Name: Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a cultivar trofoblastos vilosos humanos primários em hipóxia/reoxigenação para estudar os efeitos protetores da melatonina contra o estresse oxidativo em complicações da gravidez.

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Apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC) (nº 262011-2009) para CV e bolsa de Pesquisa em Ciências Sociais e Comportamentais March of Dimes (#12-FY12-179) para CV e JTS; por bolsas de estudo para LSF do Ministère de l'éducation, de l'Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) e da Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, ao HC da Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, ao AAHT dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) e FRQ-Santé, e ao JBP do NSERC; por uma bolsa para o EMAS do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e do Programme de bourses d'excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.

Placentas foram obtidas imediatamente após partos vaginais espontâneos de gestações sem complicações no CHUM-St-Luc Hospital, Montreal, QC, Canadá, com o consentimento do paciente informado e aprovação dos comitês de ética (CHUM-St-Luc Hospital e INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Quebec, Canadá). 1. Isolamento e purificação de células das vilosidades citotrofoblasto <ol><li> Soluções e meios de comunicação <ol><li> Preparar por um meio de transporte complementar do meio modificado por Dulbecco-Glucose alta de Eagle (DMEM-HG) com 1% de antibiótico vol / vol (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar meios de cultura primária, completando DMEM-HG com v / v de soro fetal de bovino 10% (FBS), 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), 1% vol / vol de antibióticos (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) e armazenar a 4 ° C. media quentes a 37 ° C antesusar. </li><li> Prepare 4 L de solução salina (0,9% de cloreto de sódio peso / vol). </li><li> Prepare modificado Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) por adição de tampão HEPES 25 mM a 1x HBSS (pH 7,4). </li><li> Preparar uma solução fresca, quatro garrafas de solução de digestão com HBSS modificado (preparada no ponto 1.1.4), sulfato de magnésio (MgSO4), o cloreto de cálcio (CaCl2), a tripsina, a desoxirribonuclease IV (ADNase IV), e 1% de antibiótico vol / vol ( 10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina), como mostrado na Tabela 1. </li><li> Prepare gradiente de densidade media centrifugação <ol><li> Preparar a solução de mídia centrifugação de densidade, completando densidade media centrifugação com 10% vol / vol HBSS 10x. </li><li> Preparar 14 tubos de ensaio com uma solução de centrifugação de densidade media e HBSS modificado, como descrito na Tabela 2. </li><li> Misturar cada solução densidade (passo 1.1.6.2) vigorosamente antes de adicionar o seu conteúdo para o gradiente. Suavementeadicionar as soluções de densidade para um tubo de centrífuga de 50 ml de vidro com uma bomba peristáltica (1 ml / min), começando com a concentração mais elevada (70%). Evitar gotículas por drenagem das soluções contra a parede do tubo para manter a separação adequada de cada camada do gradiente. <ol><li> Na ausência de uma bomba peristáltica, aplicam-se as camadas muito cuidadosamente com pipetas de Pasteur. </li></ol></li></ol></li><li> Preparar tampão de corrida final, completando o tampão de corrida (ver tabela de materiais) com 2% em vol / vol de antibiótico / antimicótico (10.000 unidades / ml de penicilina G, 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina). Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> isolamento citotrofoblasto vilosidades Nota: Use estéril cirúrgico equipamentos, artigos de vidro, pipetas, frascos, etc. <ol><li> No dia do isolamento das vilosidades citotrofoblasto, em um banho de água a 37 ° C, aquecer as soluções digestões (do passo 1.1.5) e 70 mL de FBS. Nota: Use 50 ml de FBS para interromper as digestões e doremanescente 20 ml para o passo de congelação (1.2.22), que pode ser colocada em gelo uma vez descongelado. </li><li> Após o parto, trazer da placenta para o laboratório em meio de transporte arrefecido com gelo (a partir do passo 1.1.1) tão rapidamente quanto possível (menos do que 1 hora). </li><li> meio de transporte de descarte e sangue placentário no caixote do lixo líquido. Pesar a placenta e mergulhe em solução salina fria. </li><li> Medir e analisar as seguintes características: comprimento do cordão umbilical; localização do cordão umbilical; comprimento da placenta, largura, forma (oval, discóide); cor membrana; patologias estrutura cotilédones. Nota: Os dados são apresentados na secção de resultados. </li><li> Cortar o cordão umbilical ao lado de sua inserção da placenta (ou seja, na sua base com um 1 centímetro de raio círculo adicional em torno da medula). Mergulhar em 300 ml de solução fixadora tecido histológico (formalina a 10%) para posterior análise histológica. </li><li> Cortar toda a placenta em cubos de 5 x 5 x 5 cm. Lavar cuidadosamente (4 vezes x ~ 1 min) em sol solução salinabuição (0,9%) para remover as células sanguíneas até que a solução salina é clara. Descartar líquido de enxaguamento. </li><li> Em um vidro de relógio, remova as membranas da placenta e tecidos tritura para remover os vasos