Name: Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprenda a isolar e expandir células-tronco mesenquimais da placenta humana usando dissecação manual e digestão enzimática. Este método permite obter MSCs para pesquisa em medicina regenerativa.

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RP foi apoiado por um Conselho Nacional de Saúde e de Investigação Médica (NHMRC) Pós-Doutorado Training Fellowship. VS foi apoiado por uma bolsa de estudos da Universidade de Queensland International Postgraduate Student. MRD foi apoiado pela NHMRC e Inner Roda Austrália. Agradecemos pessoal clínico e de enfermagem para auxiliar o consentimento do paciente e coleta de amostras. Agradecemos Prof. Nickolas Fisk, Prof. Kerry Atkinson eo Dr. Rohan Lourie para discussões criteriosas em obstetrícia, o desenvolvimento feto-placentária e anatomia placenta.

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Os autores não têm nada a divulgar.

A placenta é um órgão feto-materna fisicamente grande, a partir do qual MSC fetal ou materno pode ser isolado 22. Aqui, nós fornecemos um panorama detalhado da anatomia da placenta e instruções sobre como dissecar especificamente decídua (materna), vilo corial (fetal), e placa coriônica (fetal) de tecido (Passo 2,2-2,4). Posteriormente, traçamos um protocolo robusto que permite o isolamento MSC de cada um destes três tecidos (Passo 2,5-2,6). Expansão da placenta MSC é eficiente e culturas aparecer semelhante ao osso derivadas de medula culturas MSC (Figuras 3 e 4). Diferenciação osteogénica é fiável (Figura 5B), enquanto que a diferenciação adipogênica é geralmente menos eficientes (Figura 5C) 5. Muitos recém-chegados ao campo irá presumir que as culturas derivadas de vilo corial fetal ou tecidos placa coriônica será enriquecido por MSC fetal. No entanto, em nossas mãos feenriquecimento de células tal só é transitória quando o meio de expansão MSC padrão tal como DMEM-LG + 10% FBS é utilizado 5. Aqui nós fornecemos resultados representativos usando tecidos da placenta derivadas de um bebê do sexo masculino. Ao usar o tecido da placenta de um bebê do sexo masculino, as células fetais são facilmente identificáveis ​​como tendo cromossomos XY, enquanto as células maternas são identificáveis ​​como tendo cromossomas XX. A Figura 6 mostra XY resultados peixe para uma cultura representativa. Enquanto MSC fetal (XY) são enriquecidos (até 80%) nas culturas iniciais derivados de vilosidades coriónicas fetal ou tecidos placa coriónicas, estas mesmas culturas são rapidamente ultrapassada (~ 100%) por materna (XX) MSC sobre as duas primeiras passagens . Na forma padrão, composto por DMEM-LG + FBS a 10%, o MSC materno-derivados poucos que contaminam os tecidos fetais outcompete as células fetais derivadas em cultura. Um passo crítico descrito neste protocolo é uma apreciação da anatomia da placenta e de onde fetale tecido materno pode ser mais eficazmente colhidas. Conforme descrito na seção de resultados representativos, dissecção de tecido fetal não permitir o enriquecimento transitória para MSC derivadas de fetal. Melhorias na formulação do meio de expansão, através da suplementação exógena específico médio do factor de crescimento deve permitir a expansão selectiva das populações MSC de derivação fetal, e fabricar um produto celular que é enriquecido por fetal, em vez de células maternas (o nosso grupo está actualmente a desenvolver tais formulações médias). O fabrico de populações MSC fetais pode ter um número de vantagens, como MSC fetal são supostas ter maior angiogénese e propriedades imunossupressoras do que equivalentes populações MSC 37 maternas. Em cada um dos protocolos de isolamento descritos, utilizou-se cerca de 10 g de tecido. Toda uma placenta é tipicamente 500-750 g, e em trabalhos anteriores que demonstraram que através do tecido automatizada digestão e um biorreator proc expansão celularcessos que deveria ser possível fabricar mais de 7.000 doses de células clínicos de uma única placenta 4. Esses números destacam a adequação potencial de MSC derivadas da placenta em terapias MSC alogénicas, ea importância deste método, independentemente da origem MSC (fetal ou materna). Do ponto de vista terapêutico, é mais crítico que os usuários tenham um entendimento completo do produto celular e capacidade para fabricar de forma confiável este produto celular. Esperamos que o nosso vídeo vai ajudar os pesquisadores a entender a anatomia da placenta, isolar MSC a partir da placenta, e antecipar a composição celular fetal ou materna provável de suas culturas.

