Name: Elevando a mosca da fruta Drosophila melanogaster Sob axênicas e gnotobióticos Condições (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a criar Drosophila melanogaster em condições axênicas e gnotobióticas. Este método permite controlar e estudar a microbiota e sua relação com características do hospedeiro em pesquisas de neurociência e microbiologia.

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Alguns detalhes deste protocolo foram otimizados com a assistência do Dr. Adam Dobson, que também forneceram comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação para o National Institutes of Health (FNIH) número de concessão R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH número de concessão 1F32GM099374-01 (PDN) e da Universidade Brigham Young fundos de inicialização (JMC, MLK, MV). Os custos de publicação foram apoiadas pela Academia Brigham Young University de Ciências da Vida e do Departamento de plantas e animais selvagens Sciences.

1. Cultura das bactérias (Start ~ 1 semana antes da colheita dos ovos) <ol><li> Prepare MRS modificado 20 (RMM) placas e tubos de caldo (Tabela 1). Introduzir 20 ml de agar RMM em cada placa de Petri de 100 mm e deixe esfriar / secar durante a noite, ou 5 ml Mmrs caldo para 18 tubos de ensaio mm. </li><li> Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, e L. plantarum na RMM placas de agar. Incubar durante a noite a Acetobacter 30 ° C. Incubar Lactobacillus anaeróbia, colocando as placas em um recipiente hermético e inundações com dióxido de carbono antes de selar. Incubar a 30 ° C durante a noite. Nota: L. colónias brevis pode não ser visível até 24-48 h. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C e as colónias pode ser usado durante até 3 semanas. </li><li> Dois ou três dias antes de transferir os ovos dechorionated à dieta estéril (seção 5), escolher uma única colónia da placa RMM em um con tubo de ensaioRMM Taining caldo. Acetobacter crescer com agitação e crescer Lactobacillus estaticamente durante 24 horas ou até turva, tanto a 30 ° C. </li></ol> 2. Prepare estéril Diet <ol><li> Prepare dieta estéril (Tabela 2) num balão Erlenmeyer de 2 L. Microondas A dieta até que tenha fervido 3 vezes sequenciais; misturar entre cada fervura. </li><li> Colocar o balão sobre uma placa de agitação para manter a agitação durante a transferência de dieta para tubos de centrífuga cónicos. Transferir 7,5 ml de dieta para 50 ml tubos de centrífuga. Vagamente tampar os tubos, e coloque em uma cremalheira de polipropileno coberto, autoclave. </li><li> Esterilizar dieta mosca utilizando um autoclave a 121 ° C e 15 psi durante 25 min. Retire prateleiras de autoclave, e agitar imediatamente cada rack horizontal para garantir a dieta não separar durante o resfriamento. Tenha cuidado para não apertar as prateleiras verticalmente para evitar a transferência de dieta para a tampa ou bordas dos tubos. Permitir que a dieta arrefecer num agitador durante exactamente 45 min enovamente agitar a dieta horizontalmente com a mão. Nota: A dieta pode ser armazenada a 4-15 ° C durante até uma semana. </li><li> Como uma alternativa ao uso de racks de autoclaváveis ​​cobertos (passos 2,1-2,3), ou para levantar as moscas com dietas contendo conservante ácido, execute os seguintes passos: <ol><li> Prepare 1 L dieta líquida num frasco de 2 L com uma barra de agitação no frasco. Autoclave a dieta. </li><li> Após autoclavagem, adicione 10 ml conservante e mexa continuamente numa placa de agitação aquecida. Quando o agar foi arrefecida a 50-60 ° C, mover o balão para uma placa de agitação aquecida numa cabine de segurança biológica e manter a temperatura do balão de aquecimento a 50-60 ° C. </li><li> Na cabine de segurança biológica, pipeta ~ 7,5 ml individualmente em tubos cônicos. </li></ol></li></ol> 3. Prepare gaiolas de postura <ol><li> Fazer placas de agar de sumo de uva por microondas a 100 ml de água, 10 g de levedura de cerveja, 10 g de glucose, e 1 g de ágar. Leve para ferver 3 vezes no passo 1.1 e adicione 10 g de uvas congeladas suco de concentrate para aumentar a visibilidade dos ovos na placa de agar. </li><li> Quando agar foi arrefecida a 55 ° C, verter em 20 ml de 100 mm de placas de Petri e deixa-se solidificar. </li><li> Cobrir a superfície das placas de agar com uma pasta de levedura por mistura de 1 g de levedura de cerveja com 15 g de água. Pour pasta de levedura sobre a placa de agar para garantir que a superfície é coberta, em seguida, deitar fora o excesso, deixando um resíduo de levedura fina atrás. Se forem utilizadas múltiplas placas, a pasta pode ser sequencialmente vertida para múltiplas placas. </li><li> Transferir placas de agar na parte