sanguíneos e calcificações. Mantenha os vasos sanguíneos firmemente com uma pinça e remover os tecidos usando as costas de uma tesoura Metzenbaum. <ol><li> Coloque placenta picada num funil de Buchner. Lavar com aproximadamente 100 ml de tampão de soro fisiológico. Continue picar até 30 - 35 g de tecido picada é obtido (plástico uso pesando barco e escala). Se necessário, mediu o restante da placenta para obter até três adicionais 30 - Preparações 35 g. Durante este tempo, coloque o tecido picada em um barco de pesagem no gelo. Nota: Esta etapa vai demorar cerca de 45 minutos a 1 hora. </li></ol></li><li> Adicionar a 30 - 35 g de tecido placentário triturada para um balão trypsinizing. Transferir 150 ml da solução de digestão preparada 1 (Tabela 1) ao balão trypsinizing e misture bem. </li><li> Colocar o balão trypsinizing emum agitador banho-maria durante 30 min a uma velocidade de não mais do que 50 ciclos / min e misturar manualmente o balão trypsinizing cada 5 min de digestão homogénea. </li><li> No final da primeira digestão, retirar o balão trypsinizing do banho de água e incliná-lo (45 ° C) durante 1 min para sedimentar o tecido placentário. Com um 10 ml pipeta estéril, remover e descartar aproximadamente 80 ml de sobrenadante. Evitar a aspiração do tecido. </li><li> Transferir 100 ml de solução de digestão de 2 (Tabela 1) para o balão trypsinizing; misture bem e repita o passo 1.2.9. </li><li> No final da segunda digestão, retirar o balão trypsinizing do banho de água e incliná-la 45 ° durante 1 min. Com uma pipeta de 10 ml estéril, remover 80 ml de sobrenadante e transferir cuidadosamente para um tubo de centrifugação, utilizando um filtro celular (100 um de malha). Transferir o sobrenadante filtrou-se para uma proveta contendo 2 ml de FBS a cada vez que o tubo de centrífuga é cheio. </li><li> Realizar a terceira digestão como descrito para osegunda digestão (1.2.11 e 1.2.12), utilizando 75 ml de solução de digestão 3. Em paralelo, executar as etapas de 1.2.15 a 1.2.16.1 para a digestão 2. </li><li> Execute o quarto digestão exatamente como a terceira digestão usando a solução de digestão 4 (75 ml), mas cobrar um montante máximo de sobrenadante. Execute as etapas de 1.2.15 a 1.2.16.1 em paralelo para a digestão 3, e, finalmente, para a digestão 4. </li><li> Alíquota do sobrenadante (de digestões 2, 3 e 4) em 13,5 ml partes, cada parte em um tubo de centrífuga de 15 ml. Com um 22,8 cm de comprimento pipeta de Pasteur de vidro, muito suave e lentamente colocar 1,5 ml de FBS a parte inferior de cada tubo, a fim de criar uma camada separada. Não misture FBS e sobrenadante. Centrifugar os tubos sem freio durante 20 minutos a 1.250 xg à temperatura ambiente. Nota: Após a centrifugação, 4 camadas são visíveis no tubo, conforme mostrado na Figura 1 A separação de células de tripsina e trofoblasto evita a digestão celular excessiva.. </li><li> Com uma bomba de vácuo, ASPIRComeram e desprezar o sobrenadante (solução de digestão) e camadas de FBS, incluindo a película esbranquiçada entre as duas camadas. Ressuspender o sedimento (os trofoblastos e as camadas de células vermelhas do sangue) com 1 ml de meio de cultura de célula quente (passo 1.1.2; sem FBS e sem HEPES). <ol><li> Coletar células ressuspensos de todos os tubos e combiná-los em um tubo. Deixe o tubo de repousar à temperatura ambiente até que o fim de todas as digestões. Nota: Depois de todas as digestões, o rendimento habitual é de 3 tubos de células ressuspensas (um por digestão). </li></ol></li><li> Perfazer o volume de 15 ml com meio de cultura celular quente. Centrifugar a 1.250 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante com uma bomba de vácuo. Evite aspirar o pellet. </li><li> Suavemente ressuspender o sedimento, obtido a partir dos 3 tubos com 1 ml de meio de cultura de célula quente. Piscina seu conteúdo em um tubo. Para obter 8 ml, completar o volume com meio de cultura celular quente. </li><li> Muito gentilmente camada da suspensão de células em um grad separaçãotário com uma pipeta de Pasteur. Centrifugar sem travão durante 30 min a 507 xg à temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, identificar as diferentes camadas de células em gradiente com iluminação traseira. Localizar as camadas contendo trofoblasto e células contaminantes entre 40 - 50% de meio de centrifugação de densidade. Com uma bomba de vácuo, remover camadas superiores (&gt; 50%). </li><li> Recolhe células localizadas nas camadas de interesse com uma pipeta de Pasteur e transfere-os para um tubo de centrífuga de 50 ml. Completar o volume a 50 ml com meio de cultura celular. Centrifugar durante 10 minutos a 1250 xg à temperatura ambiente. </li><li> Sob condições estéreis, descartar o sobrenadante, ressuspender o sedimento com 20 ml de SBF e contar o número de células utilizando um hemocitómetro. No gelo, adicionar 2,22 ml de dimetilsulfóxido estéril (DMSO) e misture delicadamente por lançando. Aliquota de 1,5 ml de suspensão de células em frascos criogénicos, congelar durante a noite a -80 ° C e transferido para um tanque de azoto líquido. </li></ol></li> &lt;li&gt; purificação Trophoblast <ol><li> Instalar o enxaguamento e tampões em execução e uma nova coluna de filtro no aparelho magnético de purificação de acordo com as instruções do fabricante. Execute o programa &quot;limpa&quot; para limpar portas