Name: Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda a implantar cânulas e bombas osmóticas para infundir oligômeros de beta-amiloide e testar tratamentos para doença de Alzheimer, como imunoterapia, em modelo animal.

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Agradecemos a Caroline Bouchard, da biotérica, pelo trabalho com ratos. A.S. possui uma bolsa de mestrado J.A. De Sève e B.P. uma bolsa COPSE da Université de Montréal Este trabalho foi financiado por doações atribuídas a J.B. da FRQS-Pfizer e fundos iniciais do Centro de Pesquisa Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal.

Declaração de ética: O protocolo de animais para este projecto obteve a aprovação do Comitê de Cuidados Animal do Hospital Sacré-Coeur de Montreal, em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care. 1. Cateter Preparação antes da cirurgia estereotáxica <ol><li> Cortar cateteres PE50 (6 cm de comprimento) que serão utilizados para ligar a cânula com bombas osmóticas (ver Figura 1A). Preencha cateteres PE50 com fluido cerebrospinal artificial (aCSF) e selar ambas as extremidades dos cateteres. Manter o cateter a 4 ° C até ser utilizado. </li></ol> 2. Cânula Implantação por estereotaxia <ol><li> Realizar a cirurgia em condições estéreis. Esterilizar todos os instrumentos e materiais cirúrgicos por autoclavagem. Limpar o aparelho estereotáxico e a área de trabalho completamente, e desinfectado com uma solução de etanol a 70%. Usar uma máscara cirúrgica, gorro cabelo e luvas estéreis.</li><li> Anestesiar ratos por injecção intraperitoneal (ip) de uma solução de cetamina e xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente). Confirmar anestesia, verificando movimento após uma pitada toe suave. </li><li> Injectar um não-esteróide anti-inflamatório (meloxicam; 1 mg / kg) por via subcutânea (SC) para o animal anestesiado, pelo menos, 30 minutos antes da cirurgia. </li><li> Raspar a cabeça do animal usando cortadores e desinfectar a pele com uma solução de gluconato de clorexidina 2% e álcool isopropílico 2% três vezes. Aplicar pomada oftálmica veterinária nos olhos para evitar a secura e sob anestesia. </li><li> Colocar o animal em um quadro estereotáxico com as barras de ouvido. Corrigir uma cânula no braço titular do quadro estereotáxico. Injectar (sc), um agente anestésico local (bupivacaína (1,5 mg / kg) e lidocaina (1,5 mg / kg) sobre a parte superior da cabeça. A anestesia é mantém durante todo o procedimento de colocação de um cone de nariz proporcionando 3% de isoflurano. A totalidade campo cirúrgico deve serenvolto off, mas não foi feito aqui para melhor demonstrar a técnica. </li><li> Fazer uma incisão de 3 cm na parte superior da cabeça com um bisturi. Instalar 4 grampos ao redor da incisão para deixar o crânio clara. Usando uma tesoura round-ponta, fazer um bolso (2 x 2 cm2) sob a pele entre as omoplatas do animal. </li><li> Raspar o periósteo do crânio com uma lâmina. Aplique uma compressa de gaze sobre o crânio se o sangramento. </li><li> Verifique se o crânio é plana e bem alinhados no quadro estereotáxico. Para se certificar de que o crânio é plana, verificar a altura coordena no bregma e ao lambda. Aqui as coordenadas do bregma que vai ser utilizado como ponto de referência. </li><li> A partir da bregma, calcular as coordenadas dos dois cânula guia que serão implantados bilateralmente no hipocampo (anteroposterior: - 0,42 centímetros; mediolateral: ± 0,30 cm; dorsoventral: - 0,28 cm de acordo com o atlas de cérebro de rato em Paxinos e Watson) 29 . indicar oposição da cânula com um marcador. </li><li> Perfurar um furo (0,5 mm) no crânio no ponto de implantação de cânula ambos. Faça dois outros buracos de aproximadamente 5 mm acima e abaixo desses pontos para inserir parafusos que irá solidificar a cânula ao aplicar cimento dental. </li><li> Cortar uma extremidade do cateter previamente enchido com aCSF com um bisturi, e inseri-lo no braço angular da cânula. Fixar a primeira cânula com cimento dental. Evitar colocar cimento dental ao redor da posição no segundo cânula. </li><li> Deixe o dental cimento seco para 2-3 min, em seguida, retire o braço de suporte a partir do primeiro cânula, e fixar a segunda cânula nele. Repita os passos 2.11 e 2.12. Coloque cânula manequim em ambos cânula guia. Certifique-se de que a cânula guia manequim e são do mesmo comprimento para evitar a infiltração do tecido e impedindo a cânula. </li><li> Inserir a extremidade livre de ambos os cateteres no bolso feito anteriormente entre as omoplatas do animal. Retirar as braçadeiras e costurar a pele com umafio de sutura 4-0. NOTA: A cânula guia superior precisa estar acessível para os próximos infusões Aβo. </li><li> Remover o animal a partir do quadro estereotáxico