inferior de uma gaiola. Nota: Um recipiente deli 32 oz é um bom substituto para gaiolas mosca acrílico. <ol><li> Faça tampas para recipientes deli 32 oz cortando um furo na parte superior e colando uma malha respirável sobre o buraco com cola não tóxica. Se a cola é solúvel em água prevenir a exposição a água para a tampa. </li></ol></li><li> Transferência 200-300 voa dentro do recipiente e cobrir com tampa. Cobrir o buraco protegido de malha com uma tampa vazio placa de Petri para Prevent evaporação a partir da superfície do agar e adicionar um papel de tecido húmido no interior da tampa, se desejado. Incubar as moscas a 25 ° C durante a noite durante 16-20 horas. </li></ol> 4. recolher ovos <ol><li> Prepara-se uma peneira para a recolha de ovos, colocando uma malha de nylon para o casquilho de plástico. </li><li> Para recuperar o prato com ovos nele, remova moscas da gaiola, transferindo para um recipiente vazio. Se mesmas moscas será utilizado no dia seguinte, transferir imediatamente para uma nova gaiola contendo uma placa de agar de uva recém-sumo fermentado. As moscas podem ser utilizadas para 3-5 dias sequenciais </li><li> Remover moscas mortas do agar com um pincel limpo, tomando cuidado para não quebrar o agar. </li><li> Recolhe ovos por lavagem da placa de agar com água destilada, escovando levemente os ovos a partir da superfície do agar, e vertendo a suspensão sobre a malha. Repetir 3-4 vezes até que todo ou a maioria dos ovos foram retirados da placa de agar. </li></ol> 5. Dechorionate Ovos e Transferência para estéril Diet <ol><li> Prepara-se o cabine de segurança biológica por pulverização do interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido laboratório, e esterilizar o capô com luz UV para ~ 15 min. Esterilizar todos os suprimentos não-biológicos (copos de amostra, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, a 400 ml de água esterilizada, e 100 ml de 0,6% de hipoclorito de sódio) por pulverização com etanol e imediatamente colocar na cabine de segurança biológica. Esterilizar com luz UV durante 15 min. </li><li> Inicie o primeiro de 2 lavagens de hipoclorito de sódio, colocando a bucha com os ovos em um copo de 120 ml de amostra ou outro recipiente estéril. Lentamente, deitar ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0,6% para o casquilho até pouco abaixo do rebordo. </li><li> Lavar ovos para 2,5 min. Periodicamente re-suspender os ovos utilizando uma pinça para mover o casquilho cima e para baixo na solução de hipoclorito. </li><li> Transfira a bucha diretamente em um segundo copo espécime, pré-carregada com 90 ml de lixívia, no interior da cabine de segurança biológica. </li><li> RepetirPasso 5.3 dentro da cabine de segurança biológica. No final do segundo tratamento de branqueamento, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha. </li><li> Realizar os passos 5,7-5,8 na cabine de segurança biológica. </li><li> Descarte a lixívia e lavar a bucha com água estéril 3 vezes. Re-suspender os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem mais ovos devem ser ligado ao lado da bucha. </li><li> Usando um pincel esterilizado em etanol, transferir os ovos a partir do lado da bucha para a dieta estéril. Transferir os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Objectivo para 30-50 ovos por frasco. Deixar as tampas soltas para permitir que o oxigênio para entrar no tubo. Se frascos devem permanecer axênico, transferir para uma incubadora de insetos; de outra forma, adicionar bactérias como abaixo. </li></ol> 6. Faça gnotobióticos Moscas Usando 4 espécies bacterianas <ol><li> Prepare bactérias <ol><li> Prepare uma cabine de segurança biológica esterilizados com suprimentos necessários (pipettes, caixas de ponta da pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS, e racks tubo de ensaio) como no passo 4.1. Limpe a parte externa de tubos de ensaio com um laboratório encharcada de etanol limpe antes de colocar no gabinete de biossegurança. </li><li> Sedimentar as bactérias, em primeiro lugar a transferência de 500 ul de crescimento durante a noite para um tubo de microcentrífuga estéril. Se a densidade bacteriana é baixa, adiciona-se 1,5 ml a cada tubo sequencialmente ou remover o sobrenadante e adicionar cultura extra para o mesmo tubo. Retirar amostras a partir da cabine de segurança biológica e centrifugar durante 10 min a 10.000 x g. Use pontas com filtro para evitar a contaminação entre amostras. </li><li> Determinar a densidade de cada cultura por medição OD 600. Se utilizando um leitor de placa de multi-poços, transferir 200 ul de cada cultura para uma placa de 96 poços em 1-, 2-, 4- e diluições. </li><li> Determinar a quantidade de RMM em que