Name: Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela Burnetii Coxiella Durante siRNA silenciamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a usar silenciamento de siRNA e ensaio reporter FRET para estudar translocação de efetores bacterianos em células eucariotas. Este método revela mecanismos de interação patógeno-hospedeiro em microbiologia celular.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Health and Medical Research Council (NHMRC) (Grant ID 1062383 e 1063646) concedidos ao HJN. A EAL é apoiada por um Prêmio Australiano de Pós-Graduação.

Os autores não têm nada a divulgar.

sistemas de secreção, e as proteínas efectoras bacterianas estes sistemas de transporte para o citoplasma das células hospedeiras, são um componente importante de virulência que muitas bactérias patogénicas utilizar para estabelecer uma infecção em nichos replicativas exclusivos. O foco de muitos grupos de pesquisa foi investigar a interação entre efetores bacterianas e proteínas do hospedeiro e a influência destes efectores têm sobre as vias celulares do hospedeiro. pesquisa muito limitada, se alguma, examinou o potenc...

Coxiella burnetii é um patógeno intracelular único que faz com que a febre Q infecção humana zoonótica. Esta doença está associada a um largo espectro de apresentações clínicas que se prolongam a partir de seroconversão assintomática para infecção crónica com risco de vida que frequentemente se manifesta como endocardite anos após a exposição 1. A infecção humana ocorre principalmente através da inalação de aerossóis contaminados com ruminantes o principal reservatório para infecção, em particular, vacas leiteiras, ovelhas e cabras. Embora a infecção por Coxiella nestes animais é normalmente subclínicas, a infecção pode desencadear o aborto e a carga bacteriana considerável dentro do fluido de parto e da placenta podem contaminar o ambiente local 1. Um exemplo da enorme carga tal contaminação pode ter sobre a saúde pública e indústria da agricultura foi observada recentemente no surto de febre Q que ocorreu na Holanda 2. Entre 2007 e2010, mais de 4.000 casos humanos de febre Q foram diagnosticados e este surto estava ligada à contaminação significativa de cabra cultiva 3. Além disso, Coxiella é uma potencial arma biológica, como classificado pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças, devido à estabilidade ambiental das bactérias e de baixa dose infecciosa necessária para causar morbidade e mortalidade 4 grave. Coxiella existe em duas fases: Fase I organismos, isoladas de fontes naturais, são extremamente virulenta e Fase II organismos são altamente atenuado in vivo. Por exemplo, depois de várias passagens in vitro em Coxiella burnetii de nove milhas Fase I organismos, bactérias em fase II foram produzidos que contêm uma deleção cromossómica irreversível resultando em lipopolissacárido truncada (LPS) 5. Esta linhagem, C. burnetii NMII, é fenotipicamente semelhante à Fase I em modelos de cultura de tecidos e fornece um modo mais segurol para os investigadores a estudar patogênese Coxiella em laboratórios 5. Nos últimos anos, vários avanços têm avançado rapidamente no campo da genética Coxiella. Mais notavelmente, o desenvolvimento de meios axénica (acidificada forma cisteína citrato - ACCM-2) permitiu o crescimento isento de células de Coxiella em líquidos e sólidos em meios de 6,7. Isto resultou na melhoria directa de ferramentas genéticas disponíveis para Coxiella, incluindo um sistema de expressão indutível de genes, vectores de transporte e sistemas de transposões aleatórios 8-11. Mais recentemente, dois métodos para a inativação do gene alvo também foram desenvolvidos, abrindo o caminho para examinar os candidatos de genes de virulência específicos 12. Após internalização por macrófagos alveolares, Coxiella replica para números elevados dentro de um compartimento ligado à membrana denominado o Coxiella- contendo vacúolo (CCV). O CCV requer tráfico endocítica hospedeiro thásperas precoces e tardias endossomas até que amadurece em uma organela derivados do lisossoma 13. Ao longo deste processo, o CCV adquire factores do hospedeiro que quer aparecer transitoriamente ou permanecer associado com o vacúolo, incluindo, mas não limitado a, Rab5, RAB7 proporcionou, CD63 e LAMP-13-15 janeiro. A replicação de Coxiella dentro das células hospedeiras é inteiramente dependente de um Dot / Icm Tipo IVB Secreção sistema totalmente funcional (T4SS) 8,16,17. Este sistema de secreção seja uma estrutura multi-proteína ancestral relacionada com sistemas