e colocá-lo de volta em sua gaiola. Durante a recuperação pós-cirúrgica, colocar a gaiola em um cobertor aquecimento de água até que o animal acorda. A gaiola deve ser parcialmente no bloco de modo que o rato pode afastar-se do calor, se necessário. Monitorar o animal constantemente até que recupere a consciência suficiente para manter decúbito esternal. </li><li> Voltar ratos ao biotério para se recuperar da cirurgia durante 10 dias sob acompanhamento de perto. NOTA: Não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Meloxicam (1 mg / kg) é administrado uma vez por dia durante dois dias após a cirurgia para tratar a dor. </li></ol> Instalação 3. osmótica bomba <ol><li> Um dia antes da instalação, encher bombas osmóticas com anticorpo 6E10 (1 mg / mL; 100 uL) e IgG1 de controloanticorpo (1 mg / mL; 100 uL) de acordo com as instruções do fabricante sob condições estéreis. Manter as bombas em água destilada estéril a 37 ° C durante a noite para activar bombas. </li><li> Anestesiar ratos com isoflurano 3% para instalar bombas osmóticos (0,5 ul / h durante 7 dias). Raspar entre as omoplatas e desinfectar a pele com uma solução de gluconato de clorexidina e 2% de álcool isopropílico a 2%. Realizar uma incisão de 2 cm com um escalpelo entre as omoplatas para localizar os cateteres PE50 ligado à cânula guia. </li><li> Cortar a extremidade dos cateteres PE50 contendo cimento dental com um bisturi. Ligue as bombas osmóticas para os cateteres PE50, e adicionar um pouco de cimento dental na junção da bomba e cateter para proteger a conexão. </li><li> Costurar a pele firmemente com um fio de sutura 4-0. Coloque a parte traseira animal em sua gaiola em uma almofada de aquecimento de água. Observar o despertar dos animais se rapidamente de uma anestesia isoflurano (cerca de 5 min). NOTA: A cirurgia leva approdamente de 5 a 10 min. </li></ol> 4. Infusões Aβo em Awake e ratos movimentando-se livremente <ol><li> Preparar a solução de Aβo (0,2 ug / uL) tal como anteriormente relatado. Permitir 28,30 Aβo para se agregar de forma dinâmica e espontaneamente durante 1 hora à temperatura ambiente antes da infusão. </li><li> Instale duas seringas de 10 ul de uma bomba de infusão. Encher as seringas com 5 uL de água estéril destilada. Corte dois cateteres PE50 a cerca de 60 cm de comprimento com um bisturi. Preencha ambos os cateteres com água destilada estéril usando 1 ml seringas e agulhas 21G. </li><li> Manter as seringas de 1 ml numa extremidade do cateter e ligar a outra extremidade para as seringas de Hamilton. Retire as seringas de 1 ml e verificar que não há bolhas de ar dentro dos cateteres. </li><li> Inserir uma cânula interna no final do cateter PE50. O uso de água destilada estéril, preencher a cânula interna ligada a cateteres PE50-se para 1 mL de seringas Hamilton. Faça uma bolha de ar por pulling para trás o pistão de até 2 l. </li><li> Misturar a solução Aβo pipetando cima e para baixo usando a ponta do mínimo de adesão. Evitar a formação de bolhas durante a mistura. Preencha ambos cânula interna com 1,5 ml de solução Aβo puxando para trás o pistão até 3,5 mL. </li><li> Adicione linhas com um marcador antes e após a bolha de ar feito em ambos os cateteres. Isto serve como um ponto de verificação de infusão contínua. Para perfusão, trazer a gaiola perto da bomba de infusão e remover sua capa. </li><li> Coloque o rato em um snuggle e firmemente raspar o braço do snuggle em torno de seu pescoço para imobilizar a cabeça do rato. Remover cânula manequim da cânula dois guia. Inserir a cânula interna previamente preparada na cânula guia. Verificar que eles estão completamente inseridos e bem fixo à base da cânula guia. </li><li> Solte rato do snuggle e colocá-lo de volta em sua gaiola para limitar o estresse contenção. Acompanhar de perto para garantir que os cateteres não torça togetela e a infusão é feito corretamente. </li><li> Ligar a bomba de infusão. Injectar 1 ul de solução Aβo a uma velocidade de 0,1 ul / min (10 min). Durante a infusão, verificar que o êmbolo da seringa se desloca de 3,5 uL e 2,5 uL, e de que a bolha de ar em ambos os cateteres PE50 mover continuamente. </li><li> Deixar a cânula interna no lugar durante mais 5 min após a infusão para permitir a difusão eficiente de solução Aβo. Traga o rato volta no aconchegar para remover cânula interna e uma cânula guia tapado para evitar o refluxo da solução injetadas. Use cânula dummy que parar um pouco antes do braço ângulo da cânula. Devolver o animal em sua gaiola. </li><li> Repetir a perfusão Aβo uma vez por dia durante 6 dias consecutivos. Eutanásia do animal por decapitação. </li></ol>

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A publicação deste vídeo-artigo é patrocinada pela ALZET Osmotic Pumps.