-Tronco mesenquimais / células do estroma (MSC) estão emergindo como um candidato promissor para uso em terapias baseadas em células 1. A maioria das aplicações parecem ter como alvo a reparação de tecidos mediada por MSC ou regulação imune 2. Em muitas destas aplicações, alogênico MSC pode ser tão eficaz como MSC autólogo 3. O uso de MSC alogénico tem a vantagem económica de ser compatível com o fabrico em grande escala de múltiplas doses de células a partir de uma única fonte de tecido 4 para tratar muitos pacientes. Historicamente, os estudos pré-clínicos e clínicos utilizaram-MSC derivadas da medula óssea 4. A medula óssea é geralmente recolhida a partir da crista ilíaca de um dador voluntário. Este processo é invasiva, e apenas um pequeno volume de medula (~ 20 ml) é recolhido através de um único punção. Gerar números clinicamente significativas de MSC exige ampla expansão in vitro. potência celular diminui com o número de passagens <sup&gt; 3, criando um paradoxo que o número teórico de células necessárias para a eficácia clínica é aumentado mais a população de células é expandida. Em contraste com os aspirados de medula óssea, a placenta é um termo fisicamente grandes tecidos de partida (tipicamente 500-750 g 4), que pode ser colhido assepticamente durante cesariana sem risco para o dador. MSC derivadas de placenta têm proliferação 5 e imunomodulador capacidade a longo prazo 6, superior ao MSC derivadas de medula óssea. Num estudo anterior, demonstrou-se que um único termo placenta continha MSC suficiente para o fabrico de 7.000 até 4 doses clínicas. Estas características tornam placenta um tecido fonte ideal para o fabrico de MSC alogénica. A placenta é um órgão feto-materna consiste em ambos fetal e materna tecido 7, e, assim, MSC de origem fetal ou materno pode ser, teoricamente, isolado. As seguintes referências fornecem deatado informações sobre o desenvolvimento e patologia, bem como exame microscópico e macroscópico da placenta humana e anexos 8,9. A placenta adequada é composta em grande parte dos vasos sanguíneos fetais e secretora e células de suporte chamadas trofoblastos, tornando-se as vilosidades coriônicas abrangidos pelo frondosum córion (placa) 8. As vilosidades da placenta ramificados são banhadas em sangue materno entregues a partir das artérias em espiral uterina, permitindo nutrientes, hormônios e as trocas gasosas entre o feto ea mãe. A placenta é ancorado ao endométrio através de células do estroma deciduais maternas e os trofoblastos fetais extravillious são intercaladas em oito matriz extracelular. As vilosidades convergem para a placa coriônica fetal onde formam o cordão umbilical 8. Um resultado do primeiro Workshop Internacional sobre Células-tronco derivadas de placenta (2008) era uma apreciação da necessidade de padronizar o isolamento e characterization de células de placenta humana 10. Devido à anatomia da placenta, dissecção dos diferentes tecidos, isolamento de MSC e os resultados esperados cultura pode ser esmagadora para os recém-chegados ao campo. Neste protocolo, a colheita de tecidos coriônicas da placenta, seguido pelo isolamento MSC e expansão é completamente detalhado. MSC caracterização por meio de citometria de fluxo e na diferenciação in vitro são consideradas de rotina 5,11-13, e, assim, apenas brevemente detalhado aqui. Conforme destacado em uma recente revisão sistemática da literatura 14, MSC obtidos a partir das vilosidades coriônicas da placenta são geralmente assumido ser fetal. Embora, apenas 18% dos estudos examinou a origem do MSC obtido, e desses, apenas metade dos estudos relataram MSC fetal ea outra metade relatou populações MSC maternos ou mistos. Cada um dos três componentes do tecido aqui descritos (vilo corial, placa e decídua basalis coriônica) são composed principalmente da membrana fetal / vilosidades, e uma pequena proporção de células maternas derivada-uterinas, que permanecem ligados à placenta entregue. Nós fornecer dados que demonstram que o isolamento MSC do lado materno da placenta, em vez do lado fetal da placenta, como já anteriormente relatado 5,11, é um material de partida mais adequado se MSC materno são desejados. Este protocolo descreve também o uso de XY peixe para validar contribuição fetal ou materno para culturas de células. Enquanto este é um protocolo padrão do fabricante, esta análise é muitas vezes negligenciada e sua importância subestimada 14.