de conjugação e abrange ambas as membranas bacterianas e vacuolares para administrar proteínas bacterianas, denominado efectores, para o citoplasma de acolhimento 18. O Coxiella T4SS é funcionalmente muito semelhante ao tipo IVB Dot / Icm sistema de secreção bem caracterizado de Legionella pneumophila 19,20. Curiosamente, a activação do T4SS e subsequente translocação efector não ocorre até que atinge o lisossoma Coxiella derivada ácidaorganela, aproximadamente 8 horas pós-infecção 17,21. Até à data, mais de 130 effectors Dot / ICM foram identificados 9,17,22-24. Muitos destes efectores provavelmente desempenham um papel importante durante a replicação de Coxiella dentro das células hospedeiras; no entanto, apenas alguns efetores foram caracterizados funcionalmente 25-29. Neste estudo nós utilizamos um ensaio de fluorescência com base translocação que se baseia na clivagem do substrato CCF2-AM FRET (daqui em diante referido como o substrato BlaM) através da actividade β-lactamase dentro do citoplasma da célula hospedeira (Figura 1). O gene de interesse é fundida com a TEM-1 β-lactamase (BlaM) em um plasmídeo repórter que proporciona a expressão constitutiva. O substrato BlaM é composto por dois fluoróforos (cumarina e fluoresceina) que formam um par de FRET. Excitação da cumarina resultados em FRET da fluoresceína e emissão de fluorescência verde na ausência de translocação efectora; No entanto, se o Blaproteína de fusão M-efectora é translocado para dentro do citoplasma de acolhimento, a resultante β-lactamase cliva o anel de actividade β-lactama do substrato BlaM, separando o par de FRET produzindo emissão de fluorescência azul seguinte de excitação. Este ensaio de translocação foi bem comprovada como uma abordagem para identificar proteínas efectoras a partir de uma gama de diferentes bactérias intracelulares e extracelulares, incluindo C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, E. enteropatogênica coli, Salmonella e Brucella 17,30-35. Para determinar o papel dos factores do hospedeiro específicas sobre Coxiella efetoras translocação nós utilizamos um método bem estabelecido para o silenciamento do gene conhecido como interferência de RNA, em particular as pequenas interferência RNA (siRNA). Originalmente identificado em Caenorhabditis elegans, a interferência RNA é um processo celular endógena conservada usado para defe inataNSE contra vírus, bem como do gene regulação 36,37. Após a ligação do siRNA específica da sequência, a degradação de ARNm ocorre através RISC (induzida por complexo de ARN de silenciamento) resultando no silenciamento de genes específicos ou knockdown 38. Neste estudo, siARN foi usada para alvejar duas proteínas do hospedeiro, e Rab5A Rab7A, que são reguladores importantes da via endocítica. O impacto de silenciar Rab5A e Rab7A na translocação efetoras foi determinada segundo C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 foi selecionado como foi mostrado anteriormente para ser translocado pelo sistema de secreção de Dot / Icm de Coxiella 17. Utilizando tanto o silenciamento do gene siRNA e no ensaio de translocação fluorescencebased descrito aqui, estamos começando a estabelecer um papel para fatores do hospedeiro na translocação de proteínas efetoras por Coxiella. Esta abordagem pode ser aplicada a uma vasta gama de bactérias tanto intracelulares e extracelulares que possuem secretio semelhantesistemas n responsáveis ​​pela translocação de proteínas efectoras.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio</td><td>Sigma</td><td>60218</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Calbiochem</td><td>442611</td><td>ACCM-2 meio componente</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Sulfato de ferro</td><td>Fisher</td><td>S93248</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>C6852</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Bacto-neopeptona</td><td>BD</td><td>211681</td><td>ACCM-2 meio componente</td></tr><tr><td>Casamino ácidos</td><td>Fisher</td><td>BP1424</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Metil beta ciclodextrina</td><td>Sigma</td><td>C4555</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>RPMI + Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-036</td><td>ACCM-2 componente médio</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Para cultura bacteriana</td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Controle sem direcionamento Pool (OTP)</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10-05</td><td>Controle não