Há passos críticos dentro deste protocolo que exigiam uma atenção especial. Quando a implantação da cânula, evite colocar cimento dental quando está muito líquido para evitar o bloqueio do buraco da segunda cânula. É importante colocar cimento dental na extremidade livre do cateter P50 ligado à bomba para evitar a irritação e um possível resposta inflamatória. No dia da cirurgia estereotáxica, usar cânula manequim que são do mesmo comprimento que a cânula guia a fim de evitar o bloqueio de uma cânula. No entanto, depois de instalar bombas de usar mais curto cânula manequim que parar antes do braço angular da cânula para permitir a infusão adequada da solução a partir da bomba para o hipocampo. Acompanhar de perto infusões Aβo e verificar se a bolha de ar feito em cateteres está se movendo de forma contínua durante as infusões. Certifique-se sempre que a cânula injetar está completamente inserida na cânula guia durante infusões. Se o problema é o encontro durante a infusão de Ap, Verifique se a cânula interna não está bloqueado. Se for o caso, lavagem com água destilada estéril através da cânula interna. Se a cânula guia está obstruído, vire a cânula interna na cânula guia. Caso contrário mover a cânula interna cima e para baixo. Contenção no snuggle pode ser estressante para os ratos, especialmente no primeiro dia. Para diminuir o stress do animal, recomendamos para manipular e habituar ratos ao snuggle antes da cirurgia estereotáxica. Muitas vantagens podem ser atribuídas a este novo e flexível na abordagem in vivo. De fato, a natureza do Aβo injectado pode ser controlar com precisão antes da infusão, e vários tipos de preparações de Ap (por exemplo sintético vs soluções Ap derivado do cérebro) pode ser injectado para avaliar a sua neurotoxicidade in vivo. Este modelo também pode ser utilizado para investigar os mecanismos pelos quais várias espécies de Ap (por exemplo, monómeros, de baixa e alta massa molecular oligomers, protofibras) pode induzir efeitos neurotóxicos in vivo, e como tratamentos como a imunoterapia pode neutralizar seu impacto deletério no cérebro. Uma vez que as infusões são executar em, animais livremente em movimento acordado, não há efeitos de confusão entre os agentes anestésicos e a solução Aβo em vias de sinalização, conforme demonstrado em estudos anteriores. 32,33 Infusões em movendo-se livremente animais são também compatível com testes comportamentais qualquer tempo antes e após as infusões. Infusões de Aβo e instalação da bomba pode ser feito em animais de idades diferentes para determinar os efeitos de tratamentos Aβo e durante o envelhecimento. Uma vez que a neurodegeneração ocorre na vizinhança do local de infusão, sinapse e perda neuronal pode ser induzida em diferentes regiões do cérebro e localizadas. A infusão garantia de Aβo e controle (veículo ou precipitação de Ap) permite controlar qualquer mudança dentro do mesmo animal. Por outro lado, Aβo ou controlo Soldoras podem ser injectados bilateralmente no hipocampo direito e esquerdo, por exemplo ao testar animais em tarefas comportamentais. A infusão de Aβo e tratamento pode ser feito simultaneamente ou, alternativamente, as bombas podem ser instalados após a infusão Aβo para avaliar se o tratamento é eficaz após a deposição de Ap. O mesmo protocolo descrito aqui pode também ser utilizado quando se faz infusões intracerebroventricular de Aβo. O efeito de Aβo em vias de sinalização intracelular pode ser avaliada antes e após a perda neuronal dentro de um período de tempo razoavelmente curto. A dose e o número de infusões de Ap também pode ser ajustada para se obter uma mais ou menos grave Ap patogenicidade. Embora muito versátil, esta técnica tem algumas limitações. implantação da cânula produz uma ruptura mecânica do tecido e neuroinflamaï¿½o nos primeiros dias após a cirurgia. Assim, é essencial que esperar pelo menos uma semana após a cirurgia antes de iniciar Aβo INFUsion, e para adicionar controles adequados (injecção de veículo ou corrida inativo Ap) a ter em conta esses eventos. Além disso, apenas um pequeno volume de Aβo pode ser infundido para limitar a difusão da solução. As bombas osmóticos representam um método de entrega conveniente e exclusivo para validação pré-clínica de agentes destinados a prevenir a neurodegeneração induzida por Aâ. Uma vez que a imunoterapia com o anticorpo 6E10 foi mostrado anteriormente para diminuir a acumulação de Ap no cérebro, 31 utilizou-se o anticorpo 6E10 como uma prova de conceito para validar a nossa nova abordagem in vivo. A utilizado de bombas osmóticas neste modelo pode agora ser utilizado para desenvolver novas terapias modificadores da doença que pudesse evitar a deposição e de neurotoxicidade Aβo em pacientes com AD pré-clínicos.