para diluir cada sedimento celular (5.2.2) utilizando um espectrofotómetro de leitura de placas e as seguintes equações. Planejamos adicionar caldo suficiente para inocular 50 &amp;# 956; l a cada frasco mosca. <ol><li> Recolhe OD 600 leituras para uma mistura 1: 1, 1: 2 e 1: 4 de diluição de cada cultura bacteriana num espectrofotómetro de leitura de placas. Selecione a diluição para cada estirpe bacteriana que produz um 600 valor OD entre 0,1 e 0,2 e usar esse valor e seu fator de diluição correspondente como &#39;O&#39; e &#39;D&#39; na fórmula indicada no 6.1.4.2 ou 6.1.4.3. </li><li> Se estiver usando as 4 espécies descritas aqui, normalizar as células a colónia equivalente unidade de formação (UFC) / ml densidades (OD 600 a conversão CFU previamente determinado 20) usando esta equação: E = ((OB) x V x D) / C onde E = volume para ressuspender sedimento em (l), O = OD 600 bactérias, B = OD 600 mídia em branco, D = fold-diluição, V = cultura bacteriana ul antes da centrifugação, C = OD 600 de constante predeterminado. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações. para espectrofotômetros que automaticamente em branco, use &quot;O&quot; no lugar de &quot;OB&quot;. Nota: As constantes predeterminadas (600 unidades OD, normalizadas para 10 7 UFC ml-1, constantes derivadas em 20) são como se segue: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). </li><li> Se utilizar outras espécies de bactérias (sem CFU / OD 600 constante está disponível), normalizar a densidade de DO600 = 0,1 usando esta equação: E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600 Nota: As unidades são as mesmas como no passo 6.1.4.2. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações. </li></ol></li><li> Na cabine de segurança biológica, remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta e ressuspender o sedimento em Mmrs frescas ou PBS como calculado no passo 6.1.4.2. </li></ol></li><li> inocular bactérias <ol><li> Transferir 50 uL das bactérias aos tubos cónicos com uma dieta estérild dechorionated ovos em cabine de segurança biológica. Adicionar bactérias após a transferência de ovos para evitar a contaminação entre frascos. </li><li> Colocar os tubos inoculados numa incubadora a 25 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Medida CFU Load / controlo de esterilidade <ol><li> Para medir a carga de CFU em homogeneizados de todo o corpo da mosca, transferência de 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga contendo 125 ul de contas de cerâmica e 125 mL de caldo de RMM. Homogeneizar moscas usando um homogeneizador de tecidos durante 30 segundos a 4,0 m / seg. <ol><li> Como alternativa, omitir contas e mão homogeneizar em microtubos com pilões plástico para 1 min. </li><li> Se a quantificação da microbiota intestinal, a superfície esterilizar as moscas para remover micróbios exógenos 22. Transferência de moscas para um tubo de microcentrifugadora contendo 100 ul de etanol a 70% durante 1 minuto, aspirar o etanol, e transferir para um novo tubo de microcentrífuga para homogeneizações. Se o teor de ADN do intestino irá ser medido, lavar fou 1 min com 0,6% de hipoclorito de sódio antes da lavagem com etanol. </li></ol></li><li> Dilui-se o homogeneizado com 875 ul, RMM vortex durante 5 segundos, e pipetar com 120 ul de homogeneizado para a primeira cavidade de uma placa de microtitulação. </li><li> Realizar dois seqüenciais 1: 8 diluições utilizando 10 homogeneizado ul e 70 ul MRS nos próximos dois poços. <ol><li> Retirar 10 jul do primeiro poço e adicioná-lo para o segundo poço contendo 70 ul MRS. Misturar os conteúdos do segundo poço completamente, a transferência de 10 uL de o segundo poço para os terceiros poços contendo 70 ul MRS, e homogeneiza-se. Isto leva a 3 concentrações totais do original homogenato 1000 ul: não diluído, 1: 8 e 1:64. </li></ol></li><li> Transferir 10 uL de cada diluição a uma placa de RMM (utilizando uma pipeta multi-canal, se desejado). Ligeiramente inclinar o prato de diluição para espalhar a alguns milímetros abaixo da superfície de agar e permitir que o líquido a secar antes de mover a placa. O líquido seca sobre the rapidamente placa se as placas a 2 dias de idade, reduzir a mistura de duas gotas de vizinhos. </li><li> Incubar a 30 ° C durante 1-2 dias. Remover as placas da incubadora, uma vez distintos, colónias individuais são visíveis, e contar a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas. </li><li> Calcular CFU por mosca, utilizando a equação E = C x D / P x V / F, em que E = CFU por mosca, C = número de colónias contadas, D = diluição, P = ul chapeado, V = volume do homogenato de mosca, e F = número de moscas homogeneizados. </li></ol>