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Nome longo: Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nome longo: Soro bovino fetal</td></tr><tr><td>substituto de tripsina</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>Nome longo: TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>Nome longo: Dulbecco' s Águias Modificadas Médio-Baixo Glicose</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nome longo: Dulbecco ' s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td></tr><tr><td>PBS (Mg+Ca+ livre)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Nome longo: Dulbecco's Phosphate tampoed salina, magnésio e cálcio livre</td></tr><tr><td>Anti- anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nome longo: solução antibiótica-antimicótica x100</td></tr><tr><td>paraformaldeído em pó ou solução a 4%</td><td>qualquer&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2.500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml em&nbsp; 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>10 mg/ml em água (20.000 U/ml).</td></tr><tr><td><forte>Material</forte></td><td><forte>Empresa</forte></td><td><forte>Número de catálogo</forte></td><td><forte>Comentários</forte></td></tr><tr><td><forte>Descartáveis:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr>tubos de <tr><td>centrífuga de 50 ml</td><td>Falcon ou qualquer marca</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>placas de Petri, plástico estéril (25 cm e 10 cm de diâmetro)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células (100 &mu; m)</td> Frascos de cultura de tecidos estéreis <td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 e 75 cm2 (T175 e T75)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml pipetas seróricas estéreis</td> de <td>qualquer marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material</td><td>Company</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Centrífuga &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; incubadora para cultura de tecidos 37 &deg; C, 5% CO2</td>Cabine <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>de segurança biológica</td></tr><tr><td>&nbsp; Tesouras e pinças</td><td></td><td></td><td></td>estéreis</tr><tr><td>Suportes para tubos&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta-boy ou pipetadores tipo Gilson equivalentes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>e pontas estéreis 1.000 &micro; l, 200 &micro; l, 20 &micro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>incubadora de balanço ou agitação (37 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> soluções de limpeza de <tr><td>equipamentos</td><td></td><td></td><td></td>de proteção individual</tr><tr><td>(adequados para sangue)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>recipientes de resíduos, lixeiras de descarte correto para tecidos/sangue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagentes para caracterização de MSC</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpo (ID do clone)</forte></td><td>Fabricante</td><td>Nº de catálogo</td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>Mouse IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>Mouse IgG1</td></tr><tr><td>Controles de isotipo (ID do clone)</td><td>Fabricante</td><td>Catálogo nº</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo IgG1 Isotipo (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>Tampão MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td><forte>Diferenciação osteogênica</forte></td><td><forte>Fabricante</td><td>Catálogo n.º</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nome comprido: Dulbecco» s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nome longo: Soro bovino fetal</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nome longo: solução antibiótica-antimicótica x100</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glicerol Phophate</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>L-ácido ascórbico 2-fosfato</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>Para coloração de matriz de cálcio</td></tr><tr><td>Diferenciação adipogênica</td><td>Fabricante</td><td>Nº de catálogo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Nome longo: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Nome longo: Soro bovino fetal</td></tr><tr><td>Anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Nome longo: solução antibiótica-antimicótica x100</td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metil xantina</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Red O solução</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>Para coloração de vacúolo lipídico</td></tr><tr><td><forte>XY Kit FISH para determinar a origem fetal ou materna das células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY kit FISH de homossomo</td><td>Vysis (Abbott Molecular)</td><td>07J20-050</td><td>Nome longo: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Kit de sonda de DNA fluorescente com etiqueta direta</td></tr></tbody></table>