Foi inicialmente proposto que a acumulação de espécies de Ap insolúveis no cérebro foi central para AD patogênese. 1,2 No entanto, placas amilóides também são detectados em algumas cognitivamente normais idosos. 3-7 Para superar a fraca correlação existente entre as deposições de placa e déficits cognitivos em AD, recentes relatórios demonstraram a presença de Aβo solúvel tóxico no início da doença, que se correlacionam muito melhor com o estado clínico dos pacientes. 8-14 Uma vez que o processo de Ap oligomerização é muito dinâmico, sugeriu-se que a neurotoxicidade é induzido por vários Aβo em vez de apenas um tipo específico de oligómero. 14-16 uma vez que muitos estudos têm mostrado que Aβo pode iniciar disfunções sinapse antes da sinapse e perda neuronal, 17-24 teorias actuais indicam que o tratamento relacionadas com Ap pode ser eficaz em AD cedo do que em fases posteriores como testado até agora em ensaios clínicos. Uma característica característica da AD patogênese é a morte maciça e generalizada de células observadas nos últimos estágios da doença, e da sinapse significativo e perda neuronal observada em regiões cerebrais localizadas quando os déficits de memória se tornar detectável no nível clínico. A via perfurante que se projeta a partir do córtex entorrinal (CE) no giro denteado (DG) é perturbado acentuadamente no início precoce da AD 25,26. Durante o estado prodromal da AD quando comprometimento cognitivo leve (MCI) torna-se a morte celular significativa aparente é detectado na CE, bem como perda sináptica no DG 25,26. Apesar de um grande corpo de evidências identificou a ação tóxica de Aβo solúvel em AD cedo, 8-14 neurodegeneração induzida Aβo observado na cultura neuronal ou a cultura fatia do cérebro organotï¿½ica tem sido mais difícil de reproduzir em modelos animais 27. A maior parte da AD transgênico modelos com superexpressão Aβ tem placas amilóides, hiperfosforilação tau, deficiência sináptica e déficits de memória. 27 No entanto, estes modelos têm sido muito menos bem sucedido na morte celular modelagem observado no hipocampo de pacientes com DA. Para superar esses problemas técnicos, desenvolvemos um modelo baseado em infusões intracerebrais de Aβo solúvel. Nós relatado anteriormente que repetiu infusões hipocampo de Aβo solúvel induzir a perda neuronal gradual e hiperfosforilação tau, duas características patológicas associadas com o declínio da memória em AD. 28 Aqui, nós estamos mostrando um novo método para testar AD terapias usando cânula especialmente desenhado para infusões simultâneas de Aβo e infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) com bombas osmóticas. As bombas osmóticas fornecer uma forma única para testar in vivo a eficácia de qualquer anticorpo (ou outros compostos) contra a neurodegeneração induzida por Aβo directamente no local da infusão de Aβo. Assim, estas bombas represent uma ferramenta conveniente para estabelecer um sólido à prova de conceito sobre os mecanismos de acção de agentes terapêuticos potenciais na AD. Desde os relatórios recentes salientam o impacto crítico de Aβo solúveis nas fases iniciais da AD, muitos tratamentos dirigidos a Aβo está efectivamente a ser testado por laboratórios académicos e farmacêuticas. Este romance modelo animal permite imitar a perda sináptica e neuronal observado em AD cedo, e bombas osmóticos são utilizados para infundir continuamente agentes de tratamento especificamente no local de infusão a Aβo. As falhas repetitivas de terapias AD testados ao longo dos últimos anos em leve a moderada pacientes conforme solicitado pesquisadores para iniciar ensaios clínicos em doentes pré-demência antes Aβo começam a se acumular em abundância e gerar danos cerebrais irreversíveis. Neste contexto, o teste de novos compostos que impeçam a deposição e consequentemente a neurotoxicidade de Aβo pode ser de interesse em pacientes pré-clínicos.

