Name: Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a quantificar a adesão de linfócitos T sob tensão de cisalhamento usando células CHO-ICAM e microscopia confocal. Este ensaio de fluxo permite estudar a ativação de integrinas como LFA1 em interações célula imune-epitélio.

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A Rheumatology Research Foundation e o Hirschil Trust apoiaram este trabalho.

1. plaqueamento das células CHO-ICAM Nota: O objectivo deste passo é a chapear as células CHO-ICAM nas câmaras de fluxo para o crescimento durante a noite com o objectivo de gerar uma monocamada confluente. <ol><li> Manter as células CHO-ICAM em 10 cm de cultura de tecidos tratados pratos de cultura de 10 ml de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM meio de cultura completo) a 37 ° C com 5% CO 2. </li><li> Para recolher as células, adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 1 min com agitação suave. Neutraliza-se a tripsina com 4 ml de meio. </li><li> Contar as células CHO-ICAM usando um hemocitômetro e calcular 0,75 x 10 5 células por câmara. Nota: Neste experimento: 2,25 x 10 5 células serão necessários para semear 3 câmaras. </li><li> Centrifugar 0,75 x 10 5 células CHO-ICAM por câmara durante 5 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente e ressuspender o sedimento celular em 30 ul por câmara de CHO-ICAM Meios de cultura completos. Nota: Neste experimento serão necessários 90 l para semear 3 câmaras. </li><li> Lentamente adicionar as células para um reservatório da câmara de fluxo. Permitir que as células que se contentar com 5 min na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 200 ul de meios de cultura completos entre os dois reservatórios de cada câmara. adições alternar entre os dois para evitar o movimento das células como o sistema equilibra. </li><li> Incubar as células durante a noite dentro de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol> 2. Preparação das células T Nota: Este ensaio pode ser feito com células T humanas primárias ou de uma linha de células T. Um protocolo de isolamento de células T do sangue foi descrita anteriormente. Se 10 utilizando células T humanas primárias utilização de células isoladas de fresco para obter os melhores resultados. Se utilizar uma linha de células T, seguir o protocolo de cultura especificado pela fonte de células. A fim de detectar as células em uma microsco fluorescentepe as células T são marcadas com éster de succinimidilo de fluoresceína carboxi (CFSE). <ol><li> Contar as células T utilizando um hemacitómetro e calcular 2 X 10 6 células por câmara. Nota: Neste experimento, serão necessários 6 x 10 6 células por 3 câmaras. </li><li> Centrífuga 2 x 10 6 células T por câmara, durante 5 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente e ressuspender as células em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) contendo 1% de glucose ou 2% de FBS. </li><li> Adicionar CFSE a 1: 1000 de diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra da luz e incubar durante 8 min a RT </li><li> Girar a 500 xg durante 5 min, temperatura ambiente. </li><li> pellet celular Ressuspender com 240 ul por condição (ver secção 4 &quot;Nota&quot;) de soro falta mídia RPMI. Nesta experiência, ressuspender o sedimento celular em 720 ul de meio RPMI simples. Dividir as células vazias em tubos de 1,5 ml rotulados para cada câmara, 240 ul por tubo. Manter as células em um bloco de calor C 37 ° até utilização. </li></ol> 3. Criação de