negativos 1, positivo 1 e 2 positiva, e depois introduzir os tubos de 50 ml em cada porta de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Descongelar as células que foram congelados no passo 1.2.22 rapidamente num banho de água a 37 ° C. Transferir as células para um tubo de 50 ml e ressuspender as células suavemente com 20 ml de solução tampão fria corrente. Centrifugar o tubo durante 5 min a 450 xg e 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante. Repita o passo de lavagem com tampão corrente fria. Contagem de células utilizando um hemocitómetro para determinar a viabilidade. Repetir a centrifugação (durante 5 min, 450 xg, a 4 ° C). Remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicionar 1 ml de tampão de corrida frio contendo 1% vol / vol de anticorpos anti-HLA-ABC rato. Incubar a 4 ° C durante 30 min, mixing suavemente a cada 5 minutos. </li><li> Adicionar 6 ml de tampão corrente fria. Centrifugar durante 5 min a 450 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e repita esta etapa. Ressuspender as células em 1 ml de tampão de corrida frio contendo 10% vol / vol de anti-rato esferas magnéticas acopladas-anticorpo secundário. Incubar a 4 ° C durante 15 minutos, misturando suavemente a cada 5 min. </li><li> Adicionar 6 ml de tampão corrente fria. Centrifugar durante 5 min a 450 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 5 ml de tampão fria corrente. </li><li> Separaram-se as células trofoblásticas usando o instrumento de purificação magnética. Coletar células no porto negativo e adicionar 20 ml de tampão corrente fria. Nota: as células trofoblásticas não contêm o complexo HLA-ABC, e são, assim, separadas de outros tipos de células e dirigido para a porta de um negativo. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 450 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e gentilmente voltar a suspender as células em 20 ml de meio de cultura primária quente. Contar as células usinga hemocitômetro para determinar a viabilidade. </li><li> Placa as células com as seguintes densidades: 0,15 X 10 6 células / poço em placas de 96 poços, 1,6 x 10 6 células / poço em placas de 24 poços e 4,5 x 10 6 células / poço em placas de 6 poços. Incubar as placas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Confirmar a pureza das células trofoblásticas por citometria de fluxo 16,17 e / ou 18 por imunocitoquímica. Nota: A pureza das células imunopurificados foi determinado usando anticorpos monoclonais conjugados com FITC contra a citoqueratina 7-vimentina e 17-19. Este protocolo é bem detalhado no Lanoix et al., 2008 7. </li><li> Depois de pelo menos 4 h, lavar as células duas vezes com meio de cultura quente para remover células não ligadas e, em seguida, transferir as placas para a câmara de normoxia, o qual é composto de 8% de O2 (ver Figura 2 e na secção 2). </li></ol></li></ol> 2. In Vitro Induction de normóxia e hipóxia / reoxigenação <ol><li> Operação de câmara incubadora (ver Figura 2A para set-up). <ol><li> Em uma câmara de fluxo laminar, colocar uma placa de Petri contendo água esterilizada na parte inferior da câmara de incubadora para evitar a secura; em seguida, colocar as placas de cultura de células previamente preparados ou frascos (passo 1.3.10) nas prateleiras superiores da câmara. </li><li> Do lado de fora o capuz, anexar a câmara (abertura de entrada) para o tubo de gás (Figura 2A: 5a, b e c) para chegar ao tubo de gás (8% de O2 ou 0,5% de O2) (Figura 2A: 7). Abrir ambas as portas de entrada e de saída da câmara. Neste momento, o regulador de gás (Figura 2A: 4) deve permanecer fechada. </li><li> Cuidadosamente abra a válvula reguladora de gás (Figura 2A: 4). Lavar durante 4 min com um fluxo de ar de 25 L / min para substituir completamente o ar no interior da câmara. </li><li> Após a lavagem da câmara, feche o regulador de gás, em seguida, a entrada e ouportos tlet da câmara. </li><li> Desligue o tubo de saída do medidor de caudal (Figura 2A: 5c) da porta de entrada da câmara e a câmara de colocar numa incubadora de cultura de células a 37 ° C. </li><li> Substituir o ar actualmente presente nas placas, frascos e dissolveu-se no meio de cultura através do preenchimento com a câmara de gás 1 h após o passo 2.1.3. </li><li> Repita os passos 2.1.1 a 2.1.6 para as outras composições de gás (por exemplo, 2% de O 2 para o primeiro trimestre trofoblasto cultura 9). </li></ol></li><li> Confirmar a porcentagem de oxigênio (Figura 2B-C) <ol><li> Para confirmar a concentração de oxigénio no meio de cultura celular (sem células) no interior da câmara, usar um eléctrodo de oxigénio ligado a um adaptador de oxigénio. Ligue o eléctrodo de oxigénio a um voltímetro. </li><li> Criar uma curva de calibração na mesma solução (isto é, meio de cultura celular) por exposição da solução a gases com teor de oxigénio conhecida (por exemplo, 0% e21% de oxigénio). Após as leituras são estabilizados para cada concentração, introduzir o eléctrodo para o meio na câmara. Nota: Tome todas as medições na mesma profundidade, a fim de evitar qualquer distorção da concentração de oxigênio 10. </li></ol></li><li> Indução de normóxia e hipóxia / reoxigenação em trofoblastos. <ol><li> Após a adição de células trofoblásticas primárias para os frascos de cultura de células apropriadas, placas ou placas de Petri, realizar tratamentos, se necessário. </li><li> Em paralelo, no interior da câmara, para expor as células a mistura de gás desejado para reproduzir uma condição específica a cada 24 h (Figura 3). </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Nos mamíferos, o desenvolvimento fetal é diretamente dependente da função placentária adequada. As origens do desenvolvimento de distúrbios de saúde baseiam-se na hipótese de que a causa de doenças que se manifestam mais tarde na vida pode ser rastreada até ao início do desenvolvimento e que a placenta tem um papel mecanicista na programação fetal 30-32. A placenta é o mediador chave do crescimento e desenvolvimento fetal: regula a transferência de nutrientes, protege contra as exposições prejudiciais, e tem ...