<table><tbody><tr><td>Líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF)</td> <td>Harvard Apparatus</td><td>59-7316</td><td></td></tr><tr><td>PE 50 Cateter de parede fina</td><td>Plásticos um</td><td>C232CT</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina (100 mg / ml)</td> <td>Bioniche</td><td>1989529</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de xilazina (100 mg / ml)</td> <td>Bimeda</td><td>8XYL004C</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (5 mg / ml)</td> <td>Norbrook</td><td>215670I01</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gluconato de clorexidina 2% e álcool isopropílico 2%</td><td>Carefusion</td><td>260100C</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de lidocaína</td><td>Alveda Pharma</td><td>0122AG01</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de bupivacaína</td><td>Hospira</td><td>1559</td><td></td></tr><tr><td>pomada oftálmica</td><td>Baussh and Lomb inc.</td><td></td><td></td>2125706</tr><tr><td>quadro estereotáxico</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>braço porta-cânula estereotáxica</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-4837</td><td></td></tr><tr><td>Broca</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Cânula Guia</td><td>Plásticos uma</td> Cânula de Injeção <td>326OPG/spc</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Plásticos uma Cânula</td> Fictícia <td>C315I/spc</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Plásticos um</td><td>C315DC/spc</td><td></td></tr><tr><td>Sutura revestido com fio vicryl rapide 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VR2297</td><td></td></tr><tr><td>Dental Acrílico</td><td>Cimento Harvard Apparatus</td><td>72-6906</td><td></td></tr><tr><td>Parafusos</td><td>JI Morris Company</td><td>P0090CE125</td><td></td></tr><tr><td>6E10 anticorpo (isotipo IgG1 de camundongo)&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803003</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1 anticorpo de controle de isotipo</td><td>Abcam</td><td>AB18447</td><td></td></tr><tr><td>Alzet bombas osmóticas modelo 1007D</td><td>Durect corporation</td><td>290</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>CA2L9100</td><td></td></tr><tr><td>Amilóide-beta 1-42&nbsp;</td><td>rPeptídeo</td><td>A-1163-1</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Hamilton (10 &micro; l)</td> Bomba de seringa de infusão <td>Fisher Scientique</td><td>14815279</td><td></td></tr><tr><td>CMA 402</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CMA8003110</td><td></td></tr><tr><td>Seringa 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Agulha 21 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2125R</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical</td><td>RTS04</td><td></td></tr></tbody></table>

neurodegeneração em um modelo animal de chronic beta-amilóide oligï¿½ero infusion é contrariada pelo anticorpo tratamento infundido com bombas osmóticas

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Declínio na memória explícita dependente do hipocampo (memória para fatos e eventos) é um dos primeiros sintomas clínicos da doença de Alzheimer (DA). Está bem estabelecido que a perda de sinapse e que se seguiu a neurodegeneração são os melhores preditores para perturbações da memória em AD. Últimos estudos têm enfatizado o papel neurotóxico de oligômeros beta-amilóide solúvel (Aβo) que começam a se acumular no cérebro humano aproximadamente 10 a 15 anos antes de os sintomas clínicos se tornam aparentes. Muitos relatórios indicam que Aβo solúvel correlacionar-se com déficits de memória em modelos AD e seres humanos. A neurodegeneração induzida por Aβo observada em culturas de fatias cerebrais e neuronais tem sido mais difícil de reproduzir, em muitos modelos animais. O modelo de infusões Aβo repetidas mostrado aqui ultrapassar este problema e permitir abordar dois domínios-chave para o desenvolvimento de nova doença modificando terapias: identificar marcadores biológicos para diagnosticar AD cedo, e determinar a mecha molecularnismos subjacentes défices de memória induzidos por Aβo no início da AD. Desde agregado Aβo solúvel relativamente rápido em fibrilas de Ap insolúvel que se correlacionam mal com o estado clínico dos pacientes, Aβo solúveis são preparados na hora e injetado uma vez por dia durante seis dias para produzir a morte celular acentuada no hipocampo. Usamos cânula especialmente desenhado para infusões simultâneas de Aβo e infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo utilizando bombas osmóticas. Esta inovadora no método in vivo podem agora ser utilizados em estudos pré-clínicos para validar a eficácia das terapias novas AD que pode evitar a deposição e de neurotoxicidade Aβo em pacientes pré-demência.