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<li>Bitner-Mathe, B. C., Klaczko, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+Drosophila+melanogaster+wing+morphology%3A+effects+of+sex%2C+temperature+and+density%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Plasticity of Drosophila melanogaster wing morphology: effects of sex, temperature and density.</a> Genetica. 105 (2), 203-210 (1999).</li>
<li>Edward, D. A., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-specific+effects+of+developmental+environment+on+reproductive+trait+expression+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Sex-specific effects of developmental environment on reproductive trait expression in Drosophila melanogaster.</a> Ecol Evol. 2 (7), 1362-1370 (2012).</li>
<li>Ridley, E. V., Wong, A. C., Westmiller, S., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+resident+microbiota+on+the+nutritional+phenotype+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 7 (5), e36765(2012).</li>
<li>Newell, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+function+and+comparative+genomic+analyses+of+the+Drosophila+gut+microbiota+identify+candidate+symbiosis+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors.</a> Front Microbiol. 5, 576(2014).</li>
<li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+of+the+defined+murine+microbiota%3A+altered+Schaedler+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).</li>
<li>Min, K. T., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wolbachia%2C+normally+a+symbiont+of+Drosophila%2C+can+be+virulent%2C+causing+degeneration+and+early+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

<html> O método descrito aqui é uma das várias abordagens para embrião dechorionation 8,11,18,25,26,27, juntamente com métodos alternativos de criação de moscas axênicas, incluindo a transferência de série dos adultos axênicas 18,27 ou tratamento antibiótico 13,18. Outros métodos incluem dechorionation lavagens de etanol e reduzir ou estender 11,25,26 8 tratamento de hipoclorito. Diferentes etapas de lavagem pode auxiliar criação de diferentes genótipos mosca: em um ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/54219/rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic">Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions</a>. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