direcionado</td></tr><tr><td>siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-003290-01-005</td><td>Causa morte celular; medida da eficiência da transfecção</td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-004009-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td><td>Dharmacon</td><td>M-010388-00-0005</td><td></td></tr><tr><td>5x tampão siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>B-002000-UB-100</td><td>Use água estéril sem RNase para diluir 5x tampão siRNA para 1x tampão siRNA</td></tr><tr><td>DharmaFECT-1 Reagente de Transfecção Dharmacon</td><td></td><td>T-2001-01</td><td>Para transfecção</td></tr><tr><td>Opti-MEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51985-034</td><td>Meio de soro reduzido usado para transfecção</td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10567-014</td><td>Para cultura de células e infecção</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro inativado por calor (FCS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Pode usar produto equivalente alternativo</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Para armazenamento de cepa de Coxiella</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina + EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-054</td><td>Para cultura de células</td></tr><tr><td>dH2O</td><td></td><td></td><td>Para diluição de amostras e padrões para qPCR</td></tr><tr><td>Quick-gDNA Mini Prep</td><td>ZYMO Research</td><td>D3007</td><td>Pode usar produto equivalente alternativo para extrair gDNA</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-98020</td><td>Pode usar produto master mix qPCR equivalente alternativo para reação qPCR</td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Kit de carregamento com CCF2-AM</td><td>Invitrogen</td><td>K1032</td><td>Para medição de translocação usando fluorescência e geração da solução de carga 6X (contém Solução A, B, C e DMSO)</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Merck</td><td>106469</td><td>Componente da solução de probenicida</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>71505</td><td>Componente da solução de probenicida</td></tr><tr><td>hidrogenoortofosfato de sódio</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>Solução de probenicida componente</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Sigma</td><td>P8761</td><td>Solução de Probenicid componente</td></tr><tr><td>DRAQ5 Solução de Sonda Fluorescente (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62251</td><td>Coloração de núcleos para determinar a viabilidade celular. Use 1:4000 diluído em PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de PFA (paraformaldeído) a 4% em PBS</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>Solução de fixação para células HeLa 229</td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos de 25 cm2 com tampa ventilada</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Para crescimento de cepa bacteriana</td></tr><tr><td>96 Microplacas tratadas com TC de poliestireno preto de fundo transparente bem plano, embaladas individualmente, com tampa, estéreis</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos de 75 cm2 com tampa ventilada</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>Para crescimento de células HeLa 229</td></tr><tr><td>Balão de cultura de tecidos de 175 cm2 com tampa ventilada</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>Para crescimento de células HeLa 229</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td>Para quantificação de células HeLa 229</td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 poços Tear-A-Way</td><td>4titude</td><td>4ti-0750/TA</td><td>Para qPCR reação</td></tr><tr><td>8-Cadeia de tampas, plana</td><td>Sarstedt</td><td>65.989.002</td><td>Para reação qPCR</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfífuga</td><td></td><td></td><td></td> de bancada</tr><tr><td>Centrífuga</td> orbital <td>Eppendorf</td><td>5810 R</td> do <td></td></tr><tr><td>misturador</td><td></td><td></td><td></td>do</tr> <tr><td>vórtice</td><td></td><td></td><td></td>do tampo</tr> da bancada Para a cultura bacteriana da peletização <tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td>Para a máquina da quantificação do gDNA</td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR</td><td>Aligent Technologies</td><td>401456</td><td>Para a quantificação de genomas da Coxiella na microplaca de ClarioSTAR da cultura de 7 dias</td></tr><tr><td> leitor</td><td>BMG LabTech</td><td></td><td>Para medição de fluorescência</td></tr></tbody></table>