O efeito neurotóxico do Aβo foi investigada em ratos Long-Evans por implantação de cânula a DG do hipocampo. Solúvel Aβo foram injectados diariamente durante seis dias consecutivos. Utilizou-se uma cânula especialmente desenhado para perfusões simultâneas de Aβo e infusão contínua de anticorpo IgG1 de controlo 6E10 ou no hipocampo utilizando bombas osmóticas (Figura 1A). Para os ratos foram anestesiados imunohistoquímica, perfundidos transcardialmente com NaCl a 0,9%, e os cérebros imersos em solução de paraformaldeído a 4% para a solução de sacarose a 48% HR e 15 durante 24 h. -Secções coronais flutuando livres (40 pm) foram tratados com 0,3% de H 2 O 2 durante 30 min, bloqueadas em soro de cabra a 1% durante 1 h, e incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo anti-pan-Ap. As secções foram tratadas com ácido fórmico a 70% durante 3 min antes de aplicar o anticorpo. A detecção foi realizada utilizando o complexo ABC e um 0.05% de solução de 3,3-diaminobenzidina. As secções foram montadas em lâminas de vidro revestidas com gelatina, secas ao ar 2 horas, desidratados (30, 70, 95 e 100% de álcool), incubadas em tolueno 5 min, e lamínulas. Para a coloração de violeta de cresilo, as secções foram incubadas 10 min numa solução de violeta de cresilo a 0,5%, incubou-se 1 min numa solução de ácido acético a 0,5%, decolored (70, 95, e álcool 100%), imerso em tolueno 5 min, e coberto com lamela de vidro. Os resultados aqui apresentados mostram a deposição de Aβo na DG na vizinhança do local de infusão, e morte celular associada a esta acumulação. Verificou-se que o nível Aβo foi substancialmente reduzida pelo tratamento com o anticorpo 6E10 (Figura 1B). Neurodegeneração marcada foi observada perto do local de injecção de Aβo, e foi atenuada por tratamento com o anticorpo 6E10 (Figura 1B). Estes resultados são consistentes com Aβo acumulação que foi observado no DGapós as perfusões Aβo repetidas em camundongos. 28 Apuramento da deposição de amilóide por imunoterapia com anticorpos 6E10 mostrado aqui está de acordo com outro relatório feito em um modelo transgénico AD rato 31. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig1.jpg" /> Figura 1. Foto do animal com a cânula bilaterais durante Aβo Infusion Uma solução de Aβo. (0,2 mg / mL; 1 ml) foi injetado em ratos acordados e livremente em movimento (uma vez por dia durante 6 dias), utilizando cateteres PE50 ligados a cânula interna inserido cânula guia. O tratamento com o controle (CTL) IgG1 ou 6E10 anticorpo foi administrado directamente no local da Aβo infusão usando bombas osmóticas localizados por via subcutânea entre as omoplatas do animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior do th</a>é figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54215/54215fig2.jpg" /> Figura 2. A perda neuronal induzida por Aβo deposição é atenuada por 6E10 Anticorpo Tratamento A, Aβo (0,2 ug / uL; 1 mL). Injectou-se uma vez por dia durante 6 dias consecutivos, e tratados com CTL (IgG1) ou anticorpo 6E10 no local da perfusão usando bombas osmóticas. B, a acumulação representante da Aβo na DG em uma seção imediatamente ao lado de inserção da cânula, e coloração representante com violeta cresil que mostra a perda de células. Barras de escala: 50 mm (n = 4) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54215/54215fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Para estudar os efeitos de Aβo in vivo, desenvolvemos um modelo baseado em infusões repetidas de Aβo solúvel no hipocampo juntamente com infusão contínua de anticorpo Aβo (6E10) no hipocampo usando bombas osmóticas para neutralizar o efeito neurotóxico de Aβo.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