the Input / Output Hosing e bomba de seringa <ol><li> Aquece-se a câmara de imagem ao vivo microscópio para 37 ° C. </li><li> Preparar a mangueira de entrada: <ol><li> Encha uma garrafa de vidro de 500 ml com água e fazer 2 furos na tampa. Rotular os buracos &quot;in&quot; e &quot;out&quot;. Isto irá actuar como um banho de água de aquecimento para os meios de entrada. </li><li> Executar a mangueira de entrada através dos orifícios na tampa e para dentro do banho de água. Certifique-se de que o lado da mangueira que liga à seringa vem através da &quot;em&quot; buraco eo lado que vai ligar para o reservatório de entrada vem através do &quot;fora&quot; buraco. </li><li> Lave a mangueira de entrada com 60 ml de água para remover o ar do sistema. </li><li> Primeiro a entrada de mangueira com meio RPMI sem soro aquecido a 37 ° C. Encha uma seringa de 60 ml e empurre através da mídia até que a mangueira é completamente preparado e falta quaisquer bolhas de ar. Nota: Dependendo do length de tubo utilizado o volume necessário para preparar irão variar. <ol><li> Calcular o volume dos meios de comunicação necessários para a experiência multiplicando a taxa de fluxo (aqui 0,3 ml / min) ao número de minutos (5 min), com o número de câmaras na experiência (aqui três); neste experimento, use 4,5 ml de mídia. Nota: Recomendamos que tem 5 ml volume extra (neste caso, totalizando 9,5 ml) que permanece na seringa após priming. </li></ol></li><li> Coloque toda a configuração de entrada para o recinto de imagens ao vivo do microscópio para manter 37 ° C. Execute o mangueiras e seringa para fora do gabinete e carregar a seringa na bomba de seringa. </li></ol></li><li> Preparar a mangueira de saída: <ol><li> Fazer um furo na tampa de um frasco de 250 ml para usar como resíduos de saída. </li><li> Executar o tubo de saída através do orifício e para dentro da garrafa. Vagamente fixar a tampa, não fechar todo o caminho. </li><li> Coloque a configuração de saída para dentro do gabinete imagens ao vivo da microscope. </li></ol></li><li> Calcula-se a taxa de fluxo (mL / min) necessária para gerar a tensão de cisalhamento desejada (dyn / cm 2). A tensão de cisalhamento varia em diferentes compartimentos vasculares, portanto, ter em conta o modelo global, incluindo tipos de células a serem estudados e tratamentos Ao decidir sobre um nível de tensão de cisalhamento. Nota: Estas experiências são realizadas em 0,4 dyn / cm 2 para perto imitar um cenário veia pequena. <ol><li> Tome as dimensões da câmara em conta no cálculo tensão de cisalhamento. Use a seguinte fórmula (fornecido pelo fabricante 11) para as câmaras de fluxo usados ​​aqui (Ver Tabela de Materiais): T = η * 176,1 * o onde o stress T = cisalhamento, η = viscosidade dinâmica, o = taxa de fluxo. Nota: A viscosidade dinâmica do meio RPMI a 37 ° C é 0,007. </li></ol></li></ol> 4. Carregando do Fluxo de Chambers e estimulação das células Nota: Para iniciar a adesão,As células T deve ser estimulada. Na experiência seguinte as células ou permanecerá não estimuladas ou estimuladas com a SDF-1α 12 ou acetato de miristato de forbol (PMA; controlo positivo) 13. Para apresentação adequada de quimiocina para células T, as células CHO-ICAM são pré-incubados com SDF-1α (seguido por lavagens em série), permitindo a apresentação na superfície celular. PMA é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro glicerol diacil (DAG); aqui é usado como um controlo positivo. As células T são tratados directamente com PMA antes de