrólito com alta afinidade para fatores de crescimento que se ligam à heparina.Após a incubação, aspire a heparina utilizando uma seringa. E lave a heparina não ligada dos complexos polieletrolíticos lavando duas vezes com água bidestilada. Adicione 13,3 microlitros de uma solução de proteína morfogenética óssea 2 ou molécula semelhante à NELL-1 a 1,5 miligrama por mililitro em 100 microgramas do complexo polieletrolítico.Incube o complexo de polieletrólito a quatro graus Celsius sob 30 RPM, agitando por 10 horas. Em seguida, imerja as microesferas em um mililitro de solução salina tamponada com fosfato, ou PBS, a 37 graus Celsius com agitação constante. Colete um mililitro do sobrenadante e substitua por um mililitro de PBS após um, três, seis, 10 e 14 dias.Avalie a eficiência de captação e liberação da molécula semelhante à NELL um utilizando o método de ensaio proteico CBQCA de acordo com o protocolo do fabricante. Alternativamente, realize ELISA. A bioatividade da molécula semelhante à NELL um liberada a partir do complexo polielectrolítico é avaliada mediante a medição de sua capacidade de aumentar a expressão da fosfatase alcalina em células-tronco da medula óssea de coelho.Plante 20.000 células-tronco da medula óssea de coelho por poço em uma placa de 24 poços. Deixe crescer por um dia com um mililitro de meio de Eagle modificado de Dulbecco acrescido de 10% de soro bovino fetal a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Após 24 horas, substitua o meio por um mililitro de meio osteogênico durante sete dias a 37 graus Celsius.E 5% de CO₂. Coloque 300 microgramas do complexo de polieletrólito e do complexo de polieletrólito semelhante à molécula NELL dentro de insertos para cultivo celular para manter os complexos separados das células. Coloque o inserto na placa de 24 poços para evitar a remoção dos microesferas de complexo de polieletrólito durante a troca do meio osteogênico.A cada três dias, aspire um mililitro do meio osteogênico colocando uma agulha fora do inserto e substitua por um mililitro de meio osteogênico fresco. Após sete e 14 dias de incubação, determine a atividade de fosfatase alcalina utilizando um kit de ensaio para fosfatase alcalina.De acordo com o protocolo do fabricante do kit. Embale os complexos de polieletrólitos nos poros de uma estrutura de poli-ε-caprolactona com fosfato tricálcico de grau médico bioabsorvível. Utilizando uma espátula esterilizada dentro de uma câmara BSL2.Adicione uma solução de 1,5 miligrama ou mililitro de proteína morfogenética óssea dois ou molécula semelhante a NELL um ao suporte carregado com complexo de polieletrólito. Incube durante a noite a 4 graus Celsius. Microesferas de alginato são inspecionadas ao microscópio para monitorar seu tamanho e morfologia.As microcápsulas de alginato não irradiadas são esféricas, enquanto suas contrapartes irradiadas têm formato de lágrima. A distribuição de tamanho é um fator importante na captação de fatores de crescimento. E a redução do tamanho aumenta a relação superfície por área.Ao medir microesferas de alginato com o software ImageJ, uma média de 100 microesferas fornece uma boa estimativa da distribuição de tamanho em cada lote de microesferas. Como a captação do fator de crescimento depende da técnica adequada de revestimento, a espessura de cada camada é observada por microscopia confocal. Aqui, são apresentadas imagens obtidas por microscopia confocal de varredura a laser de microesferas de alginato incubadas com análogos fluorescentes de protamina, heparina, molécula semelhante a NELL um e proteína morfogenética óssea dois.A atividade da fosfatase alcalina é utilizada para medir a bioatividade do fator de crescimento liberado. Um aumento de 2,2 vezes na atividade da fosfatase alcalina foi observado após incubação com o complexo de polieletrólito NELL como molécula um no dia 14. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até cinco horas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que as concentrações de alginato afetam a estabilidade dos microgrânulos. Para alginatos irradiados, foi necessário quatro por cento. Para os não irradiados, foi necessário dois por cento.Após seguir estes procedimentos, podemos aumentar ainda mais a carga de fatores de crescimento por meio de revestimento em múltiplas camadas. Esta técnica permite que pesquisadores na área de engenharia de tecidos explorem a liberação de fatores de crescimento em outros modelos de doenças. Após assistir a este vídeo, você será capaz de fabricar um complexo de policatiônicos com distribuição estreita de tamanho.

polyelectrolyte-complex-for-heparin-binding-domain-osteogenic-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nas seções seguintes, que definirá procedimentos para a preparação de microesferas de alginato para uso em aplicações biomédicas. Nós especificamente ilustram uma técnica para a criação de várias camadas de alginato microesferas para a dupla finalidade de célula e de encapsulamento proteína como um tratamento potencial para a diabetes tipo 1.