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Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A maioria dos animais estão intimamente associados com bactérias ( &#39;microbiota&#39;) desde o nascimento até a morte 1. Comparações de ( &quot;convencional&quot;) animais livres de microrganismos ( &#39;axênico&#39;) e associada a microorganismos têm demonstrado micróbios influenciar diversos aspectos da saúde animal, incluindo metabólica, nutricional, vascular, hepática, respiratória, imunológicos, endócrino e função neurológica 2. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um modelo fundamental para a compreensão de muitos desses processos na presença de micróbios 3,4 e para o estudo da influência microbiota em 5,6 a saúde animal. Nenhuma espécie bacteriana está presente em cada indivíduo ( &#39;core&#39;), mas Acetobacter e Lactobacillus espécies numericamente dominar a microbiota de ambos D. pego wild-criados em laboratório e melanogaster. Outros Acetobacteraceae (incluindo Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicútis (tais como Enterococcus e Leuconostoc) e Enterobacteriaceae ou são frequentemente presentes em indivíduos de Drosophila em baixa abundância, ou irregularmente presente em grande abundância 7-12. A microbiota de Drosophila e mamíferos é inconstante dentro e entre gerações 14,19. Microbiota inconstância pode levar ao ruído fenotípica ao medir traços dependente da microbiota. Por exemplo, o armazenamento Acetobacteraceae influência lipídico (triglicéridos) em Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae são mais abundantes em moscas de um frasco do que nos outros 19, moscas isogênicos podem ter diferentes fenótipos 20. Uma solução para o problema da inconstância microbiota em camundongos 14 tem sido na prática desde 1960, através da introdução de uma comunidade definida de 8 espécies microbianas dominantes para filhotes de rato cada nova geração (alterada SCHAEDLER flora),garantindo que cada filhote está exposto aos mesmos membros-chave da microbiota mouse. Esta prática controla a composição da microbiota, mesmo quando a microbiota não é o alvo primário do estudo 32, e define precedente para assegurar a presença de micróbios chave numa variedade de condições experimentais. Para definir a influência de micróbios em Drosophila nutrição, vários protocolos para derivar linhas mosca axênicas têm sido desenvolvidos, incluindo dechorionation hipoclorito de embriões (derivada quer de novo cada geração ou mantida generationally por transferência para uma alimentação esterilizada) e 13 tratamento com antibióticos. Há benefícios para diferentes abordagens, tais como a facilidade e rapidez para os dois tratamentos antibióticos e transferência de série, contra um maior controle de variáveis ​​de confusão com de novo dechorionation (por exemplo, densidade de ovos, micróbios contaminantes residuais, longe do alvo efeitos antibióticos). Independentemente do método depreparação, a introdução de espécies microbianas especificados para axênicas embriões permite cultura de Drosophila com as comunidades ( &#39;gnotobióticos&#39;) definidas. Alternativamente, imitando o uso de flora SCHAEDLER, esta comunidade poderia ser inoculado aos ovos convencionalmente-estabelecidas (seguindo os passos 6-7 somente) para assegurar a presença de micróbios que influenciam a característica em cada frasco e evitar complicações da inconstância microbiota. Aqui descrevemos o protocolo para elevar e gnotobiótico axénica de Drosophila por dechorionation de novo de embriões e para a confirmação da presença dos taxa microbiana introduzido ou contaminantes.