Durante a gravidez humana, as células citotrofoblasto da placenta, que são células mononucleadas de haste, proliferam rapidamente e se diferenciam em células quer citotrofoblasto vilosos ou extravilosas. citotrofoblastos extravilosas invadir e remodelar as artérias em espiral da parede uterina. Citotrofoblastos viloso, por outro lado, continuar a proliferar, diferenciar-se e fundem para formar trofoblasto multinucleadas (a sincício) 1. A manutenção da homeostase trofoblasto viloso é essencial para o bem-estar fetal e gravidez saudável. Na verdade, trofoblastos vilosidades permitir a troca materno-fetal de oxigênio e nutrientes, e produzir hormônios essenciais para a gravidez. Além disso, o trofoblasto é o único tipo de célula em contacto directo com a circulação do sangue materno e proporciona uma barreira física e imunológica essencial. Portanto, o sinciciotrofoblasto deve sofrer apoptose e substituição para a manutenção da homeostase e avoid placentária patologias 2-5. A técnica desenvolvida pela Kliman et ai. 6, em 1986, para isolar citotrofoblastos vilosidades primárias a partir de placentas humanas causou uma revolução no domínio da investigação de placenta, permitindo que o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na diferenciação trofoblasto viloso. Esta técnica clássica, com base em digestões enzimáticas sequenciais com tripsina e DNase, seguido pelo isolamento em meio de centrifugação de densidade (partículas de sílica coloidal revestido por polivinilpirrolidona, ou Percoll) é hoje reconhecida como o padrão de ouro para o isolamento de células citotrofoblasto vilosidades. A técnica pode ser optimizado por imunopurificação magnética, um processo que separa citotrofoblastos vilosidades a partir de células não-trofoblásticas com base na expressão diferencial de antigénios específicos nas superfícies destas células. Nós escolhemos o antigénio de leucócitos humanos ABC (HLA-ABC), devido à ausência da sua expressão na célula Membran trofoblásticae 7,8. A placenta é um órgão que sofre variações dramáticas em níveis de oxigénio durante a gravidez. No primeiro trimestre, a relação de oxigenação é fisiologicamente muito baixa (2% de O 2), mas aumenta para níveis moderados de oxigenação (8% de O2) no segundo e terceiro trimestre. Tuuli et al. 9 descrito que a reprodução in vitro do meio ambiente trophoblast dentro das vilosidades da placenta é um desafio e variações nos níveis de oxigenação pode até levar a mudanças fenotípicas. É, por conseguinte, sugerido para adoptar 8% de oxigénio como normóxia para imitar a tensão de oxigénio encontradas em vilosidades da placenta durante o terceiro trimestre da gravidez 8,9. Chen et al. 10 extensivamente estudadas diversas variáveis ​​relacionadas com a tensão de oxigênio em cultura de células trofoblasto e demonstrou a importância de determinar os níveis de oxigênio em um ambiente pericelular. Os níveis de oxigénio no vilosidades tendem a aumentardevido à vasculogénese. O fluxo de sangue no vilosidades aumentos placentários constantemente e o nível de peróxido de hidrogênio (uma espécie abundante reativas de oxigênio) é um sinal importante que controla vasculogï¿½ese 11,12. Em complicações na gravidez, a falta de vasculogï¿½ese gera hipóxia, e mais importante, as variações intermitentes de oxigenação (chamada hipóxia / reoxigenação). Estas condições levam a um aumento anormal de estresse oxidativo, o que compromete placentária e 13,14 viabilidade fetal. As alterações que se submetem a células trofoblásticas in vivo durante episódios de hipoxia / reoxigenação pode ser mimetizado in vitro, como segue: citotrofoblastos vilosidades são mantidas sob condições de normóxia (8% O 2) até que se diferenciam em trofoblasto. Elas são então submetidas a condições de hipóxia (0,5% de O2) durante 4 horas, seguido de um adicional de 18 h de normóxia (reoxigenação). Usando essa abordagem hipóxia / reoxigenação, trofoblastos exHiBit desregulada estado redox e níveis aumentados de apoptose intrínseca 8, como tem sido observada em certas complicações na gravidez. Assim, este é um útil modelo in vitro para avaliar novas abordagens terapêuticas e preventivas para combater a complicações na gravidez associados com placentária hipoxia / reoxigenação. Células da placenta produzir melatonina, que tem várias funções importantes, tais como a capacidade de evitar o estresse oxidativo e disfunção placentária 15. Aqui, apresentamos os modelos de abordagem e de células experimentais utilizados para demonstrar os efeitos protectores da melatonina em células trofoblásticas da placenta, a nível molecular, celular e funcional 8.

