Técnicas para a Evolução da levedura Pentose-fermentação robusta para bioconversão de transformação de lignocelulose em etanol

O objetivo geral deste procedimento de evolução adaptativa é derivar cepas robustas da levedura nativa de fermentação de xilose scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que podem fermentar mais rapidamente os açúcares hexose e pentose em hidrolisados não desintoxicados em etanol economicamente recuperável. Este método impulsiona a lignocelulose para a indústria de etanol, fornecendo um roteiro para cepas com modificações complexas, permitindo a fermentação de açúcares em hidrolisados que contêm inibidores microbianos. Aqui, a principal vantagem da evolução direcionada é que cepas robustas são moldadas a partir de uma levedura nativa capaz de fermentar xilose, eliminando a necessidade de projetar cepas industriais de saccharomyces.

Percebemos que era improvável que qualquer cepa de levedura fosse robusta em diferentes tipos de hidrolisados, como palha de milho pré-tratada com AFEX ou switchgrass pré-tratado com ácido diluído. A capacidade de scheffersomyces stipitis de passar por um ciclo reprodutivo sexual é benéfica para uma exploração posterior no presente trabalho, porque as várias cepas desenvolvidas podem ser combinadas em uma única cepa mais robusta por meio do acasalamento de cepas com essas várias características. Demonstrando o procedimento estarão as co-autoras Stephanie Thomson e Maureen Shea-Andersh, que são técnicas de ciências biológicas em meu laboratório.

Antes de iniciar este procedimento de enriquecimento, preparar uma pré-cultura da estirpe NRRL Y-7124 num balão de 125 mililitros e uma série de diluições da enzima hidrolisado de palha de milho pré-tratado para expansão de fibras de amoníaco ou AFEX CSH. Use uma pipeta de repetição para encher uma microplaca de 96 poços com 15 microlitros por poço e oito poços por diluição de hidrolisado. Inocular com alguns microlitros de pré-cultura por poço para permitir uma absorbância inicial a 620 nanômetros, ou A620 maior ou igual a 0,1.

Coloque a microplaca em uma caixa de plástico com uma toalha de papel úmida para umidade e incube estaticamente por 24 a 28 horas a 25 graus Celsius. Em seguida, use um espectrofotômetro de leitura de microplacas para identificar as culturas que cresceram fisicamente para um A620 maior que 1,0 na diluição de hidrolisado mais concentrada. Agrupe os poços identificados em um tubo de microcentrífuga e distribua para uma placa de enchimento.

Transfira de um a cinco microlitros da placa de enchimento para cada poço de uma nova série de diluição de hidrolisado para obter um A620 inicial maior ou igual a 0,1 e incube a placa como antes. Monitore o crescimento das culturas na microplaca com um espectrofotômetro de leitura de microplacas. Prepare regularmente os estoques de glicerol das culturas de adaptação.

Agrupe quatro poços da maior concentração de hidrolisado colonizados em um criofile, e misture um a um com 20% de glicerol estéril. Congele as células a 80 graus Celsius negativos. Repita este procedimento de enriquecimento até que o crescimento em 12% de glucano AFEX CSH seja consistentemente visível em 24 horas.

Para iniciar este procedimento, listre estoques selecionados de glicerol de culturas de adaptação à dextrose peptona de malte de levedura ou ágar YM. Então, após o crescimento, use estrias para inocular 50 microlitros de 3% ou 6% de glucano AFEX CSH em cada um dos três poços de microplacas. Incube a microplaca por 24 horas a 25 graus Celsius.

Poços colonizados replicados em pool com a maior força de hidrolisado com forte crescimento. E placa de diluição para YM ou ágar 6% glucano AFEX CSH. Incube as placas em uma incubadora de 25 graus Celsius por 24 a 48 horas.

Escolher cinco colónias simples da placa de diluição mais elevada que mostre o crescimento para congelar sob a forma de culturas de células de reserva de glicerol. Listre cada colônia em um prato YM e incube por 24 horas. Com uma alça estéril, transfira uma faixa desenvolvida de células para um pequeno volume de 10% de glicerol misturado para suspender as células e distribua para dois a três crioarquivos para congelamento a 80 graus Celsius negativos.

