Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

O objetivo geral deste ensaio é determinar os efeitos dos tratamentos de interesse na adesão celular sob condições de tensão de cisalhamento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da sinalização de células imunes, como quais fatores medeiam a ativação da integrina. A principal vantagem desta técnica é que pares de integrinas de moléculas de adesão única podem ser estudados em um sistema de fluxo facilmente replicado.

Embora este método possa fornecer informações sobre a ativação do LFA1, ele também pode ser aplicado ao estudo de outras integrinas. Geralmente, os indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a configuração técnica deve ser executada com precisão. Para colher as células CHO-ICAM, trate a cultura com 0,5% de tripsina EDTA por um minuto em temperatura ambiente com agitação suave.

Quando as células começarem a se desprender, neutralize a tripsina com quatro mililitros de meio fresco e conte o número de células dissociadas. Dilua as células a uma concentração de 0,75 vezes 10 elevado à quinta célula por câmara e gire-as em uma centrífuga. Em seguida, ressuspenda o pellet em 30 microlitros por câmara de fluxo, em meio de cultura CHO-ICAM completo, e semeie lentamente alíquotas de 30 microlitros de células por reservatório da câmara de fluxo.

Instale as células em uma incubadora de 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura completo em ambos os reservatórios de cada câmara e retorne a placa à incubadora para cultura durante a noite. Após a colheita das células T, conte e dilua a suspensão celular para uma concentração de duas vezes 10 elevado a sexta células por câmara.

Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em um mililitro de PBS, suplementado com 1% de glicose por duas vezes dez elevado à sexta célula T. Em seguida, rotule as células T em uma diluição de 1 a 1000 de CFSE protegidas da luz por oito minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em 240 microlitros de meio RPMI sem soro por câmara.

Em seguida, divida as células em um tubo de 1,5 mililitro por cada câmara e armazene os tubos em um bloco de calor de 37 graus Celsius até o carregamento. Antes de fazer a imagem, aqueça a câmara de imagem ao vivo do microscópio a 37 graus Celsius e encha uma garrafa de vidro de 500 mililitros com água. Faça dois orifícios na tampa rotulada para dentro e para fora e passe a mangueira de entrada de conexão da seringa pelo orifício de entrada e a mangueira de conexão do reservatório de entrada pelo orifício de saída.

Use uma seringa de 60 mililitros para lavar a mangueira de entrada com 60 mililitros de água, seguida de 60 mililitros de meio sem soro a 37 graus Celsius para remover qualquer ar do sistema. Quando a mangueira estiver preparada, transfira toda a configuração de entrada para a câmara de imagem ao vivo do microscópio para manter o sistema a 37 graus Celsius. Passe a mangueira e a seringa para fora da câmara e coloque a seringa na bomba da seringa.

Em seguida, faça um furo na tampa de uma garrafa de 250 mililitros para servir como recipiente de resíduos de saída e passe o tubo de saída pelo orifício para dentro da garrafa. Em seguida, prenda frouxamente a tampa do frasco de saída e coloque toda a configuração de saída na câmara de imagem ao vivo. Agora coloque a lâmina da câmara de fluxo no microscópio stage e use a objetiva 20X para definir o plano focal na camada mono CHO ICAM.

Em seguida, começando com o controle não estimulado, descarte três volumes de 70 microlitros do reservatório de saída da primeira câmara e adicione três volumes de 70 microlitros de células T marcadas com CFCS ao reservatório de entrada. Enquanto as células T estão se movendo da entrada para a saída, imagine cinco campos aleatórios de células T positivas para CFSE em cada câmara para obter as contagens de células pré-fluxo. Em seguida, conecte simultaneamente as mangueiras de entrada e saída aos reservatórios da câmara de fluxo, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar, e inicie o fluxo de tensão de cisalhamento a 0,3 mililitros por minuto, enquanto continua a visualizar as células T coradas com CFSC.

Assim que o movimento das células T for observado, inicie um cronômetro por cinco minutos, encerrando o fluxo no final do período de cinco minutos. Em seguida, imagine cinco campos de células positivas para CFSE em cada câmara, escolhendo os campos aleatoriamente para obter as contagens de células pós-fluxo. Para estimulação de PMA, estimule um tubo de células T com PMA para servir como controle positivo imediatamente antes de carregar as células T na segunda câmara de fluxo para imagem, como acabamos de demonstrar.

Para estimulação SDF-1 alfa, primeiro remova três alíquotas de 70 microlitros de meio do reservatório de saída da terceira câmara e, em seguida, adicione 70 microlitros de SDF-1 alfa no reservatório de entrada. Após cinco minutos, descarte três alíquotas de 70 microlitros do reservatório de saída e adicione o tubo restante de células T para obter imagens, como acabamos de demonstrar. Nessas imagens representativas, um número semelhante de células T é observado antes do fluxo sob as diferentes condições de estimulação.

Após cinco minutos de tensão de cisalhamento contínua, o número de células T aderentes aumenta sob as condições de estimulação alfa PMA e SDF-1, enquanto algumas células T não estimuladas permanecem aderidas. De fato, a ativação de células T alfa SDF-1, por exemplo, induz um aumento de quase duas vezes na adesão de células T, em comparação com as células de controle não estimuladas. Além disso, quando a porcentagem de adesão de células T CD3 positivas humanas primárias na presença ou ausência de SDF-1 alfa é calculada, 15% das células T não estimuladas aderem sob estresse de cisalhamento, em comparação com 50% das células T sob condições de ativação SDF-1 alfa.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser razoavelmente expandida para seis câmaras experimentais em um ensaio. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar apenas com a camada mono ICAM confluente. Seguindo este procedimento, outros métodos, como a análise da forma celular, podem ser realizados nas imagens capturadas para responder a perguntas adicionais.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a adesão celular sob condição de tensão de cisalhamento. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com seus experimentos.