<table><tbody><tr><td>Tesoura Curva Metzenbaum</td><td>Shandon</td><td>9212</td><td>equipamento cirúrgico (isolamento celular) (2 unidades)</td></tr><tr><td>Pinça de Estilhaços Fina 41/2 in</td><td>Fisherbrand</td><td>13-812-42</td><td>equipamento cirúrgico (isolamento celular) (2 unidades)</td></tr><tr><td>Tesoura 4.5 Str Dissecção</td><td>Fisherbrand</td><td>08-940</td><td>equipamento cirúrgico (isolamento celular) (2 unidades)</td></tr><tr><td>Esponja de Gaze 10 cm x 10 cm</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td>361020733</tr><tr><td>Assadeira de Vidro Oblongo</td><td>Pyrex</td><td>1105397</td><td>Glassware (2.8 L)</td></tr><tr><td>Funnel Buchner</td><td>Coorstek Inc</td><td>10-356E</td><td>Glassware (114 mm de diâmetro)</td></tr><tr><td>Watch Glass&nbsp;</td><td>pyrex</td><td>9985100EMD</td><td>Vidraria</td></tr><tr><td>Solução de formalina, tamponado neutro, 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>solução fixadora de tecido histológico</td></tr><tr><td>Frascos de tripsinização</td><td>Wheaton</td><td>355395</td><td>Vidraria (1 unidade)</td></tr><tr><td>Tubos de cultura descartáveis</td><td>Kimble</td><td>73750-13100</td><td>Vidraria</td></tr><tr><td>Pasteur de vidro borossilicato (22,8 cm)</td><td>Fisherbrand</td><td>K63B1367820C</td><td>Copos</td></tr><tr>de<td>Vidro de 250 ml</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14005250</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de Mídia de Vidro com Tampa</td><td>Fisherbrand</td><td>KFS14395250</td><td>Glassware (8 unidades)</td></tr><tr><td>Tubo Corex de 50 ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>8422-A</td><td>(1 unidade)</td></tr><tr><td>15 ml Tubo de Centrífuga de Poliestireno</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo de Centrífuga de Poliestireno</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta Sorológica</td><td>Corning</td><td>11415038</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &mu; m Forro</td><td>Absorvente 431752</td><td></td>de Nylon <td>Corning</td></tr><tr><td></td><td>Scienceware</td><td>1199918</td><td></td></tr><tr><td>500&nbsp; ml Garrafas Top Filter</td><td>Corning</td><td></td><td>Pore: 0.22&nbsp; &micro; m / médio e preparação HBSS</td></tr><tr><td>2 ml Frascos criogênicos</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>recipiente de congelamento, Nalgene Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Pharmacia Fine Chemicals</td><td>P3 modelo</td><td></td></tr><tr><td>Banho maria agitado</td><td>Fisher</td><td>modelo 127</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>ABM</td><td>4EKFS6CX-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisherbrand</td><td>EC231-598-3</td><td>Solução salina 0,9%</td></tr> <tr><td>Hank ' s Solução salina tamponada (Hbss)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387</td><td>Quantidade: 9,25 (um frasco) para 1 L de solução de digestão</td></tr><tr><td>Ácido hidroxipiperazineetanossulfônico (Hepes)</td><td><a name="RANGE! B29">Life Technologies</a></td><td>15630-080</td><td>25 ml (1 M) para 1 L de solução de digestão</td></tr><tr><td>Tripsina Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8003</td><td>9.888 U</td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease Tipo Iv</td><td>Roche</td><td>10-104-159-001</td><td>402.000 U</td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio</td><td>Baker</td><td>2500-01</td><td>800 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem)</td><td>Life Technologies</td><td>10564-045</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomycin Sulphate</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td>Gradiente de meio de centrifugação de densidade. Volume: 36 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Acros</td><td>42383-0010</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Separador Magnético&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Modelo 003</td><td></td></tr><tr><td>Automacs&nbsp; Colunas&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Automacs Running Buffer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1</td></tr><tr><td>Automacs Solução de Enxágue&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx</td></tr><tr><td>Clone Purificado Anti-Human Hla Abc W6/32</td><td>Affymetrix eBioscience</td><td>14-9983-82</td><td>anticorpo anti-rato</td></tr><tr><td>Microesferas Igg Anti Mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130048401</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Poço Múltiplo -&nbsp; 6 Poços Com Tampa</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Superfície de ligação celular</td></tr><tr><td>Placa de poços múltiplos -&nbsp; 24 Poços com tampa</td><td>Corning</td><td>3337</td><td>Superfície