isolamento e expansão de ctm / células estromais derivadas de placenta humana tissue

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Células-tronco/estromais mesenquimais (MSC) são candidatas promissoras para uso em terapias baseadas em células. Na maioria dos casos, a resposta terapêutica parece ser dependente da dose celular. A placenta a termo humano é rica em MSC e é um tecido fisicamente grande que geralmente é descartado após o nascimento. A placenta é um material de partida ideal para a fabricação em larga escala de doses múltiplas de células de MSC alogênicas. A placenta é um órgão fetomaterno do qual o tecido fetal ou materno pode ser isolado. Este artigo descreve a anatomia placentária e o procedimento para dissecar o tecido decíduo (materno), vilosidades coriônicas (fetal) e placa coriônica (fetal). O protocolo descreve como isolar as MSC de cada região de tecido dissecado e fornece uma análise representativa das MSC expandidas derivadas dos respectivos tipos de tecido. Esses métodos destinam-se ao isolamento pré-clínico de MSC, mas também foram adaptados para a fabricação clínica de MSC placentária para uso terapêutico humano.

Descreve-se aqui métodos para a dissecação de tecidos fetais e maternas de placenta humana, seguido por isolamento e expansão de células estaminais mesenquimais / estroma (MSC) a partir desses tecidos.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e expandir células estromais mesenquimais derivadas do tecido placentário humano. Olá, sou Mike Doran. Sou líder de grupo na Universidade de Tecnologia de Queensland, no Instituto de Pesquisa Translacional em Brisbane, Austrália.Olá, meu nome é Rebecca Pelekanos e sou pesquisadora no Centro de Pesquisa Clínica da Universidade de Queensland. Hoje, demonstrarei o procedimento de isolamento de MSCs. A placenta normalmente é descartada após o nascimento.Como o tecido possui um peso entre cinco e 700 gramas, ele oferece uma fonte singularmente ampla de células-tronco mesenquimais alogênicas. Geralmente, pessoas novas no isolamento de células-tronco mesenquimais da placenta enfrentam dificuldades, pois não estão familiarizadas com a anatomia da placenta, com o processamento do tecido e com o tipo de células, maternas ou fetais, que irão compor a cultura final de células-tronco mesenquimais. Para auxiliar pesquisadores, discutimos esses detalhes importantes neste vídeo.O primeiro passo neste procedimento é familiarizar-se com a anatomia da placenta. O segundo passo é dissecar manualmente 10 gramas de tecido da decidua, das vilosidades coriônicas ou da lâmina coriônica, utilizando tesoura. Os dois primeiros passos são novamente resumidos aqui de forma esquemática.No terceiro passo, os tecidos da decídua, vilosidades coriônicas ou placa coriônica são further picados em pedaços finos com tesoura. No quarto passo, as células são liberadas dos pequenos fragmentos de tecido por meio de uma digestão de uma a duas horas em dispase e colagenase I. No quinto passo, as células são separadas do tecido fibroso lavando-as através de um filtro celular. Em seguida, as células são coletadas, ressuspendidas em meio de cultura e colocadas em frascos de cultura.Células estromais mesenquimais, MSCs, serão selecionadas com base em sua propensão à aderência plástica e capacidade de sobreviver e proliferar no meio de cultura celular. Por fim, na seção de resultados, as MSCs expandidas podem ser caracterizadas e armazenadas para uso em experimentos futuros. A placenta é um órgão temporário que permite a troca de nutrientes e produtos residuais entre o feto e a mãe durante a gravidez.A placenta pode ser facilmente coletada de forma asséptica após uma seção cesariana e o parto seguro do bebê. A placenta é composta predominantemente por vasos sanguíneos e membranas derivados do feto. No entanto, também contém algumas células maternas.A placenta está conectada ao útero por células deciduais derivadas do tecido materno, uterino, e por trofoblastos invasivos derivados do feto. Normalmente, não é possível discernir a olho nu a interface exata entre os tecidos materno e fetal. No entanto, o lado fetal da placenta é facilmente identificado como o lado onde se localiza o cordão umbilical.Após a liberação do bebê, apenas uma fina camada de tecido decidual permanece conectada à placenta. Por meio da orientação física da placenta, é possível identificar os três tecidos que coletaremos hoje. O primeiro tecido a ser coletado será a decídua materna.O marcador verde aponta para o tecido decidual que permanece na superfície após a placenta ser destacada da parede uterina. O segundo tecido que será coletado do interior da placenta são as vilosidades coriônicas fetais. Isso é indicado pelos círculos azuis nos diagramas.O terceiro tecido a ser coletado será a placa coriônica fetal. Esse tecido é identificado pelos marcadores vermelhos nos diagramas. Pronto, vamos começar.Coloque a placenta na cabine de segurança biológica. Abra as membranas fetais e oriente-se com as partes da placenta. O lado fetal com a inserção do cordão umbilical, o corioamniótico laeve ou o saco amniótico.A superfície fetal da placenta apresenta vasos sanguíneos grandes e evidentes na lâmina coriônica, com a membrana amniótica sobrejacente, que, novamente, é facilmente separada por meios mecânicos. O lado materno é oposto ao lado fetal, com os cotilédones ou lóbulos evidentes. Certifique-se de que a superfície materna esteja voltada para cima.Corte pedaços de 0,5 cm de espessura do lado materno da placenta ou do decíduo. Durante as dissecações, coloque os fragmentos de tecido em uma placa de Petri contendo solução salina balanceada de Hank, ou HBSS, para manter os tecidos úmidos. Agite os tecidos nas placas com HBSS para remover parte do sangue.Transfira quantidade suficiente de tecido para preencher o tubo até a marca de 10 mililitros de um tubo de 50 mililitros, aproximadamente 10 gramas. Observe