Isolamento e expansão de CTM / células estromais derivadas de placenta humana Tissue

O objetivo geral deste procedimento é isolar e expandir células estromais mesenquimais derivadas do tecido placentário humano. Olá, sou Mike Doran. Sou líder de grupo na Universidade de Tecnologia de Queensland, no Instituto de Pesquisa Translacional em Brisbane, Austrália.

Olá, meu nome é Rebecca Pelekanos e sou pesquisadora no Centro de Pesquisa Clínica da Universidade de Queensland. Hoje, demonstrarei o procedimento de isolamento de MSCs. A placenta normalmente é descartada após o nascimento.

Como o tecido possui um peso entre cinco e 700 gramas, ele oferece uma fonte singularmente ampla de células-tronco mesenquimais alogênicas. Geralmente, pessoas novas no isolamento de células-tronco mesenquimais da placenta enfrentam dificuldades, pois não estão familiarizadas com a anatomia da placenta, com o processamento do tecido e com o tipo de células, maternas ou fetais, que irão compor a cultura final de células-tronco mesenquimais. Para auxiliar pesquisadores, discutimos esses detalhes importantes neste vídeo.

O primeiro passo neste procedimento é familiarizar-se com a anatomia da placenta. O segundo passo é dissecar manualmente 10 gramas de tecido da decidua, das vilosidades coriônicas ou da lâmina coriônica, utilizando tesoura. Os dois primeiros passos são novamente resumidos aqui de forma esquemática.

No terceiro passo, os tecidos da decídua, vilosidades coriônicas ou placa coriônica são further picados em pedaços finos com tesoura. No quarto passo, as células são liberadas dos pequenos fragmentos de tecido por meio de uma digestão de uma a duas horas em dispase e colagenase I. No quinto passo, as células são separadas do tecido fibroso lavando-as através de um filtro celular. Em seguida, as células são coletadas, ressuspendidas em meio de cultura e colocadas em frascos de cultura.

Células estromais mesenquimais, MSCs, serão selecionadas com base em sua propensão à aderência plástica e capacidade de sobreviver e proliferar no meio de cultura celular. Por fim, na seção de resultados, as MSCs expandidas podem ser caracterizadas e armazenadas para uso em experimentos futuros. A placenta é um órgão temporário que permite a troca de nutrientes e produtos residuais entre o feto e a mãe durante a gravidez.

A placenta pode ser facilmente coletada de forma asséptica após uma seção cesariana e o parto seguro do bebê. A placenta é composta predominantemente por vasos sanguíneos e membranas derivados do feto. No entanto, também contém algumas células maternas.

A placenta está conectada ao útero por células deciduais derivadas do tecido materno, uterino, e por trofoblastos invasivos derivados do feto. Normalmente, não é possível discernir a olho nu a interface exata entre os tecidos materno e fetal. No entanto, o lado fetal da placenta é facilmente identificado como o lado onde se localiza o cordão umbilical.

Após a liberação do bebê, apenas uma fina camada de tecido decidual permanece conectada à placenta. Por meio da orientação física da placenta, é possível identificar os três tecidos que coletaremos hoje. O primeiro tecido a ser coletado será a decídua materna.

O marcador verde aponta para o tecido decidual que permanece na superfície após a placenta ser destacada da parede uterina. O segundo tecido que será coletado do interior da placenta são as vilosidades coriônicas fetais. Isso é indicado pelos círculos azuis nos diagramas.

O terceiro tecido a ser coletado será a placa coriônica fetal. Esse tecido é identificado pelos marcadores vermelhos nos diagramas. Pronto, vamos começar.

Coloque a placenta na cabine de segurança biológica. Abra as membranas fetais e oriente-se com as partes da placenta. O lado fetal com a inserção do cordão umbilical, o corioamniótico laeve ou o saco amniótico.

A superfície fetal da placenta apresenta vasos sanguíneos grandes e evidentes na lâmina coriônica, com a membrana amniótica sobrejacente, que, novamente, é facilmente separada por meios mecânicos. O lado materno é oposto ao lado fetal, com os cotilédones ou lóbulos evidentes. Certifique-se de que a superfície materna esteja voltada para cima.

Corte pedaços de 0,5 cm de espessura do lado materno da placenta ou do decíduo. Durante as dissecações, coloque os fragmentos de tecido em uma placa de Petri contendo solução salina balanceada de Hank, ou HBSS, para manter os tecidos úmidos. Agite os tecidos nas placas com HBSS para remover parte do sangue.

Transfira quantidade suficiente de tecido para preencher o tubo até a marca de 10 mililitros de um tubo de 50 mililitros, aproximadamente 10 gramas. Observe que mais tecido pode ser isolado nesta etapa se forem necessárias mais células ao final do procedimento. Certifique-se de que a superfície fetal esteja voltada para cima.

Remova mecanicamente a membrana amniótica da superfície fetal da placenta, mantendo intacto o disco coriônico. Corte o disco coriônico em tiras com cerca de meio centímetro de profundidade no tecido dos vilos subjacente. Em seguida, dissecce o tecido dos vilos coriônicos com cerca de um centímetro de profundidade na placenta, a partir do local onde o disco coriônico foi removido.