carregar para dentro da câmara de fluxo. <ol><li> Colocar a lâmina câmara de fluxo no microscópio e definir o plano focal sobre a monocamada de células CHO-ICAM usando a objectiva de 20x. </li><li> Manter as células T CFSE manchada por todas as outras condições no bloco de calor C 37 °. Preparar as células CHO-ICAM ou T como se segue imediatamente anterior ao ensaio para esta condição: <ol><li> Para a condição de não estimulada (câmara 1), mantenha um ch / tubo de fluxoâmbar não tratado, para servir como controlo negativo para a estimulação. </li><li> Para a estimulação de PMA (câmara 2), estimular um tubo de células T com PMA (10 ng / ml) para servir como controlo positivo; tratar imediatamente antes do carregamento na câmara de fluxo. </li><li> Para a estimulação SDF-1α, (a câmara 3), estimular a câmara de fluxo terceiro com SDF-1α (100 ng / ml), removendo 70 ul de cada vez 3 vezes a partir do reservatório superior (reservatório de saída) e, em seguida, adicionar 70 ul de SDF -1α (100 ng / ml) para dentro do reservatório inferior de (reservatório de entrada). Incubar durante 5 min. </li></ol></li><li> Remover e descartar 70 ul de cada vez 3 vezes a partir do reservatório de uma câmara de saída. </li><li> Adicionar 70 ul de suspensão de células pré-tratadas (conforme o caso) T para dentro do reservatório de entrada 3 vezes. Esperar 5 min para permitir que as células se mover a partir da entrada da câmara ( &quot;In&quot;), e para alcançar a saída proximal ( &quot;out&quot;) da câmara. </li><li> Durante esse tempo, a imagem 5campos para células T CFSE manchada. Escolha campos que estão dispersas por todo o centro da câmara (Figura 1). Use as seguintes condições de excitação / emissão: excitação laser de comprimento de onda: 488 nm; emissão de filtro de recolha: 500 - 540 nm. Estas imagens servirá como as contagens de células pré-fluxo. </li><li> Conecte a tubulação de entrada e saída simultaneamente para os reservatórios de câmara de fluxo. Nota: Colocar o tubo em simultâneo é essencial de modo a não introduzir bolhas de ar para dentro da câmara de equilíbrio e manutenção geral no interior da câmara. </li><li> Inicie o fluxo a 0,3 ml / min (0,4 dines / cm2), visualizando as células T-coradas com CFSE. Como o fluxo começa, especialmente com a primeira câmara, existe muitas vezes um atraso entre o início do fluxo e observação de rolamento de células T, por conseguinte, começar a cronometragem 5 min, no início do movimento de células T. </li><li> Terminar fluxo após 5 min, e de imagem 5 campos no canal CFSE. Escolha campos dispersos aleatoriamente throughout o centro da câmara de fluxo (Figura 1). Estas imagens servirá como as contagens de células pós-fluxo. </li></ol> 5. determinação da percentagem de células aderentes Nota: a determinação do número de células nas imagens adquiridas é feito objectivamente com software automatizado. Para os nossos estudos, utilizamos o Volocity software (versão 6.2.1), mas outros softwares como o ImageJ (versão 1.48V) também são aplicáveis. <ol><li> Determinar o número de células por campo pré-fluxo para cada condição. A média dos 5 domínios é a &quot;contagem média de células pré-fluxo.&quot; 7 </li><li> Determinar o número de células por campo de pós-fluxo para cada condição. A média dos 5 campos é a &quot;contagem de células média de pós-fluxo.&quot; 7 </li><li> Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (contagem média de células pós-fluxo) (contagem de células pré-fluxo médio) / x 100%. </li></ol>