que mais tecido pode ser isolado nesta etapa se forem necessárias mais células ao final do procedimento. Certifique-se de que a superfície fetal esteja voltada para cima.Remova mecanicamente a membrana amniótica da superfície fetal da placenta, mantendo intacto o disco coriônico. Corte o disco coriônico em tiras com cerca de meio centímetro de profundidade no tecido dos vilos subjacente. Em seguida, dissecce o tecido dos vilos coriônicos com cerca de um centímetro de profundidade na placenta, a partir do local onde o disco coriônico foi removido.Coloque os tecidos em HBSS e meça aproximadamente 10 mililitros do tecido, como foi feito anteriormente. Transfira os pedaços de tecido, com transferência mínima de líquido, para uma placa de Petri de 10 centímetros e pique em pedaços finos de aproximadamente um milímetro cúbico, com tesoura. Transfira o tecido picado de volta para o tubo de 50 mL.Repita para todas as amostras de tecido restantes. Adicione o meio de digestão recém-preparado em uma proporção de pelo menos um para um em relação ao tecido. Inverta o tubo várias vezes para homogeneizar.Incube os tecidos no tubo com o meio de digestão por uma a duas horas, a 37 graus em um incubador com agitação. Quando a solução de digestão do tecido apresentar aparência turva e os vasos sanguíneos brancos forem visíveis na solução, adicione 15 mililitros de HBSS para diluir as enzimas no meio de digestão. Faça uma centrifugação rápida das amostras, apenas até que a centrífuga atinja 340 g por cinco segundos, e então pare.Isso fará com que os detritos maiores se acumulem na parte inferior do tubo. Retorne as amostras para a cabine de segurança biológica. Coloque um filtro celular em um novo tubo de 50 mililitros.Pipete o sobrenatante contendo as células mononucleares para dentro do filtro, recolhendo o eluato no novo tubo. Deixe os resíduos de tecido placentário para trás no primeiro tubo. Adicione 15 mililitros de HBSS aos resíduos placentários, agite vigorosamente para recuperar mais células e faça uma centrifugação rápida da amostra.Novamente, pipete o sobrenatante para o tubo com o filtro celular no tubo de coleta. Derramar o sobrenatante no filtro celular pode ser mais adequado, dependendo da consistência da amostra. Lave o filtro celular com 5 mililitros de HBSS.Descarte o tubo contendo os detritos de tecido placentário. Centrifugue a amostra do sobrenadante por cinco minutos a 340 g para obter o pellet celular. Os eritrócitos são visíveis como uma camada na parte inferior do pellet, e as células mononucleares, incluindo as CMMs, formam a camada mais clara acima dos eritrócitos.Retorne as amostras para a cabine de segurança biológica. Decante cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Agite o tubo várias vezes com o dedo para soltar o pellet celular e re-suspenda o pellet celular em 35 mililitros de meio para MSC.Transfira a suspensão celular para um frasco T175 para cada 10 mililitros de tecido e cultive em uma incubadora a 37 graus com 5% de CO₂. Após o isolamento, troque o meio de cultura após 48 horas. Alimente as culturas uma vez por semana até atingirem confluência.Os cultivos devem atingir confluência em aproximadamente 14 dias. Por fim, expanda e criopreserve as células, analise as características das CMM e utilize-as em experimentos. Após 48 horas de cultivo, as CMM terão se aderido ao plástico de cultura de tecidos, enquanto as populações de células hematopoéticas e outras não terão aderido.Neste momento, o meio é substituído por 35 mililitros de meio de cultura fresco. A aparência do sobrenadante da cultura pode variar significativamente entre doadores de placenta. O exemplo um e dois demonstram essa variação.Esses dois isolamentos foram realizados simultaneamente, mas a partir de duas placentas diferentes. Após a lavagem, as culturas estão livres de hemácias e detritos teciduais, conforme mostrado no exemplo três, e os resultados subsequentes de expansão são geralmente consistentes. Após a troca do meio em 48 horas, apenas algumas células estão aderidas ao frasco.Sete dias após o isolamento, colônias de MSCs fibroblásticas são visíveis, embora células não MSC também estejam presentes, como células redondas ou fracamente aderidas. Treze dias após o isolamento, as colônias de MSCs fibroblásticas são grandes, e muitas vezes o monocamada de MSCs está suficientemente confluente e pronta para ser subcultivada. A partir da primeira subcultura em diante, o monocamada de MSCs desenvolve uma morfologia característica semelhante a um redemoinho na confluência.As CEM da placenta exibem um perfil clássico de marcadores de CEM por análise de citometria de fluxo. As células são positivas para CD73, CD105 e CD90, e negativas para os marcadores hematopoiéticos CD45, CD34 e HLA-DR. As CEM da placenta geralmente sofrem uma diferenciação osteogênica robusta, mas uma diferenciação adipogênica fraca.Muitas publicações assumem que células isoladas do córion fetal produzem MSC fetal após o cultivo. No entanto, como relatamos anteriormente, todos os cultivos derivados do córion fetal utilizando este protocolo tornam-se rapidamente enriquecidos por MSC materna, como seria esperado para os cultivos de MSC decidual materna. Os dados apresentados aqui quantificam a composição celular fetal e materna dos cultivos de MSC placentários isolados de tecidos decíduais, vilosidades coriônicas e placa coriônica.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como isolar e cultivar CMM derivadas de tecido placentário. Esperamos que esses métodos sejam úteis em suas pesquisas e aplicações clínicas que possam utilizar CMM derivadas da placenta.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Este protocolo descreve o isolamento ea subsequente expansão de células mesenquimais estromais e as células endoteliais que formam colônias sem o uso de animais soro autólogo para gerar pares para fins de transplante experimental.