de ligação celular</td></tr><tr><td>Placa de múltiplos poços -&nbsp; 96 Poços com tampa</td><td>Corning</td><td>3300</td><td>Superfície de ligação celular</td></tr><tr><td>Câmara de incubadora modular&nbsp;</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Um conjunto de dois é necessário para condições simultâneas de geração de normóxia e hipóxia/reoxigenação</td></tr><tr><td>Medidor de Fluxo Único</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>SFM3001</td><td></td></tr><tr><td>Filtro em Linha de 50 mm</td><td>Whatman</td><td>6721-5010</td><td>PTFE, poro: 1.0 &micro; m</td></tr><tr><td>Regulador de Gás</td><td>Pro Star</td><td>PRS301233</td><td>Um conjunto de dois é necessário para condições simultâneas de geração de normóxia e hipóxia/reoxigenação</td></tr><tr><td>Mangueira de Gás Classe Vi Transparente 5/16&nbsp;</td><td>Parker</td><td>100-05070102</td><td>3 peças com ~ 0,5 m</td></tr><tr><td>17 mm Braçadeira de Mangueira de Gás Ajustável</td><td>Tiewraps</td><td>THCSS-16</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de Gás Normoxia&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Tamanho K (3rd composição do trimestre: 5% CO2, 8% O2, Bal. Cilindro de Gás N2)</td></tr><tr><td>Normoxia&nbsp;</td><td>Praxair</td><td>NI CDOXR1U-K</td><td>Tamanho K (3rd composição do trimestre: 5% CO2, 0,5% O2, Bal. Microeletrodo de Oxigênio N2)</td></tr> <tr>Microeletrodos <td>de Oxigênio MI-730</td><td>Microeletrodos Adaptador</td> de Oxigênio INC <td>3572</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Detecção de ROS: CM-H2DCFDA&nbsp;</td><td>Kit ELISA Invitrogen</td><td>C-400</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-hCG</td>;<td>DRG internatinal</td><td>EIA-4115</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentina purificado anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>14-9897</td><td>Host: camundongo</td></tr><tr><td>Anti-Citoqueratina 7 (FITC) anticorpo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab119697</td><td>Anfitrião: mouse</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Cabra Anti-mousse IgG H & L anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11029</td><td></td></tr></tbody></table>

trophoblast primário humano cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / disruption induzida pela reoxigenação

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Este protocolo descreve como as células citotrofoblásticas vilosas são isoladas das placentas a termo por sucessivas digestões enzimáticas, seguidas de centrifugação por densidade, isolamento de gradiente de meio e purificação imunomagnética. Como observado in vivo, as células citotrofoblásticas vilosas mononucleadas em cultura primária se diferenciam em células sinciciotrofoblásticas multinucleadas após 72 horas. Em comparação com a normóxia (8% O2), as células citotrofoblásticas vilosas que sofrem hipóxia/reoxigenação (0,5% / 8% O2) sofrem aumento do estresse oxidativo e apoptose intrínseca, semelhante ao observado in vivo em complicações da gravidez, como pré-eclâmpsia, parto prematuro e restrição de crescimento intrauterino. Nesse contexto, os trofoblastos vilosos primários cultivados em condições de hipóxia/reoxigenação representam um sistema experimental único para entender melhor os mecanismos e vias de sinalização que são alterados na placenta humana e facilitar a busca por medicamentos eficazes que protejam contra certos distúrbios da gravidez. Os trofoblastos vilosos humanos produzem melatonina e expressam suas enzimas e receptores sintetizadores. A melatonina tem sido sugerida como tratamento para pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intrauterino devido aos seus efeitos antioxidantes protetores. No modelo de células do citotrofoblasto viloso primário descrito neste artigo, a melatonina não tem efeito sobre as células trofoblásticas em estado normóxico, mas restaura o equilíbrio redox das células sinciciotrofoblásticas interrompidas pela hipóxia/reoxigenação. Assim, as células trofoblásticas vilosas humanas em cultura primária são uma excelente abordagem para estudar os mecanismos por trás dos efeitos protetores da melatonina na função placentária durante a hipóxia/reoxigenação.

Isolamento e imunopurificaï¿½o de células citotrofoblasto vilosidades da placenta normais prazo obtidos por parto vaginal rendeu 1 x 10 8 células viáveis. A placenta pesava 350 g, foi de 19 cm de diâmetro, 4 cm de altura com forma discóide e membranas transparentes. Nenhuma malformação cotilédones foi detectada. O cordão umbilical teve localização paracentral e um comprimento de 56 cm. A pureza foi avaliada por citometria de fluxo usando-vimentina e citoqueratina 7 marcadores....