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<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1%3A+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A fim de analisar adequadamente a adesão de células T, o estimulante seja incluída no estudo deve ser considerado na escolha de um método in vitro. Embora existam vários ensaios para estudar os sinais que conduzem a LFA-1 e ICAM-activação uma ligação todos os métodos não são intercambiáveis. Um ensaio de adesão estático 10 é o mais adequado para estudar as interações de células T-APC; Alternativamente, o método de tensão de corte detalhado aqui é ideal para modelar as interacções das células de célul...

T medeia a adesão de linfócitos de um número de processos diferentes, em um sistema imunitário saudável, 3 desempenhando papéis críticos no tráfico de células T e a apresentação do antigénio. Se durante a vigilância imunitária ou uma resposta imunitária activa estas duas grandes funções de adesão são críticos. 4 Os eventos de sinalização fisiológicos de interacções de células de células do endotélio T são distintos de células T-célula que apresenta antigénios (APC) interacções, e, portanto, requerem métodos distintos de estudo para melhor compreender as cascatas de sinalização envolvidos. A adesão firme de uma célula T a uma parede do vaso sanguíneo durante o extravasamento de linfócitos requer activação rápida e dinâmica integrina. A interacção estreita entre uma integrina e adesão activas moléculas de estado ao longo do endotélio leva a aderência resistente ao fluxo de sangue, permitindo que as células T para rastrear ao longo da superfície em busca de uma área permissiva para a passagem de células. 5 O rastreamento de um bi células T -directionally Alonda parede do vaso sanguíneo GA é dependentes de adesão polarizada, com uma extremidade dianteira adesiva distinta da célula T. 6 Mais importante ainda, a adesão e transmigração firme requerem resistência à força de corte gerada pela circulação de fluxo sanguíneo. Ao projetar experimentos para estudar a adesão de linfócitos, deve ser dada atenção ao estímulo específico de interesse. Enquanto a activação de integrina é um componente comum e crítica de todas as formas de adesão das células T, as cascatas de activação são susceptíveis de ser único a jusante dos receptores individuais e co-receptores. Do mesmo modo, pares de integrina e molécula de adesão funcionam em microambientes especializados e em subpopulações específicas. Desta forma, estes pares podem ser regulados de forma bastante diferente. O modelo aqui apresentado é ideal para o estudo da cascata de sinalização que levam à integrina ativação ocorrendo em condições de tensão de cisalhamento. 7 Essas interações não podem ser adequadamente compreendidas em um ADHESI estáticano sistema devido ao impacto ter sido mostrado que estas forças têm directamente no comportamento das células T. 8 Embora apresentado aqui com as células T e as células CHO (Ovário de Hamster Chinês) manipuladas para expressar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1, o sistema pode facilmente ser modificado para estudar diferentes populações de leucócitos ou moléculas de adesão. Este ensaio proporciona um método para quantificar a aderência de células T e a activação da integrina utilizando tensão de corte, fornecendo um modelo para a fase de adesão firme dos leucócitos extravasamento. Através da utilização de células CHO-ICAM a afinidade de LFA-1 para o seu ligando em células vivas pode ser examinada em tempo real, em resposta a vários estímulos de interesse. Esta técnica requer facilmente obtida, câmaras de micro-fluxo disponíveis comercialmente em combinação com uma bomba de seringa, o que simplifica grandemente o equipamento necessário para modelar o fluxo sanguíneo e tensão de cisalhamento, em comparação com outros modelos. 9 Uma outra vantagem principal deste ensaio é que a sinalização específicacascatas e do estado de activação das integrinas resultante individuais podem ser estudados de forma limpa através da utilização de células CHO modificadas que expressam moléculas de adesão humanos de interesse. Além disso, a combinação dos dados quantitativos com imagem de células vivas é uma vantagem significativa do presente método. Em geral, embora um certo número de ensaios de adesão de células T estática ter sido descrito que bem modelar as interacções célula T-APC, estes modelos são insuficientes na captura do processo dinâmico de adesão celular epitelial-T. Por este motivo, quando a escolha de um ensaio de adesão do estímulo em questão deve ser considerado.

<table><tbody><tr><td>Amostras de células T (linha celular ou primária)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Células T humanas periféricas</td></tr><tr><td>Células CHO-ICAM-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 500 ml</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro de 250 ml</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubulação 0,8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal com câmara de incubadora</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Qualquer microscópio fluorescente de campo amplo</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 60 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha;</td><td>R& D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Microcentrífuga Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Software Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td>Versão 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td>Versão 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%) Vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>FBS inativado por calor</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de adesão sob tensão de cisalhamento para o estudo da linfócitos t-molécula de adesão de interações

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Em geral, a adesão de células T é um componente crítico da função, contribuir para os processos distintos de recrutamento celular para os locais de inflamação e a interacção com as células apresentadoras de antigénio (APC), na formação de sinapses imunológicas. Estes dois contextos de adesão celular T diferem em que T interações célula-APC pode ser considerado estático, enquanto interações dos vasos células T no sangue são desafiados pela tensão de cisalhamento gerada pela própria circulação. interacções célula T-APC são classificados como estático em que os dois parceiros celulares são estáticos em relação ao outro. Normalmente, esta interacção ocorre dentro dos nódulos linfáticos. Como uma célula T interage com a parede do vaso sanguíneo, as células de prender e devem resistir à tensão de cisalhamento gerada. 1,2 Estas diferenças evidenciam a necessidade de compreender melhor a aderência estática e a aderência em condições de escoamento como dois processos reguladores distintos. A regulação da adesão das células T pode ser sucintamente descrito como conpesca à linha do estado de afinidade de integrina moléculas expressas na superfície da célula, e regulando assim a interacção de integrinas com os ligandos da molécula de adesão expressas na superfície da célula que interage. A nossa compreensão atual da regulação dos estados afinidade para a integrina vem muitas vezes simplista em sistemas modelo in vitro. O ensaio de adesão usando condições de fluxo descritos aqui permite a visualização e a quantificação precisa de interacções celulares de células-T epitelial em tempo real, na sequência de um estímulo. Uma adesão sujeito ao ensaio de fluxo pode ser aplicado a estudos de adesão de sinalização nas células T, após o tratamento com substâncias inibidoras ou estimuladores. Além disso, este ensaio pode ser expandido para além de sinalização de células T para qualquer população de leucócitos adesivo e qualquer integrina-molécula de adesão par.