Para testar isolados em culturas simples de batelada de 6% de glucano AFEX CSH, transfira células de placas de 48 horas listradas de estoques de glicerol para tampão fosfato de potássio pH 7 para preparar suspensões celulares. Depois de medir a densidade óptica de cada suspensão de célula, ajuste o volume com buffer adicional para atingir um A620 de dez. Use um microlitro de cada suspensão para inocular cada um dos quatro poços de 50 microlitros de hidrolisado de 3% de glucano para um A620 inicial de 0,2.

Incube a microplaca por 24 horas. Em seguida, transfira dois poços de microplacas de 24 horas para inocular pré-culturas de 25 mililitros de 6% de glucano AFEX CSH em pH 5. Fechar os frascos com fechos de esponja de silicone e incubar durante 24 horas a 25 graus Celsius e 150 RPM.

Use as pré-culturas de 6% de glucano AFEX CSH para inocular culturas de crescimento semelhantes de 25 mililitros em duplicata para um A620 inicial de 0,1. Incubar as culturas de crescimento por 24 horas a 25 graus Celsius e 150 RPM. Para testar a falta dióxica de isolados em culturas em lote de meio definido ideal, ou ODM, com açúcares mistos, inocule pré-culturas de 75 mililitros ODM com 150 gramas por litro de xilose em frascos de 125 mililitros com tampas de esponja de silicone.

Incube por 24 horas a 25 graus Celsius e 150 RPM. Use as pré-culturas para inocular em um A620 de 0,1 culturas de teste duplicadas semelhantes de 75 mililitros com ODM contendo 75 gramas por litro de glicose e 75 gramas por litro de xilose em pH 6,5. Agitar os frascos a 25 graus Celsius e 150 RPM.

24 horas antes da inoculação de uma cultura contínua, preparar uma pré-cultura de uma colónia representativa tolerante ao CSH AFEX em ODM sem etanol num balão de 125 mililitros. Use cinco a 10 mililitros da pré-cultura do isolado tolerante AFEX CSH para inocular 100 mililitros de ODM em um frasco giratório encamisado de 100 mililitros para obter um A620 inicial de 0,5. Mantenha o volume de retenção da cultura em 25 graus Celsius.

Mexa a 200 RPM e equipe-o com um eletrodo de pH esterilizável, um controlador de pH e um banho-maria circulante com temperatura controlada. Inicialmente, como o crescimento celular será lento devido à exposição ao etanol, configure uma bomba acionada por pH para que, quando a fermentação da cultura diminuir o pH para 5,4, a bomba alimente o pH 6,3 ODM com 100 gramas por litro de xilose e 50 gramas por litro de etanol para impedir novas reduções de pH. Mantenha o volume em 100 mililitros com uma bomba de efluentes que desliza continuamente a superfície da cultura.

Medir o volume de efluente coletado e coletar amostras de culturas contínuas a cada 48 a 72 horas para análise da concentração de células viáveis, produtos e substratos, conforme descrito no manuscrito. Economize estoques de glicerol regularmente isolando colônias de placas de viabilidade de diluições de amostras tamponadas formando 30 a 100 colônias, representando as colônias robustas mais prevalentes naquele momento em enriquecimento. Inunde as placas com cinco mililitros de glicerol a 10% para permitir a preparação de crioarquivos duplicados.

Se as culturas puderem crescer de forma constante a taxas específicas superiores a 0,01 por hora com xilose na presença de mais de 25 gramas por litro de etanol, inicie a alimentação de cultura contínua a uma taxa de diluição baixa de cerca de 0,01 por hora até o volume de retenção de 100 mililitros. Com o tempo, aumente o etanol na alimentação para 50 gramas por litro. A irradiação ultravioleta de inóculos para reiniciar culturas contínuas é uma opção para acelerar a taxa de mutação.