Isolamento e animais de Expansão de soro livre de cordão umbilical humano Derivado células mesenquimais estromais (MSCs) e endoteliais Células Progenitoras Colony Forming (ECFCs)

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm potencial de diferenciação em relação à linhagem osteoblástica quando estimuladas com fatores solúveis ou biomateriais específicos. Este trabalho apresenta uma nova opção para a entrega de MSCs a partir de membrana amniótica humana (AM-hMSCs) que emprega a matriz óssea bovina Nukbone (NKB) como um andaime.

Isolamento de mesenquimais humanas células-tronco e seu cultivo na matriz óssea Porous

Aqui, apresentam-se um protocolo para a dissecção de cordão umbilical humano (UC) e a amostra da placenta fetal em cordão de revestimento (CL), geleia de Wharton (WJ), junção de cabo-placenta (CPJ), e na placenta fetal (FP) para o isolamento e caracterização de células estromais mesenquimais (MSCs), utilizando a técnica de cultura de explante.

Isolamento e Caracterização de células mesenquimais do estroma a partir de cordão umbilical humano e Fetal Placenta

Cordão umbilical humano (UC) podem ser obtido durante o período perinatal como resultado de pré-termo, termo e postterm entrega. Neste protocolo, descrevemos o isolamento e caracterização de UC-derivado células-tronco mesenquimais (UC-MSCs) de fetos/recém-nascidos com 19-40 semanas de gestação.

Isolamento e caracterização de células humanas de Cordão Umbilical-derivados mesenquimais haste de prematuros e recém-nascidos de termo

Este protocolo fornece um método livre de enzimas para isolar as células-tronco mesenquímicas de abdominoplastia e amostras lipoaspirate usando um método explant. A ausência de enzimas duras ou etapas de centrífuga fornece células-tronco clinicamente relevantes que podem ser usadas para estudos in vitro ou transferidas de volta para a clínica.

Um método sem enzimas para isolamento e expansão de células-tronco mesenchymal derivadas do adiposo humano

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.

Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

O isolamento de MSCsaltasde MFGE8BAMBI , um dos três principais subgrupos que constituem UC-MSCs humanas heterogêneas, é útil para entender completamente as características e funções desse subtipo para sua futura aplicação para melhorar a eficácia clínica em doenças específicas. Aqui, apresentamos um método para classificar BAMBIaltoMFGE8alto UC-MSCs.

Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBIhumanoMFGE8alto

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Aprenda a isolar e expandir células-tronco mesenquimais da placenta humana usando dissecação manual e digestão enzimática. Este método permite obter MSCs para pesquisa em medicina regenerativa.

Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

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