Isolamento de células progenitoras Mesangiogenic (PPM) de humano Medula Óssea

O objetivo geral deste procedimento é isolar células progenitoras mesangiogênicas ou MPC da medula óssea humana por condições de cultura seletivas. Estamos testando seus potenciais mesogênicos e angiogênicos. As células progenitoras mesangiogênicas estão sendo identificadas em baixa porcentagem com uma cultura de células mesen-ki-ma-stro-mo otimizada para aplicação clínica.

Quando o FBS for substituído por soro humano. Esta técnica é única, na verdade, permite o isolamento muito consistente de um grande número de NPCs ali-polificados, adequados para germinação, angiogênese e uma geração de culturas MSC sincronizadas. Descobrimos isso quando, após viagens na digestão de culturas MCS em um soro de talgrum, poucas células em forma de ovo frito permanecem ligadas, mas diferenciadas em MCs após o tratamento FPS.

Para isolar células mononucleares da medula óssea humana ou MNC, comece diluindo cinco a 10 mililitros de medula óssea fresca até um volume total de 50 mililitros com DPBS e misture a solução celular por inversão. Em seguida, distribua igualmente 25 mililitros de células em dois novos tubos cônicos de 50 mililitros e adicione 25 mililitros de DPBS fresco a cada tubo para uma segunda mistura por inversão. Em seguida, descanse as células à temperatura ambiente para permitir que os fragmentos ósseos minerais e a gordura se separem da solução.

Após 10 minutos, use uma pipeta pastuer para remover cuidadosamente a gordura flutuante e filtrar as suspensões celulares através de filtros individuais de 70 mícrons sem perturbar os grânulos de fragmentos ósseos minerais. Isolar a camada de MNC 20-25 mililitros da medula óssea diluída em cima da temperatura ambiente 1,007 gramas por mililitro de gradiente de densidade em cada um dos dois tubos de 50 mililitros e separar as células por centrifugação. Em seguida, use uma pipeta pastuer estéril para agrupar os anéis esbranquiçados de células nas faces de entrada em um novo tubo de 50 mililitros.

Lavar as células mononucleares isoladas com meio de cultura fresco durante cinco minutos a 400 vezes G e à temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet em cinco a 10 mililitros de meio de cultura fresco. Para isolar o MPC, equilibre frascos hidrofóbicos T75 com 15 mililitros de meio de cultura fresco a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono.

Após 30 minutos, semear quatro a seis vezes 10 elevado a sete células mononucleares da medula óssea humana por balão para uma incubação de 48 horas. No segundo dia, descartar as células médias e não aderentes dos frascos e alimentar as células com 15 mililitros de meio de cultura fresco. Detorne as culturas à incubadora por seis a oito dias.

No final da incubação, lave as células aderentes com DMEM fresco. Em seguida, incube as células com dois mililitros de solução desprendimento de proteas livres de animais por cinco a 15 minutos a 37 graus Celsius. Quando as células forem levantadas do fundo do frasco, adicione 10 mililitros de meio de cultura fresco para interromper a reação e colete as células por centrifugação, ressuspendendo o pellet em um a dois mililitros de meio de cultura fresco.

Depois de contar a placa MPC duas vezes 10 elevado a quatro por centímetro quadrado das células em frascos de cultura T75 tratados com cultura de tecidos e aderir as células durante a noite em 15 mililitros de meio de cultura fresco na incubadora de cultura de células. Na manhã seguinte, substitua o meio cultivado por 200 microlitros por centímetro quadrado de célula misancolmulstromul ou meio de expansão MSC e cultive as células por mais sete a 10 dias. Quando as culturas atingirem a subcultura de confluência de três a cinco vezes dez elevado a três células por centímetro quadrado até atingir uma nova confluência de passagem dois no MSC, em seguida, realizar a digestão de proteas para coletar as células conforme demonstrado anteriormente.

