Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

O objetivo geral deste procedimento é isolar e expandir as células-tronco estromais mesenquimais derivadas do tecido da placenta humana. Olá, sou Mike Doran. Sou líder de grupo na Queensland University of Technology no Translational Research Institute em Brisbane, Austrália.

Olá, meu nome é Rebecca Pelekanos e sou pesquisadora do Centro de Pesquisa Clínica da Universidade de Queensland. Hoje, estarei demonstrando o procedimento de isolamento do MSC. A placenta é normalmente descartada após o nascimento.

Como o tecido pesa de cinco a 700 gramas, ele oferece uma fonte excepcionalmente grande de células-tronco mesenquimais alogênicas. Geralmente, as pessoas que são novas no isolamento placentário de MSC terão dificuldades porque não estão familiarizadas com a anatomia da placenta e não estão familiarizadas com a forma de processar o tecido e não estão familiarizadas com o tipo de células, maternas ou fetais, que preencherão sua cultura final de MSC. Para ajudar os pesquisadores, discutimos esses detalhes importantes neste vídeo.

O primeiro passo neste procedimento é orientar-se com a anatomia da placenta. O segundo passo neste procedimento é dissecar manualmente 10 gramas de tecido da decídua, vilosidades coriônicas ou da placa coriônica, usando uma tesoura. As duas primeiras etapas são resumidas novamente aqui esquematicamente.

Na etapa três, a decídua, as vilosidades coriônicas ou os tecidos da placa coriônica são picados em pedaços finos com uma tesoura. Na etapa quatro, as células são liberadas dos pequenos pedaços de tecido por meio de uma digestão de uma a duas horas em dispase e colagenase I.In etapa cinco, as células são separadas do tecido fibroso lavando-as através de um filtro de células. As células são então coletadas, ressuspensas em meio de cultura e colocadas em frascos de cultura.

As células estromais mesenquimais, CTMs, serão selecionadas com base em sua propensão à aderência plástica e capacidade de sobreviver e proliferar no meio de cultura celular. Finalmente, na seção de resultados, as MSC expandidas podem ser caracterizadas e armazenadas para uso em experimentos futuros. A placenta é um órgão temporário que permite a troca de nutrientes e resíduos entre o feto e a mãe durante a gravidez.

A placenta pode ser facilmente coletada assepticamente após a cesariana e o parto seguro do bebê. A placenta é predominantemente composta por vasculatura e membranas derivadas do feto. No entanto, também contém algumas células maternas.

A placenta está conectada ao útero por células deciduais maternas derivadas do útero e trofoblastos invasores derivados do feto. Geralmente não é possível discernir a olho nu a interface precisa entre os tecidos materno e fetal. No entanto, o lado fetal da placenta é facilmente identificado como o lado onde o cordão umbilical está localizado.

Quando o bebê nasce, apenas uma fina camada de tecido decidual permanece conectada à placenta. Através da orientação física da placenta, é possível localizar os três tecidos que vamos colher hoje. O primeiro tecido a ser colhido é a decídua materna.

O marcador verde aponta para o tecido decidual que permanece na superfície depois que a placenta é eliminada da parede uterina. O segundo tecido que será colhido do interior da placenta são as vilosidades coriônicas fetais. Isso é indicado pelos círculos azuis nos diagramas.

O terceiro tecido a ser colhido será a placa coriônica fetal. Este tecido é identificado pelos marcadores vermelhos nos diagramas. Ok, vamos começar.

Coloque a placenta no gabinete de segurança biológica. Abra as membranas fetais e oriente-se com as partes da placenta. O lado fetal com a inserção do cordão umbilical, o laeve corioamniótico ou saco amniótico.

A superfície fetal da placenta tem grandes vasos sanguíneos óbvios na placa coriônica, com membrana amniótica sobreposta, que, novamente, é facilmente separada mecanicamente. O lado materno é oposto ao lado fetal, com os cotilédones ou lobos óbvios. Certifique-se de que a superfície materna esteja voltada para cima.

Corte pedaços de 0,5 cm de espessura do lado materno da placenta ou decídua. Durante as dissecações, coloque pedaços de tecido em uma placa de Petri contendo a solução salina balanceada de Hank, ou HBSS, para manter os tecidos úmidos. Agite os tecidos da louça com HBSS para remover um pouco de sangue.

Transfira tecido suficiente para encher o tubo até a marca de 10 mililitros de um tubo de 50 mililitros, aproximadamente 10 gramas. Observe que mais tecido pode ser isolado nesta fase se mais células forem necessárias no final do procedimento. Certifique-se de que a superfície fetal esteja voltada para cima.

Remova mecanicamente a membrana amniótica da superfície fetal da placenta, deixando a placa coriônica intacta. Corte a placa coriônica em tiras de aproximadamente meio centímetro de profundidade no tecido das vilosidades abaixo. Em seguida, disseque o tecido das vilosidades coriônicas com aproximadamente um centímetro de profundidade na placenta de onde a placa coriônica foi removida.