Capturar populações avançadas em estoques de glicerol. Antes de isolar colônias unicelulares, as populações de estoque de glicerol com fermentação de xilose melhorada na presença de etanol são identificadas conforme descrito no protocolo de texto. Use essas populações superiores para estriar as placas.

As placas listradas são usadas para preparar suspensões de células tamponadas densas de um A620 igual a cinco. Em seguida, suspensões celulares são usadas para inocular pré-culturas em 96 placas de poços profundos. Incube por 48 horas a 25 graus Celsius, 400 RPM e órbita de uma polegada.

Em seguida, enriqueça as colônias tolerantes usando cada pré-cultura para inocular 16 culturas replicadas de um mililitro para um A620 inicial de 0,5 em licor hidrolisado de switchgrass pré-tratado com ácido, misturado um a um com ODM mais 50 gramas por litro de xilose e etanol suficiente para fornecer um desafio de 20, 30 ou 40 gramas por litro de etanol. Incube por 48 horas a 25 graus Celsius, 400 RPM e órbita de uma polegada. Para cada estoque de glicerol diferente, colher os poços de cultura com maior concentração de etanol permitindo o crescimento e o uso de xilose.

Plaquear cada linha celular em ágar YM para obter colônias únicas prevalentes para preservar em glicerol. Escolha 10 colônias por linha celular e coloque cada uma em uma placa de ágar YM para preparação de estoque de glicerol. Após a adaptação em AFEX CSH, uma comparação dos desempenhos de fermentação em ODM entre a cepa original e as populações adaptadas revela que as populações adaptadas usam xilose de forma mais eficiente para produzir etanol mais rapidamente e em maiores quantidades.

Uma colônia tolerante ao hidrolisado foi desenvolvida para melhorar a tolerância ao etanol por seleção contínua de cultura em ODM contendo xilose e altos níveis de etanol. Todas as populações adaptadas superaram o genitor na capacidade de induzir o metabolismo da xilose na presença de 40 gramas por litro de etanol. Esses gráficos resumem os desempenhos de isolados tolerantes superiores avaliados em termos de taxas de absorção de xilose e rendimentos de etanol em relação à cepa original para cada formulação de PSGHL.

As melhores cepas selecionadas da triagem primária em PSGHL rico em xilose foram posteriormente selecionadas em três hidrolisados completos e o índice de desempenho relativo, ou RPI, foi calculado para a fermentação de cada isolado dentro de cada hidrolisado. Em seguida, foram calculados os índices de desempenho geral combinados para cada isolado. Cinco isolados, três, 14, 27, 28 e 33, apresentaram RPIs gerais acima de 60, o que os classificou como os mais robustos para todas as variações de hidrolisado e condições de nutrientes combinadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve saber como desafiar uma levedura fermentadora de xilose como scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 em um processo de evolução direcionado, enriquecer, isolar e avaliar derivados mais robustos que fermentam com mais eficácia açúcares mistos em hidrolisados não desintoxicados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada com um investimento de tempo diário em média de cerca de uma hora por dia. Mudanças significativas no processo de evolução podem ser documentadas em menos de quatro meses.

Ao tentar este procedimento, é importante salvar as populações que avançam regularmente, preparando os estoques de glicerol para congelar a 80 graus Celsius negativos. Isso permite a recuperação da população, avaliação periódica, isolamento ou reinício do processo de evolução. Para gerenciar várias mutações, lembre-se de rastrear regularmente a levedura sob condições específicas do processo para uma variedade de fenótipos.

O cálculo dos índices gerais de desempenho relativo adimensional, ou RPIs, com base em parâmetros cinéticos, permite a avaliação da classificação da cepa e da robustez a variações nas condições de fermentação, como tipo de hidrolisado e suplementação de nutrientes. As leveduras superiores decorrentes de cada fase do processo de evolução são candidatas ao sequenciamento do genoma, de modo que a natureza das melhorias, como tolerância ao inibidor, seja reduzida e o atraso dióxico possa ser compreendido e usado para o projeto de cepas biocatalíticas de próxima geração.