aplicando transferência de ressonância de fluorescência energia (fret) para examinar eficiência effector translocação pela<em&gt; burnetii coxiella</em&gt; durante sirna silenciamento

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, o agente causador da febre Q, é um patógeno intracelular que se baseia em um IV Dot / Icm Secreção Sistema Tipo de estabelecer um nicho replicativo. Uma coorte de efectores são translocados através deste sistema na célula hospedeira para manipular processos de acolhimento e permitir a criação de um único vacúolo derivadas de lisossoma para replicação. O método aqui apresentado envolve a combinação de duas técnicas bem estabelecidas: o silenciamento do gene específico utilizando siRNA e medição de translocação efectora utilizando um substrato baseado em TERF que se baseia na actividade β-lactamase. Aplicando estas duas abordagens, podemos começar a compreender o papel dos factores do hospedeiro em função do sistema de secreção bacteriana e translocação efetoras. Neste estudo nós examinamos o papel dos reguladores importantes da via de tráfico endocítica Rab5A e Rab7A, ambos. Nós demonstramos que silenciar a expressão de qualquer proteína resulta em uma diminuição no translocatio efectoraeficiência n. Estes métodos podem ser facilmente modificados para examinar outros agentes patogénicos intracelulares e extracelulares que também utilizam sistemas de secreção. Desta forma, uma imagem global dos factores do hospedeiro envolvidos na translocação bacteriana efetoras podem ser revelados.

Para este estudo, a C. burnetii pBlaM-CBU0077 estirpe foi seleccionada como CBU0077 tem sido mostrado previamente para ser um efector translocado do sistema de secreção de Coxiella Dot / Icm 17. Antes da infecção, o número total de genomas / ml no sete dias C. cultura burnetii pBlaM-CBU0077 foi enumerada utilizando qPCR. A Figura 4 demonstra um exemplo do ciclo limiar (Ct) valores esperados a partir de ambos os padrões e as ...

Investigar as interações entre patógenos bacterianos e seus hospedeiros é uma importante área de pesquisa biológica. Aqui, descrevemos as técnicas necessárias para medir efetoras translocação por Coxiella burnetii durante o silenciamento do gene siRNA usando substrato BlaM.

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

O objetivo geral deste procedimento experimental é examinar o impacto de processos específicos do hospedeiro na capacidade de patógenos bacterianos translocarem proteínas efetoras. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da microbiologia celular. Especificamente, como o hospedeiro participa na inibição ou promoção da entrega de efetores de virulência bacteriana para dentro da célula hospedeira.A principal vantagem desta técnica é que ela combina dois métodos estabelecidos, a saber, o silenciamento gênico por siRNA e o ensaio de repórter para medir a translocação de proteínas bacterianas, a fim de investigar a interação entre patógenos e a célula eucariótica.Este método fornece informações sobre a patogênese de Coxiella e também pode ser aplicado para investigar as interações entre patógenos e hospedeiros de outras bactérias que dependem da translocação eficiente de proteínas. Por exemplo, Chlamydia, Salmonella e Escherichia coli aderente e efasante. Após o cultivo de C. burnetii expressando CBU0077, una a betalactamase de acordo com o protocolo descrito no texto em um frasco de cultura de 25 centímetros quadrados com tampa ventilada.Inocule 10 mililitros

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Descrevemos aqui um método para visualizar retículo endoplasmático associadas mRNAs em células de cultura de mamífero de tecidos. Esta técnica envolve a permeabilização selectiva da membrana plasmática com digitonina para remover conteúdo citoplasmático seguido...

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Análises de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector translocação em células hospedeiras Usando Beta-lactamase Effector Fusions

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