Placa duas vezes dez elevado a quarto centímetro quadrado em cultura de tecidos tratados com seis placas de poço e meio de expansão fresco. Depois de cultivar as culturas para a confluência novamente, marque dois poços como sem diferenciação e atualize o meio de expansão. Marque dois poços como osteoblastos e substitua o meio por 200 microlitros por centímetro quadrado de meio osteogênico padrão projetado especificamente para diferenciação de MSC.

Em seguida, marque dois poços como sítios adiposos e substitua o meio por 200 microlitros por centímetro quadrado de meio adipogênico padrão projetado especificamente para diferenciação de MSC. Retorne as células à incubadora de cultura de células por duas a três semanas até que as células se diferenciem. Em seguida, prossiga para a detecção fluorescente de depósitos de cálcio extracelular e acúmulo de gotículas lipídicas introcelulares.

Para produzir esferóides 3D, semeie um grande número de gotas de 20 microlitros de suspensão MPC recém-isolada na superfície interna de uma tampa de placa de Petri. Quando todas as gotas tiverem sido colocadas com cuidado, coloque a tampa em uma base de placa de Petri contendo DPBS para evitar a evaporação da gota pendurada e coloque a placa na incubadora de cultura de células durante a noite. Na manhã seguinte, adicione alo-quats de 300 microlitros de proteínas padrão da matriz extracelular a cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de quatro graus Celsius e gelifique as proteínas da matriz a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Adicione 700 micro litros de meio de crescimento de células endoteliais ricas em fator de crescimento endolial vascular padrão nas proteínas ECM gelificadas. Quando o MPC tiver se agregado em esferoides 3D, inverta cuidadosamente a tampa da placa de Petri e use uma pipeta pasteur estéril para colher suavemente os esferoides. Por fim, semeie os esferóides nos poços de cultura e devolva a placa à incubadora.

Morfologicamente, os MPC são caracterizados por sua forma distinta de ovo frito com uma região central espessa cercada por uma periferia plana e fina exibindo muitos philipodia. O alongamento polar do limite externo da célula também é frequentemente observado. A cultura de MPC em meio de expansão MSC resulta na diferenciação rápida, mas parcial, em proliferação de células planas e multi-ramificadas com MPCs indiferenciados residuais ainda detectáveis.

Após uma nova passagem, as culturas resultam em uma camada mono de células semelhantes a MSC em crescimento exponencial. No processo, o MPC reorganiza sua F-Actina em fibras de estresse, enquanto a expressão de Nestina fica confinada a algumas células raras. A itom-etria de MPC recém-isolada mostra mais de 95% das células expressando CD31 e CD45, mas sem antígenos associados mis-en-com-al CD90 e CD 73.

Esses antígenos mais recentes são altamente expressos somente após uma diferenciação completa em MSC. Confirmando sua natureza mis-en-com-al, quando alimentadas com meio diferenciador por pelo menos duas semanas, essas células podem ser prontamente induzidas a osteoblastos, conforme indicado por seus depósitos de cálcio ou adipositos, conforme aparente pelo acúmulo de gotículas lipídicas. Confirmando a natureza MSC das culturas de células pré-diferenciadas.

A tipagem MPC é ainda confirmada em um ensaio de angiogênese germinando com as células exibindo a capacidade de invadir um gel de proteína de matriz extracelular miríana de esferoides 3D após 24 horas de estímulo do fator de crescimento endotelial vascular. Após uma semana, as células invasoras migram por uma distância ainda maior, uma capacidade de invasão que é perdida nas MSCs de segunda passagem após a diferenciação mesangênica. Uma vez dominadas, as culturas MSC podem ser estabelecidas em uma hora se isso for resolvido adequadamente, fornecendo entre um ou dois milhões de MPCs em menos de uma semana.

Ao tentar este procedimento, é importante avaliar o desempenho dos lotes de RC humanos antes de usá-los em cultura. No momento, nosso protocolo de isolamento MPC é o único para obter alta reprodutibilidade Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo das terapias baseadas em células para explorar a possibilidade de aplicar MPC na regeneração do tecido esquelético.