<table><tbody><tr><td>Levedura de cerveja</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>903312</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158968-3KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher--Lab Scientific</td><td>fly802010</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177</td></tr><tr><td>Concentrado de Suco de Uva 100% Welch's</td><td>Walmart ou outra loja de supermercado</td><td>9116196</td><td>http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406</td></tr><tr><td>Cage: 32 oz. Recipiente de Delicatessen Redondo Translúcido</td><td>Webstaurant Store</td><td>999L5032Y</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html</td></tr><tr><td>Tampa de Recipiente de Deli Redondo Translúcido</td><td>Webstaurant Store</td><td>999YNL500</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html</td></tr><tr><td>Garrafas de Estoque</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130</td></tr><tr><td>Droso-Plugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101</td></tr><tr><td>Malha de Nylon</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102&nbsp;</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102</td></tr><tr><td>Bucha de Plástico</td><td>Home Depot</td><td>100404002</td><td>http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002</td></tr><tr><td>Tampa de Bucha de Plástico</td><td>Home Depot</td><td></td><td>100153897 http://www.homedepot.com/p/1-1-4- em-Bucha-Isolada-de-Plástico-Rígido-2-Pack-27529/100153897</td></tr><tr><td>Copo de Espécime</td><td>MedSupply Partners</td><td>K01-207067</td><td>http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html</td></tr><tr><td>Repetidor M4</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html</td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 50 ml Tubos de Centrífuga</td><td>TrueLine</td><td>TR2003</td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003</td></tr><tr><td>Caixas de Alimentos</td><td>EUA Scientific</td><td>2316-5001</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001</td></tr><tr><td>Matriz de Lise D Bulk</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116540434</td><td>http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta de Filtro, 300 &mu; l</td> Vendas de produtos de laboratório de placas de Petri <td>da http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 USA Scientific</td><td>1120-9810</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>M089303</td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories, INC.</td><td>Pincel http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 2701</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Walmart</td><td>5133</td><td>http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fisher</td><td>08-882</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693</td></tr><tr><td>Alvejante Doméstico (6-8% Hipoclorito)</td><td>Walmart</td><td>550646751</td><td>http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295</td></tr><tr><td>Peptona Universal</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-260</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>&nbsp; Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500</td></tr><tr><td>Fosfato Dipotássico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-1KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&amp; 
N=0& modo=correspondência%20parcialmax& lang= 
pt& região = EUA & foco=produto</td></tr><tr><td>Citrato de amônio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>25102-500g</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N 
=0& modo=correspondência%20parcialmax& lang= 
pt& região = EUA & focus=product</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>VWR</td><td>97061-994</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994</td></tr><tr><td>sulfato de magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500</td></tr><tr><td>sulfato de manganês</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10034-96-5</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match 
%20parcialmax& lang=pt-br& região =EUA& focus=produto</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69966-500G</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&region=US Leitor de Placas de 96 Poços</td><td>BioTek (Época)&nbsp;</td><td>NA</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html</td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga de 1,7 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta de Filtro, 1.000 &mu; l</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830</td></tr><tr><td>96 Placas de Poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/</td></tr><tr><td>Ceramic Beads</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>6540-434</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434</td></tr><tr><td>Homogeneizador de Tecidos</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116004500</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500</td></tr><tr><td>Gabinete de Biossegurança Classe 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>Modelo 1395</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html</td></tr></tbody></table>

elevando a mosca da fruta<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; sob axênicas e gnotobióticos condições

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A influência dos micróbios em uma miríade de características e comportamentos animais tem sido cada vez mais reconhecida nos últimos anos. A mosca-da-fruta Drosophila melanogaster é um modelo para a compreensão das interações microbianas com hospedeiros animais, facilitado por abordagens para criar grandes tamanhos de amostra de Drosophila sob condições livres de microrganismos (axênicas) ou com comunidades microbianas definidas (gnotobióticos). Este trabalho descreve um método para coleta de embriões de Drosophila, descorionação e esterilização de hipoclorito e transferência para dieta estéril. Os embriões esterilizados são transferidos para dieta estéril em tubos de centrífuga de 50 ml, e as larvas e adultos em desenvolvimento permanecem livres de quaisquer micróbios exógenos até que os frascos sejam abertos. Alternativamente, moscas com uma microbiota definida podem ser criadas inoculando dieta estéril e embriões com espécies microbianas de interesse. Descrevemos a introdução de 4 espécies bacterianas para estabelecer uma microbiota gnotobiótica representativa em Drosophila. Finalmente, descrevemos abordagens para confirmar a composição da comunidade bacteriana, incluindo testar se a Drosophila axênica permanece livre de bactérias na idade adulta.

Criação bem-sucedida de moscas axênicas é confirmado pelo isolamento de não UFCs de homogeneizações todo o corpo de D. adultos melanogaster (figura 1). Alternativamente, se o homogeneizado chapeado produz colónias, os frascos são contaminada e deve ser descartado. Para gnotobióticos moscas, cada um dos quatro isolados bacterianos foram isolados a partir de misturas de 5 adultos do sexo masculino, demonstrando diferenças em CFUs totais viáveis ​​associad...

Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

O objetivo geral deste procedimento é criar moscas-das-frutas livres de microrganismos associados. Este método pode ajudar qualquer pesquisador na área de Drosophila a controlar, manipular ou estudar a microbiota, incluindo sua relação com diversas características do hospedeiro. A principal vantagem desta técnica é que ela permite aos pesquisadores criar moscas-das-frutas na ausência completa de microrganismos externos.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades, porque os passos de esterilização e lavagem devem ser realizados sem introduzir microrganismos contaminantes. Para iniciar o experimento, faça o estriamento de culturas previamente preparadas em placas de ágar MRS modificado, ou ágar mMRS. Incube as placas durante a noite a 30 graus Celsius.Incube culturas anaeróbicas em um recipiente hermético e inunde-o com dióxido de carbono antes de selar. No dia seguinte, retire uma única colônia do meio sólido mMRS para um tubo de ensaio contendo caldo mMRS. Cultive espécies de lactobacilos em condições estáticas e espécies de acetobactérias com agitação.Prepare a dieta estéril em um frasco Erlenmeyer de um litro. Aqueça a dieta no micro-ondas até que entre em ebulição

rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O embrião de Drosophila é cercado por membranas externas protetoras. Para obter acesso ao embrião, o córion - a mais externa das membranas - é frequentemente removido. Este vídeo descreve um método comumente usado de descorionação usando hipoclorito de sódio. O protocolo de exemplo demonstra o procedimento ao empregar técnicas estéreis necessárias para a criação de animais axênicos ou gnotobióticos.

drosófila Coleta e descorionação de ovos: um método para remover a camada mais externa do ovo

A microbiota de Drosophila afeta o desenvolvimento, a imunidade e a fisiologia do animal. Este vídeo descreve um método para quantificar bactérias de moscas, determinando as unidades formadoras de colônias de preparações de corpo inteiro. O protocolo apresentado demonstra a técnica com moscas, criadas em condições gnotobióticas usando quatro espécies bacterianas.

Contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs): Quantificando Bactérias de Corpos de Moscas

Fonte: Siva-Jothy, J. A., et al. Infecção Bacteriana Oral e Eliminação em Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)O vídeo demonstra a infecção oral de Drosophila melanogaster com bactérias patogênicas. Inclui a preparação de frascos de infecção e a transferência de moscas famintas para possibilitar a ingestão bacteriana. O procedimento captura a colonização intestinal, seguida pela esterilização superficial e homogeneização das moscas. Por fim, mostra a quantificação da carga bacteriana...

Infecção Oral de Drosophila melanogaster com Bactérias Patogênicas

Este manuscrito relata um protocolo detalhado para cultivar, regularmente, uma população de Drosophila melanogaster usando uma gaiola de população de moscas.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Fornecemos um protocolo detalhado para um ensaio de comprimento de caminho de forrageamento de Drosophila melanogaster. Discutimos a preparação e manuseio de animais de teste, como realizar o ensaio e analisar os dados.

Forrageamento Protocolo Caminho de comprimento para<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvas

Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.

Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas

Um método para reativar células-tronco neurais quiescentes em explantas cerebrais de Drosophila cultivadas foi estabelecido. Usando este método, o papel dos sinais sistêmicos pode ser desacoplado a partir de sinais intrínsecos teciduais na regulação da quiescência de células-tronco neurais, entrada e saída.

Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas

Aqui, fornecemos detalhes sobre como preparar lisados e realizar tradução in vitro usando embriões de Drosophila .

Tradução de mRNA In Vitro Livre de Células em Lisados de Drosophila

As células sanguíneas de Drosophila, ou hemócitos, circulam entre os locais residentes e a circulação.  Na larva, os hemócitos residentes (sésseis) localizam-se em microambientes indutivos, as bolsas hematopoiéticas, enquanto os hemócitos circulantes se movem livremente na hemolinfa. O objetivo deste protocolo é o isolamento e quantificação padronizados dessas duas populações de hemócitos comportamentalmente distintas, mas intercambiáveis.

Ensaiando populações de células do sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Aprenda a criar Drosophila melanogaster em condições axênicas e gnotobióticas. Este método permite controlar e estudar a microbiota e sua relação com características do hospedeiro em pesquisas de neurociência e microbiologia.

Elevando a mosca da fruta

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