O objetivo geral dessa intervenção cirúrgica é testar o efeito de terapias sobre a toxicidade dos oligômeros de beta amiloide in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da doença de Alzheimer, como a busca por novas terapias que visem o efeito neurotóxico dos oligômeros de beta amiloide em um modelo animal. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser utilizada para investigar o mecanismo pelo qual os oligômeros de beta amiloide induzem efeitos neurotóxicos in vivo.E nosso tratamento, como a imunoterapia, pode contrabalançar o efeito prejudicial no cérebro. A demonstração do procedimento será feita por Chloe Provost, uma técnica do meu laboratório. Para iniciar o processo de implante da cânula, corte primeiro cateteres PE50 com seis centímetros de comprimento.Em seguida, preencha os cateteres com fluido cerebroespinhal artificial. Selle ambas as extremidades dos cateteres com uma máquina de selagem a quente. Adicione cimento dental em ambas as extremidades.Após anestesiar ratos de acordo com um método aprovado, confirme a anestesia verificando o movimento após um leve aperto no dedo do pé. Em seguida, injete o animal anestesiado com uma droga anti-inflamatória não esteroide. Após a depilação da cabeça do animal com uma máquina de cortar cabelo, desinfete a pele com uma solução de 2% de clorexidina gluconato e 2% de álcool isopropílico.Aplicar pomada oftálmica veterinária nos olhos para prevenir ressecamento durante a anestesia. Agora, posicionar o animal em um estereotáxico utilizando as barras auriculares. Fixar uma cânula no braço do suporte do estereotáxico.Após injetar um agente anestésico local e fazer uma incisão de três centímetros com bisturi no topo da cabeça, instale quatro grampos ao redor da incisão para manter o crânio exposto. Em seguida, use uma tesoura de ponta redonda para criar um bolso quadrado de dois por dois centímetros sob a pele entre as escápulas do animal. Retornando à cabeça, risque o periósteo do crânio com uma lâmina.Aplicar um curativo de gaze sobre o crânio se houver sangramento. Agora, para verificar se o crânio está plano e bem alinhado no estereotáxico, verificar as coordenadas de altura em lambda e em bregma. Registrar as coordenadas de bregma que serão usadas como ponto de referência.Após calcular as coordenadas para a colocação bilateral correta das duas cânulas-guia, faça um furo de 0,5 milímetro no crânio no ponto de implantação de ambas as cânulas. Faça outros três furos, aproximadamente cinco milímetros acima e abaixo desses pontos, para inserir os parafusos que estabilizarão as cânulas ao aplicar o cimento dental. Em seguida, corte uma extremidade do cateter, previamente preenchido com aCSF, com a tesoura e insira-a no braço angular da cânula.Fixe a primeira cânula com cimento dental. É fundamental evitar colocar cimento dental ao redor do local destinado à segunda cânula. Após deixar o cimento dental secar por dois a três minutos, remova o braço do suporte da primeira cânula e coloque a segunda cânula aparada nele.Fixe a segunda cânula no lugar com cimento dental. Em seguida, coloque uma cânula simulada em cada cânula-guia. Insira a extremidade livre de ambas as cânulas no bolso previamente feito entre as escápulas do animal.Remova os grampos e, em seguida, feche a pele com sutura de quatro-zero. Adicione mais cimento ao redor da cânula. Remova o animal do estereotáxico e coloque-o sobre uma placa aquecida em uma gaiola limpa.Monitore o animal constantemente até que ele recupere consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Em seguida, retorne-o à sala de alojamento para se recuperar da cirurgia por 10 dias sob monitoramento rigoroso. Um dia antes da instalação, encha as bombas osmóticas com anticorpo 6E10 ou anticorpo controle IgG1, de acordo com as instruções do fabricante.Coloque as bombas em água destilada estéril e mantenha a 37 graus Celsius durante a noite para ativar as bombas. Após anestesiar o rato com 3% de isoflurano e raspar a região entre as escápulas, desinfete a pele com uma solução de 2% de gluconato de clorexidina e 2% de álcool isopropílico. Após fazer uma incisão de dois centímetros com um bisturi entre as escápulas, localize os cateteres PE50 conectados à cânula guia.Em seguida, corte as extremidades dos cateteres PE50 que contêm cimento dental com um bisturi. Conecte as bombas osmóticas aos cateteres PE50 e adicione um pouco de cimento dental na junção entre a bomba e o cateter para fixar a conexão. Por fim, feche a pele firmemente com pontos de sutura 4-0.Coloque o animal de volta à sua gaiola sobre uma almofada térmica aquecida e monitore-o enquanto ele desperta da anestesia com isoflurano. Após preparar a solução de oligômeros de beta amiloide conforme relatado anteriormente, deixe a solução aglomerar dinâmica e espontaneamente por uma hora à temperatura ambiente antes da infusão. Em seguida, encha cada seringa com cinco microlitros de água destilada estéril.Em seguida, corte dois cateteres PE50 com uma lâmina cirúrgica para cerca de 60 centímetros de comprimento. Use duas seringas de um mililitro equipadas com agulhas de 21 graus para encher ambos os cateteres com água destilada estéril. Enquanto as seringas de um mililitro permanecem fixadas em uma extremidade de cada cateter, conecte as extremidades livres às seringas Hamilton.Remova as seringas de um mililitro e verifique se não há bolhas de ar nos cateteres. Insira a cânula interna na extremidade dos cateteres PE50. Use as seringas Hamilton para encher cada cânula interna até um microlitro, depois crie uma bolha de ar puxando o pistão até a marca de dois microlitros.Agora, misture a solução de oligômeros de beta amiloide pipetando para cima e para baixo usando uma ponteira de baixa aderência. Evite formar bolhas durante a mistura. Em seguida, encha ambas as cânulas internas com 1,5 microlitros da solução de oligômeros de beta amiloide puxando os pistões até 3,5 microlitros.Em seguida, marque linhas antes e depois da bolha de ar em ambos os cateteres. Isso serve como um ponto de verificação da infusão contínua. Coloque a rata acordada em posição de aconchego e imobilize sua cabeça.Remova a cânula falsa das duas cânulas-guia e, em seguida, insira a cânula interna previamente preparada na cânula-guia. Verifique se foram totalmente inseridas e bem fixadas à base da cânula-guia. Agora, solte o rato da contenção segura e devolva-o à sua gaiola para limitar o estresse provocado pelo manejo.Ligue a bomba de infusão e injete um microlitro de solução de oligômeros de beta amiloide a uma taxa de 0,1 microlitro por minuto. Durante a infusão, verifique se o êmbolo da seringa se move de 3,5 microlitros para 2,5 microlitros e se as bolhas de ar em ambos os cateteres PE50 se movem continuamente. Verifique o rato para garantir que os cateteres não se enrolem entre si.Deixe a cânula interna no lugar por mais cinco minutos após a infusão para permitir a difusão eficiente da solução de oligômeros de beta amilóide. Após a infusão, retorne a rata para a posição de aconchego e remova a cânula interna e a cânula-guia tampada para evitar o refluxo da solução injetada. Coloque uma cânula falsa que pare logo antes do braço em ângulo da cânula-guia.Por fim, devolva o animal à sua gaiola. Os resultados apresentados aqui mostram a deposição de oligômeros de beta amiloide no giro denteado próximo ao local de infusão e a morte celular associada a esse acúmulo. O nível de oligômeros de beta amiloide foi substancialmente reduzido pelo tratamento com o anticorpo 6E10, conforme revelado por imunomarcação com anticorpo anti-A-beta.Uma acentuada neurodegeneração foi observada próximo ao local de injeção do A-beta-O e foi atenuada pelo tratamento com o anticorpo 6E10, conforme demonstrado pela coloração com violeta cresil. Uma vez dominado, o implante de cânula pode ser realizado em 30 minutos, se executado corretamente. A instalação da bomba osmótica levará cerca de 10 minutos, e a injeção de beta amiloide, cerca de 15 minutos.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de evitar colocar cimento dental ao redor da posição da segunda cânula ao inserir a primeira cânula. Além disso, espere até que o animal esteja calmo antes de inserir a cânula interna na cânula guia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como implantar cânulas e bombas osmóticas para infundir oligômeros de beta amiloide e testar tratamentos para a doença de Alzheimer, como a imunoterapia.