Este manuscrito apresenta um modelo in vitro único de células citotrofoblásticas vilosas humanas imunopurificadas cultivadas sob hipóxia/reoxigenação. Este modelo é adequado para estudar os efeitos protetores de tratamentos promissores, como a melatonina, nas complicações da gravidez associadas ao aumento do estresse oxidativo e à alteração da função placentária.

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar os efeitos protetores da melatonina utilizando células primárias de citotrofoblasto viloso humano imunopurificadas, cultivadas sob hipóxia ou reoxigenação. Este método pode ajudar a compreender os mecanismos e vias de sinalização associados às complicações gestacionais com placenta sob hipóxia e reoxigenação. A principal vantagem desta técnica é que ela é adequada para estudar tratamentos promissores, como a melatonina, em distúrbios gestacionais associados ao aumento do estresse oxidativo.Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades com as etapas de isolamento de citotrofoblastos vilosos, como a piqueação dos tecidos e a preparação do gradiente mediano de centrifugação em densidade. Embora este método possa fornecer informações sobre o trofoblasto do terceiro trimestre, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a placenta do primeiro trimestre e a placenta de outras espécies. A demonstração visual deste método é importante, pois muitas etapas são difíceis de aprender sem vê-las, o que pode aumentar a reprodutibilidade e reduzir o tempo de aprendizado.Os estudantes de pós-graduação Andree-Anne Hudon-Thibeault, Philippe Wong Yen e Eugenia Assuncao do meu laboratório demonstrarão o procedimento. Para iniciar este procedimento, corte o cordão umbilical ao longo da sua inserção placentária e mantenha-os em 300 ml de solução fixadora de tecidos para análise histológica. Em seguida, corte toda a placenta em cubos.Lave os fragmentos repetidamente em solução salina para remover as células sanguíneas até que a solução salina fique límpida. Em seguida, remova as membranas placentárias e pique os tecidos para remover ainda mais os vasos sanguíneos e permitir as calcificações. Então, segure os vasos sanguíneos firmemente com pinça e remova os tecidos picados.Depois disso, coloque a placenta picada em um funil de Büchner e lave os tecidos com 100 ml de solução salina tamponada. Continue picando até obter de 30 a 35 gramas de tecidos picados e coloque-os em um barquinho de pesagem sobre gelo. Posteriormente, adicione os tecidos placentários picados a um frasco de tripsinização.Em seguida, transfira 150 ml da solução de digestão preparada 1 para o frasco de tripsinização e misture bem. Coloque o frasco de tripsinização em banho-maria agitado por 30 minutos e misture manualmente o frasco de tripsinização a cada cinco minutos para homogeneizar a digestão. Ao final da primeira digestão, retire o frasco de tripsinização do banho-maria e incline-o em 45 graus por um minuto para sedimentar os tecidos placentários.Com uma pipeta estéril de 10 ml, remova e descarte aproximadamente 80 ml do sobrenadante sem aspirar o tecido. Em seguida, transfira 100 ml da solução de digestão 2 para o frasco de tripsinização e misture bem. Coloque o frasco de tripsinização em um banho-maria agitado por 30 minutos e misture manualmente o frasco de tripsinização a cada cinco minutos para garantir uma digestão homogênea.No final da segunda digestão, retire o frasco de tripsinização do banho-maria e incline-o em 45 graus por um minuto. Remova 80 ml do sobrenadante e transfira suavemente para um tubo de centrífuga com um filtro celular de malha de 100 micrômetros. Realize as terceira e quarta digestões e alíquotas do sobrenadante das digestões duas, três e quatro em partes de 13,5 ml nos tubos de centrífuga de 15 ml.Em seguida, adicione 1,5 ml de soro bovino fetal (FBS) suave e lentamente na parte inferior de cada tubo, de modo a criar uma camada distinta. Centrifugue os tubos por 20 minutos à temperatura ambiente. Após isso, aspire e descarte as camadas de sobrenadante e de FBS, incluindo a película esbranquiçada entre as duas camadas.Resuspenda o pellet em 1 ml de meio de cultura celular morno. Colete as células ressuspendidas de todos os tubos e reúna-as em um único tubo por digestão. Em seguida, complete o volume para 15 ml com meio de cultura celular morno.Centrifugue as células por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o sobrenadante com uma bomba de vácuo e evite aspirar o pellet. Após isso, ressuspenda suavemente o pellet com 1 ml de meio de cultura celular morno.Agrupe o conteúdo dos tubos de todas as digestões. Adicione meio de cultura celular morno adicional para obter um volume de 8 ml. Em seguida, sobreponha suavemente a suspensão celular em um gradiente de separação e centrifugue por 30 minutos à temperatura ambiente.Após a centrifugação, identifique as diferentes camadas de células no gradiente com retroiluminação. Localize as camadas contendo trofoblastos e as células contaminantes entre 40% e 50% do meio de centrifugação em densidade e remova as camadas superiores com uma bomba de vácuo. Posteriormente, colete as células localizadas nas camadas de interesse e transfira-as para um tubo cônico de 50 ml.Complete o volume até 50 ml com o meio de cultura celular e centrifugue por 10 minutos à temperatura ambiente. Em condições estéreis, descongele rapidamente as células que foram congeladas no passo 1.2.22 em um banho-maria a 37 graus Celsius. Transfira as células descongeladas para um tubo de 50 ml e re-suspenda-as suavemente com 20 ml de tampão de corrida frio.Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e repita a etapa de lavagem com tampão corrente frio. Então, conte as células utilizando um hemocitômetro para determinar sua viabilidade, seguido pela repetição da centrifugação novamente.Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 1 ml de tampão de corrida frio contendo 1% volume por volume de anticorpo anti-HLA ABC de camundongo às células. Incube as células a 4 graus Celsius por 30 minutos, misturando suavemente a cada cinco minutos. Após a incubação, adicione 6 ml de tampão de corrida frio e centrifugue por 5 minutos a 4 graus Celsius.Descarte o sobrenatante e repita este passo. Em seguida, ressuspenda as células em 1 ml de tampão de corrida frio contendo 10% em volume de anticorpo secundário anti-rato conjugado a microesferas magnéticas. Depois disso, incube as células a 4 graus Celsius por 30 minutos, misturando suavemente a cada 5 minutos novamente.Em seguida, adicione 6 ml de tampão de corrida frio e centrifugue por 5 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 5 ml de tampão de corrida frio. Após isso, separe as células trofoblásticas utilizando o instrumento de purificação magnética e colete as células na saída negativa.Adicione 20 ml de tampão de corrida frio às células e centrifugue por 5 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em 20 ml de meio de cultura celular primário morno contendo 10% de FBS antes de contar as células para determinar a viabilidade. Em seguida, plaque as células e incube-as a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Após pelo menos quatro horas, lave as células duas vezes com meio de cultura morno para remover quaisquer células não aderidas. Em seguida, transfira as placas para a câmara de normóxia, que será preenchida com 8%O₂. Fora da cabine de segurança, conecte a entrada da câmara à mangueira de gás para alcançar o tubo de gás.Abra ambas as portas de entrada e saída da câmara e mantenha o regulador de gás fechado. Em seguida, abra cuidadosamente a válvula do regulador de gás e realize uma purga com fluxo de ar de 25 litros por minuto durante 4 minutos para substituir completamente o ar no interior da câmara. Após a purga da câmara, feche o regulador de gás, seguido pelas portas de entrada e saída da câmara.Desconecte a mangueira de saída do medidor de fluxo da porta de entrada da câmara e coloque a câmara em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por uma hora. Substitua o ar atualmente presente nas placas, frascos e dissolvido no meio de cultura reenchendo a câmara com gás a uma taxa de fluxo de 25 litros por minuto durante 4 minutos. Esta figura mostra o efeito da melatonina sobre a secreção de gonadotrofina coriônica humana beta durante a diferenciação do trofoblasto viloso.A diferenciação bioquímica dos citotrofoblastos vilosos em sinciciotrofoblastos foi determinada pelos valores crescentes de beta-hormônio gonadotrofina coriônica humana, que atingiram um valor máximo após 72 horas de cultivo celular, conforme mostrado aqui. O tratamento com melatonina não teve efeito sobre a diferenciação de citotrofoblastos cultivados em 8% de oxigênio, em comparação com o controle veicular. Mostra-se aqui o efeito da melatonina a 1 milimolar sobre os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio em células de sinciciotrofoblasto sob normóxia ou após reoxigenação induzida por hipóxia, após 72 horas de cultivo.O tratamento com melatonina protege os sinciciotrofoblastos contra o estresse oxidativo aumentado pela hipóxia e reoxigenação, restaurando os níveis de espécies reativas de oxigênio aos níveis de normóxia. Este esquema ilustra os amplos efeitos protetores intercelulares da melatonina contra o estresse oxidativo induzido pela hipóxia-reoxigenação e contra a apoptose mitocondrial em sinciciotrofoblastos primários. Uma vez dominada, a técnica de isolamento pode ser realizada em oito horas, e três horas são suficientes para obter células trofoblásticas purificadas, se for realizada corretamente.Após seu desenvolvimento, a técnica de isolamento, purificação e cultura primária de citotrofoblastos sob hipóxia-reoxigenação abriu caminho para uma melhor compreensão das complicações da gravidez e para a melhoria da saúde placentária e fetal. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de avaliar a pureza das células trofoblásticas vilosas ao final da imunopurificação. Por exemplo, por citometria de fluxo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar um citotrofoblasto primário viloso imunopurificado e cultivá-lo sob hipóxia-reoxigenação.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Aprenda a cultivar trofoblastos vilosos humanos primários em hipóxia/reoxigenação para estudar os efeitos protetores da melatonina contra o estresse oxidativo em complicações da gravidez.

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Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

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