Coloque os tecidos no HBSS e meça aproximadamente 10 mililitros do tecido como foi feito anteriormente. Transfira pedaços de tecido, com transferência mínima de líquido, para uma placa de Petri de 10 centímetros e pique em pedaços finos de aproximadamente um mililitro cúbico, com uma tesoura. Transfira o tecido picado de volta para o tubo de 50 mil.

Repita para todas as amostras de tecido restantes. Adicione o meio de digestão recém-preparado em pelo menos uma proporção de um para um com o tecido. Inverta o tubo várias vezes para misturar.

Incube os tecidos no tubo com meio de digestão por uma a duas horas, a 37 graus em uma incubadora agitada. Quando a solução de digestão do tecido mudar para uma aparência turva e os vasos de sangue branco estiverem óbvios em solução, adicione 15 mililitros de HBSS para diluir as enzimas no meio de digestão. Centrifugue brevemente as amostras por pulso apenas até que a centrífuga atinja 340 g por cinco segundos e depois pare.

Isso forçará os detritos grandes a se acumularem no fundo do tubo. Devolva as amostras ao gabinete de segurança biológica. Coloque um filtro de células em um novo tubo de 50 mililitros.

Pipetar o sobrenadante que contém as células mononucleares para o filtro, recolhendo o eluído no novo tubo. Deixe os restos do tecido placentário para trás no primeiro tubo. Adicione 15 mililitros de HBSS aos detritos placentários, agite vigorosamente para recuperar mais células e pulse a amostra.

Pipetar novamente o sobrenadante para o tubo com o filtro de células no tubo de recolha. Despejar o sobrenadante no filtro de células pode ser mais adequado, dependendo da consistência da amostra. Lave o filtro de células com 5 mililitros de HBSS.

Descarte o tubo que contém os restos do tecido placentário. Centrifugar a amostra sobrenadante durante cinco minutos a 340 g para sedimentar as células. Os glóbulos vermelhos são visíveis como uma camada na parte inferior do pellet, e as células mononucleares, incluindo as MSCs, são a camada mais clara sobre os glóbulos vermelhos.

Devolva as amostras ao gabinete de segurança biológica. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e eliminar. Agite o tubo várias vezes com um dedo para desalojar o pellet celular e ressuspenda o pellet celular em 35 mililitros de meio MSC.

Transfira a suspensão celular para um frasco T175 por 10 mils de tecido e cultive em uma incubadora de 37 graus com 5% de CO2. Após o isolamento, troque os meios de cultura após 48 horas. Alimente as culturas uma vez por semana até ficarem confluentes.

As culturas devem ser confluentes em aproximadamente 14 dias. Por fim, expanda e criopreserve células, analise as características das MSC e use em experimentos. Após 48 horas de cultura, as MSC terão se anexado ao plástico de cultura de tecidos, enquanto as populações de células hematopoiéticas e outras não terão.

Neste momento, o meio é substituído por 35 mililitros de meio de cultura fresco. A aparência do sobrenadante da cultura pode variar substancialmente entre os doadores de placenta. Os exemplos um e dois demonstram essa variação.

Esses dois isolamentos foram realizados simultaneamente, mas a partir de duas placentas diferentes. Uma vez lavadas, as culturas ficam livres de glóbulos vermelhos e detritos teciduais, como mostrado no exemplo três, e os resultados da expansão subsequente são geralmente consistentes. Após a troca de mídia de 48 horas, apenas algumas células são conectadas ao frasco.

Sete dias após o isolamento, as colônias fibroblásticas de MSC são visíveis, embora células não MSC também estejam presentes, como células redondas ou frouxamente aderidas. 13 dias após o isolamento, as colônias fibroblásticas de MSC são grandes e, muitas vezes, a monocamada de MSC é suficientemente confluente e pronta para passar. Da passagem para a frente, a monocamada MSC desenvolve uma morfologia característica semelhante a um redemoinho na confluência.

As CTM placentárias exibem um perfil clássico de marcadores de CTM por análise de citometria de fluxo. As células são positivas para CD73, CD105 e CD90 e negativas para os marcadores hematopoiéticos de CD45, CD34 e HLA-DR. As MSC placentárias geralmente sofrem uma diferenciação osteogênica robusta, mas uma diferenciação adipogênica pobre.

Muitas publicações assumem que as células isoladas do córion fetal produzem MSC fetal após a cultura. No entanto, como relatamos anteriormente, todas as culturas derivadas do córion fetal usando este protocolo tornam-se rapidamente enriquecidas para MSC maternas, como seria de se esperar para as culturas de MSC deciduais maternas. Os dados aqui mostrados quantificam a composição celular fetal e materna das culturas placentárias de MSC isoladas de tecidos deciduais, vilosidades coriônicas e placas coriônicas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia de como isolar e cultivar MSC derivadas do tecido placentário. Esperamos que você ache esses métodos úteis em suas pesquisas e aplicações clínicas que podem usar MSCs derivadas da placenta.