Geração de alginato Microesferas para aplicações biomédicas

Descreve-se um método para realizar a imobilização eficiente de BMP-2 em superfícies. A nossa abordagem é baseada na formação de uma monocamada auto-montada para alcançar a ligação da BMP-2 por meio dos seus resíduos de amina livres covalente. Este método é uma ferramenta útil para o estudo de sinalização na membrana celular.

A ligação covalente de BMP-2 em superfícies com uma monocamada auto-montada Abordagem

Este protocolo combina eletrofiação e microesferas para desenvolver andaimes de engenharia de tecidos para direcionar os neurônios. O fator de crescimento nervoso foi encapsulado em microesferas de PLGA e eletrofiado em arcabouços fibrosos de ácido hialurônico (HA).  A bioatividade da proteína foi testada semeando os scaffolds com gânglios primários da raiz dorsal do pintinho e cultivando por 4-6 dias.

Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

Um processo genérico passo a passo para criar um modelo semelhante a um osso com microcanais projetados é apresentado. As altas capacidades de absorção e retenção do molde são demonstradas pela ação capilar por meio de microcanais.

Modelos distintivo ação capilar por micro-canais em Osso-como pode aumentar o recrutamento de células para a Restauração da Grande Bony Defeito

Os andaimes para engenharia de tecidos precisam recapitular o complexo microambiente bioquímico e biofísico do nicho celular. Aqui, mostramos o uso de fibras de complexação de polieletrólitos interfaciais como uma plataforma para criar andaimes poliméricos compostos e multicomponentes com liberação bioquímica sustentada.

Andaimes de mistura de fibras Interfacial polieletrólito para lançamento Temporalmente controlada de biomoléculas

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer células epiteliais tímicas (TECs) com gradiente de densidade para isolamento de FACS. Também mostra o uso de peptídeos EAK16-II/EAKIIH6 para promover a formação de agregados TEC. Os microambientes do hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 fornecem a configuração 3-D necessária para manter a sobrevivência e a função dos TECs.

Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.

Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo

Biomateriais dopados com 2 de Proteína morfogenética óssea (BMP2) utilizaram-se como uma nova estratégia terapêutica para curar fraturas não-união óssea. Para superar os efeitos secundários resultantes de uma incontrolável liberação do fator, propomos uma nova estratégia para o site-imobilizar diretamente o fator, criando assim materiais com capacidade osteogênica melhorada.

Imobilização local-dirigido da Proteína morfogenética óssea 2 para superfícies sólidas pela química do clique

Um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea é estabelecido pela semeadura de células mesenquimais e endoteliais em hidrogéis pré-moldados de PEG 3D. As redes endoteliais, os componentes da MEC e a atividade da FA dos nichos variam dependendo do fator de crescimento utilizado. A plataforma pode ser usada para modelos avançados de câncer.

Estabelecimento simples de um nicho osteogênico vascularizado da medula óssea usando hidrogéis pré-moldados de poli(etilenoglicol) (PEG) em uma microplaca de imagem

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Este protocolo detalha a síntese, encapsulamento da hemoglobina e PEGilação superficial de nanopartículas hierarquicamente porosas de UiO-66, projetadas para entrega de oxigênio. O procedimento combina engenharia de defeitos com conjugação biortogonal promovida por tensão para gerar portadores altamente permeáveis e fisiologicamente estáveis, adequados para aplicações biomédicas.

Síntese, encapsulamento de hemoglobina e PEGilação biortogonal em nanopartículas hierárquicas porosas de UiO-66 para aplicações de entrega de oxigênio

Aprenda a fabricar complexos polieletrolíticos com heparina e protamina para liberação controlada de fatores de crescimento osteogênicos. Este método reduz 20 vezes a dose de BMP-2 em aplicações de fusão espinhal.

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

Explorar mais vídeos