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Uma característica da doença de Alzheimer é a elevação da...

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Este vídeo demonstra uma técnica para a infusão contínua de anticorpos específicos do peptídeo beta-amilóide (Aβ) no hipocampo de um rato. O estudo emprega a implantação de um sistema de cânula bilateral para uma infusão controlada de anticorpos específicos do peptídeo Aβ juntamente com a infusão de oligômeros Aβ solúveis (Aβo) no hipocampo de ratos para estudar as interações entre os oligômeros e os anticorpos.

Infusão controlada de anticorpos específicos do peptídeo Aβ e oligômeros Aβ no hipocampo de ratos

Este vídeo demonstra a infusão estereotáxica precisa de beta amilóide no giro dentado para estabelecer um modelo de camundongo da doença de Alzheimer. A determinação precisa de coordenadas e a entrega controlada de proteínas beta amilóides resultam em degradação neuronal, interrompendo o processamento da memória e contribuindo para o desenvolvimento da doença de Alzheimer.

Infusão cerebral estereotáxica direta de proteínas beta-amilóide para um modelo de doença de Alzheimer

Fonte: Maiti, P. et. al.,. Marcação e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando o polifenol natural curcumina. J. Vis. Exp.} (2019)Este vídeo demonstra o procedimento de imagem de placas beta-amilóide em seções de tecido cerebral usando imunomarcação e coloração com curcumina. A imunomarcação fornece especificidade para beta-amiloide, enquanto a curcumina se liga seletivamente às fibrilas ricas em β folhas, melhorando a visualização. A co-localização da fluorescência vermelha e verde...

Imagem de placas beta-amilóide em seções de tecido cerebral por imunomarcação e coloração com curcumina

Descreve-se um método para alvejar fármacos para o sistema nervoso central por qualquer implante de um cateter ou realizar uma injecção de bolus no ventrículo lateral direito de ratos. Nós nos concentramos especificamente na entrega de oligonucleotídeos antisense. Esta técnica é facilmente adaptável a outros fármacos e a ratos.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Nós descrevemos métodos para estudar aspectos da amylopathies do...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para Estudo Amylopathy

Aqui, apresentamos um protocolo para infusão cerebral estereotáxica direta de beta-amilóide. Esta metodologia fornece um modelo alternativo de camundongo in vivo para abordar os efeitos de curto prazo da beta-amilóide nos neurônios cerebrais.

Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus

O amilóide-β (Ap) -injected modelo animal permite a administração de uma quantidade e espécie de fragmentos de Ap definidos e reduz as diferenças individuais dentro de cada grupo de estudo. Este protocolo descreve a injecção intracerebroventricular (ICV) de Ap sem instrumentos estereotáxicas, permitindo a produção de anormalidades comportamentais Alzheimer-like em ratinhos normais.

Injeção intracerebroventricular de peptídeos amilóide-beta em ratos normais para induzir Acutely déficits cognitivos Alzheimer-like

Desenvolvemos uma metodologia para 3D quantitativa na modelagem silico (q3DISM) de amilóide cerebral-β (Aâ) fagocitose por fagócitos mononucleares em modelos de roedores da doença de Alzheimer. Este método pode ser generalizado para a quantificação de praticamente qualquer evento fagocítica in vivo.

3D quantitativa In Silico Modelagem (q3DISM) de beta-amilóide cerebral fagocitose em modelos de roedores da doença de Alzheimer

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Este protocolo ilustra um método de encapsulamento da pilha pela gelação física rápida do alginato para imobilizar pilhas. Os microgrânulos obtidos permitem a secreção controlada e sustentada de amiloide-β ao longo do tempo e podem ser usados para estudar os efeitos do amilóide-β secretado em modelos in vitro e in vivo.

Fabricação de microgrânulos de alginato de secreção de amiloide-β para uso na modelagem da doença de Alzheimer

Aprenda a implantar cânulas e bombas osmóticas para infundir oligômeros de beta-amiloide e testar tratamentos para doença de Alzheimer, como imunoterapia, em modelo animal.

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas (Vídeo) | JoVE Journal

Neurodegeneração em um modelo animal de Chronic beta-amilóide Oligï¿½ero Infusion é contrariada pelo anticorpo Tratamento infundido com bombas osmóticas

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