Os resultados representativos são apresentados a partir do ensaio de adesão de Jurkat e de fluxo utilizando células T CD3 + humanos primária, tal como indicado, estimuladas com SDF-1α. Os controlos negativos em todas as experiências mostradas são células não estimuladas. Um limiar basal percentagem de adesão das células não estimuladas é entre 5 - 10%; adesão de base notadamente acima dessa faixa indica uma experiência problemática e sugere a população início de células T fora...

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

O objetivo geral deste ensaio é determinar os efeitos de tratamentos de interesse na adesão celular sob condições de tensão de cisalhamento. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de sinalização de células imunológicas, como, por exemplo, quais fatores mediam a ativação de integrinas. A principal vantagem desta técnica é que pares de moléculas de adesão individuais, como as integrinas, podem ser estudados em um sistema de fluxo facilmente replicável.Embora este método possa fornecer informações sobre a ativação de LFA1, ele também pode ser aplicado ao estudo de outras integrinas. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque a configuração técnica deve ser executada com precisão. Para colher as células CHO-ICAM, trate o cultivo com tripsina-EDTA 0,5% por um minuto à temperatura ambiente com agitação suave.Quando as células começarem a se desprender, neutralize a tripsina com quatro mililitros de meio fresco e conte o número de células dissociadas. Dilua as células até uma concentração de 0,75 vezes 10 à quinta células por câmara e centrifugue-as. Em seguida, re-suspenda o pellet em 30 microlitros por câmara de fluxo, em meio de

assay-adhesion-under-shear-stress-for-study-t-lymphocyte-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Recrutamento de leucócitos para o fígado ocorre dentro dos canais especializados dos sinusóides hepáticos, que são revestidas por células endoteliais sinusoidais hepáticas únicas. Microscopia de contraste de fase de recrutamento de leucócitos através do endotélio sinusoidal hepática humana em condições de tensão de cisalhamento fisiológico pode facilitar a elucidação dos mecanismos moleculares que estão na base deste processo.

Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série.

Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T

Relatamos um método in vitro que permite a quantificação do número real de células adesivas dentro de uma monocamada de células endoteliais.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

aderências na superfície celular são centrais na mecanotransdução, como eles transmitem tensão mecânica e iniciar as vias de sinalização envolvidos na homeostase e desenvolvimento do tecido. Aqui, apresentamos um protocolo para dissecar as vias bioquímicas que são ativadas em resposta à tensão, utilizando microesferas magnéticas revestidas com ligando e aplicação de força para receptores de adesão.

Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.

Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal

Nós descrevemos um método da em-solução para aplicar a tesoura uniforme aos receptores de superfície da plaqueta usando o viscometry da cone-placa. Esse método também pode ser usado de forma mais ampla para aplicar cisalhamento a outros tipos de células e fragmentos de células e não precisa direcionar um par de receptor de ligante específico.

Um ensaio de cisalhamento uniforme para receptores de superfície de células e plaquetas humanas através de Viscometry de cone-Plate

Este método é útil para quantificar a dinâmica precoce da adesão celular e disseminação de células dependentes de ancoragem para a fibronectina. Além disso, este ensaio pode ser usado para investigar os efeitos da homeostase redox alterada na propagação da pilha e/ou nas vias de sinalização intracelular adesão-relacionadas da pilha.

Examinando a dinâmica da adesão celular e disseminação de células epiteliais em fibronectina durante o estresse oxidativo

Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.

A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão

Aprenda a quantificar a adesão de linfócitos T sob tensão de cisalhamento usando células CHO-ICAM e microscopia confocal. Este ensaio de fluxo permite estudar a ativação de integrinas como LFA1 em interações célula imune-epitélio.

Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

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