Coloque os tecidos em HBSS e meça aproximadamente 10 mililitros do tecido, como foi feito anteriormente. Transfira os pedaços de tecido, com transferência mínima de líquido, para uma placa de Petri de 10 centímetros e pique em pedaços finos de aproximadamente um milímetro cúbico, com tesoura. Transfira o tecido picado de volta para o tubo de 50 mL.

Repita para todas as amostras de tecido restantes. Adicione o meio de digestão recém-preparado em uma proporção de pelo menos um para um em relação ao tecido. Inverta o tubo várias vezes para homogeneizar.

Incube os tecidos no tubo com o meio de digestão por uma a duas horas, a 37 graus em um incubador com agitação. Quando a solução de digestão do tecido apresentar aparência turva e os vasos sanguíneos brancos forem visíveis na solução, adicione 15 mililitros de HBSS para diluir as enzimas no meio de digestão. Faça uma centrifugação rápida das amostras, apenas até que a centrífuga atinja 340 g por cinco segundos, e então pare.

Isso fará com que os detritos maiores se acumulem na parte inferior do tubo. Retorne as amostras para a cabine de segurança biológica. Coloque um filtro celular em um novo tubo de 50 mililitros.

Pipete o sobrenatante contendo as células mononucleares para dentro do filtro, recolhendo o eluato no novo tubo. Deixe os resíduos de tecido placentário para trás no primeiro tubo. Adicione 15 mililitros de HBSS aos resíduos placentários, agite vigorosamente para recuperar mais células e faça uma centrifugação rápida da amostra.

Novamente, pipete o sobrenatante para o tubo com o filtro celular no tubo de coleta. Derramar o sobrenatante no filtro celular pode ser mais adequado, dependendo da consistência da amostra. Lave o filtro celular com 5 mililitros de HBSS.

Descarte o tubo contendo os detritos de tecido placentário. Centrifugue a amostra do sobrenadante por cinco minutos a 340 g para obter o pellet celular. Os eritrócitos são visíveis como uma camada na parte inferior do pellet, e as células mononucleares, incluindo as CMMs, formam a camada mais clara acima dos eritrócitos.

Retorne as amostras para a cabine de segurança biológica. Decante cuidadosamente o sobrenadante e descarte-o. Agite o tubo várias vezes com o dedo para soltar o pellet celular e re-suspenda o pellet celular em 35 mililitros de meio para MSC.

Transfira a suspensão celular para um frasco T175 para cada 10 mililitros de tecido e cultive em uma incubadora a 37 graus com 5% de CO₂. Após o isolamento, troque o meio de cultura após 48 horas. Alimente as culturas uma vez por semana até atingirem confluência.

Os cultivos devem atingir confluência em aproximadamente 14 dias. Por fim, expanda e criopreserve as células, analise as características das CMM e utilize-as em experimentos. Após 48 horas de cultivo, as CMM terão se aderido ao plástico de cultura de tecidos, enquanto as populações de células hematopoéticas e outras não terão aderido.

Neste momento, o meio é substituído por 35 mililitros de meio de cultura fresco. A aparência do sobrenadante da cultura pode variar significativamente entre doadores de placenta. O exemplo um e dois demonstram essa variação.

Esses dois isolamentos foram realizados simultaneamente, mas a partir de duas placentas diferentes. Após a lavagem, as culturas estão livres de hemácias e detritos teciduais, conforme mostrado no exemplo três, e os resultados subsequentes de expansão são geralmente consistentes. Após a troca do meio em 48 horas, apenas algumas células estão aderidas ao frasco.

Sete dias após o isolamento, colônias de MSCs fibroblásticas são visíveis, embora células não MSC também estejam presentes, como células redondas ou fracamente aderidas. Treze dias após o isolamento, as colônias de MSCs fibroblásticas são grandes, e muitas vezes o monocamada de MSCs está suficientemente confluente e pronta para ser subcultivada. A partir da primeira subcultura em diante, o monocamada de MSCs desenvolve uma morfologia característica semelhante a um redemoinho na confluência.

As CEM da placenta exibem um perfil clássico de marcadores de CEM por análise de citometria de fluxo. As células são positivas para CD73, CD105 e CD90, e negativas para os marcadores hematopoiéticos CD45, CD34 e HLA-DR. As CEM da placenta geralmente sofrem uma diferenciação osteogênica robusta, mas uma diferenciação adipogênica fraca.

Muitas publicações assumem que células isoladas do córion fetal produzem MSC fetal após o cultivo. No entanto, como relatamos anteriormente, todos os cultivos derivados do córion fetal utilizando este protocolo tornam-se rapidamente enriquecidos por MSC materna, como seria esperado para os cultivos de MSC decidual materna. Os dados apresentados aqui quantificam a composição celular fetal e materna dos cultivos de MSC placentários isolados de tecidos decíduais, vilosidades coriônicas e placa coriônica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como isolar e cultivar CMM derivadas de tecido placentário. Esperamos que esses métodos sejam úteis em suas pesquisas e aplicações clínicas que possam utilizar CMM derivadas da placenta.