Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

O objetivo geral deste ensaio é determinar os efeitos de tratamentos de interesse na adesão celular sob condições de tensão de cisalhamento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização de células imunológicas, como, por exemplo, quais fatores mediam a ativação de integrinas. A principal vantagem desta técnica é que pares de moléculas de adesão individuais, como as integrinas, podem ser estudados em um sistema de fluxo facilmente replicável.

Embora este método possa fornecer informações sobre a ativação de LFA1, ele também pode ser aplicado ao estudo de outras integrinas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a configuração técnica deve ser executada com precisão. Para colher as células CHO-ICAM, trate o cultivo com tripsina-EDTA 0,5% por um minuto à temperatura ambiente com agitação suave.

Quando as células começarem a se desprender, neutralize a tripsina com quatro mililitros de meio fresco e conte o número de células dissociadas. Dilua as células até uma concentração de 0,75 vezes 10 à quinta células por câmara e centrifugue-as. Em seguida, re-suspenda o pellet em 30 microlitros por câmara de fluxo, em meio de cultura completo CHO-ICAM, e semeie lentamente alíquotas de 30 microlitros de células por reservatório da câmara de fluxo.

Deixe as células sedimentarem em um incubador a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de cultura completo em ambos os reservatórios de cada câmara e retorne a placa ao incubador para cultura durante a noite. Após a coleta dos linfócitos T, conte e dilua a suspensão celular até uma concentração de duas vezes 10 à sexta células por câmara.

Em seguida, centrifugue as células e re-suspenda o pellet em um mililitro de PBS, suplementado com 1% de glicose por duas vezes dez à sexta potência de células T. A seguir, marque as células T em uma diluição 1:1000 de CFSE, protegido da luz, durante oito minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, centrifugue as células e re-suspenda o pellet em 240 microlitros de meio RPMI sem soro por câmara.

Em seguida, divida as células em um tubo de 1,5 mililitro para cada câmara e armazene os tubos em um bloco térmico a 37 graus Celsius até o carregamento. Antes da aquisição de imagens, aqueça a câmara de microscopia para imagens em tempo real a 37 graus Celsius e encha uma garrafa de vidro de 500 mililitros com água. Faça dois orifícios na tampa, rotulados como entrada e saída, e passe a mangueira de conexão da seringa pelo orifício de entrada e a mangueira de conexão do reservatório de entrada pelo orifício de saída.

Use uma seringa de 60 mililitros para lavar a mangueira de entrada com 60 mililitros de água, seguido por 60 mililitros de meio sem soro a 37 graus Celsius, a fim de remover qualquer ar do sistema. Quando a mangueira estiver escorvada, transfira todo o conjunto de entrada para a câmara de imagem em tempo real do microscópio para manter o sistema a 37 graus Celsius. Passe a mangueira e a seringa para fora da câmara e acople a seringa na bomba de seringa.

Em seguida, faça um orifício na tampa de um frasco de 250 mililitros para servir como recipiente de saída de resíduos e passe a tubulação de saída pelo orifício até o interior do frasco. Em seguida, fixe a tampa do frasco de saída de forma frouxa e coloque todo o conjunto de saída na câmara de imagem em tempo real. Agora, coloque a lâmina da câmara de fluxo na platina do microscópio e use a objetiva de 20X para ajustar o plano focal na monocamada de CHO ICAM.

Em seguida, iniciando pelo controle não estimulado, descarte três volumes de 70 microlitros do reservatório de saída da primeira câmara e adicione três volumes de 70 microlitros de linfócitos T marcados com CFCS ao reservatório de entrada. Enquanto os linfócitos T estiverem se deslocando da entrada para a saída, capture imagens de cinco campos aleatórios de linfócitos T positivos para CFSE em cada câmara para obter as contagens celulares pré-fluxo. A seguir, conecte simultaneamente as mangueiras de entrada e saída aos reservatórios da câmara de fluxo, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar, e inicie o fluxo com tensão de cisalhamento de 0,3 mililitros por minuto, continuando a visualizar os linfócitos T marcados com CFSC.

Assim que o movimento dos linfócitos T for observado, inicie um cronômetro de cinco minutos, encerrando o fluxo ao final do período de cinco minutos. Em seguida, obtenha imagens de cinco campos de células positivas para CFSE em cada câmara, escolhendo os campos aleatoriamente para obter as contagens celulares pós-fluxo. Para a estimulação com PMA, estime um tubo de linfócitos T com PMA para servir como controle positivo imediatamente antes de carregar os linfócitos T na segunda câmara de fluxo para a aquisição de imagens, conforme acabou de ser demonstrado.

Para a estimulação com SDF-1 alfa, remova primeiro três alíquotas de 70 microlitros de meio do reservatório de saída da terceira câmara e, em seguida, adicione 70 microlitros de SDF-1 alfa ao reservatório de entrada. Após cinco minutos, descarte três alíquotas de 70 microlitros do reservatório de saída e adicione o tubo restante de linfócitos T para imagem, conforme acabou de ser demonstrado. Nessas imagens representativas, observa-se um número semelhante de linfócitos T antes do fluxo sob as diferentes condições de estimulação.

Após cinco minutos de estresse cisalhante contínuo, o número de linfócitos T aderidos aumenta nas condições de estimulação com PMA e SDF-1 alfa, enquanto poucos linfócitos T não estimulados permanecem aderidos. De fato, a ativação dos linfócitos T por SDF-1 alfa, por exemplo, induz um aumento de quase duas vezes na adesão dos linfócitos T, em comparação com as células-controle não estimuladas. Além disso, quando é calculado o percentual de adesão de linfócitos T primários humanos CD3 positivos na presença ou ausência de SDF-1 alfa, 15% dos linfócitos T não estimulados aderem sob estresse cisalhante, em comparação com 50% dos linfócitos T nas condições de ativação por SDF-1 alfa.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser razoavelmente expandida para seis câmaras experimentais em um único ensaio. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar apenas com a monocamada confluente de ICAM. Após este procedimento, outros métodos, como a análise da forma celular, podem ser realizados nas imagens capturadas para responder perguntas adicionais.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a adesão celular sob condições de tensão de cisalhamento. Obrigado por assistir a este vídeo e boa sorte com seus experimentos.