Name: A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas ( Terrestris do Bombus) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a avaliar a sensibilidade gustativa de abelhas Bombus terrestris em movimento livre. Este ensaio comportamental mede respostas alimentares detalhadas a nutrientes e toxinas, fornecendo dados sobre mecanismos neurais e detecção de substâncias.

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Este trabalho foi financiado pela concessão Leverhulme Trust (RPG-2012-708) e uma subvenção BBSRC (BB / M00709X / 1) para GAW.

1. A captura das abelhas da colônia e do período de jejum Nota: Os experimentos aqui descritos foram realizados na Universidade de Newcastle, no Reino Unido com Bombus terrestris audax. Múltiplos (2-3) adquirida comercialmente colônias foram usadas por tratamento. As colônias foram mantidas em um banco em condições de laboratório (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% RH) na escuridão constante e foram alimentados com mel de abelha recolhido pólen e soluções de açúcar ad libitum. <ol><li> Recolha trabalhador individual abelhas utilizando um frasco de plástico (7 cm de comprimento, 2,8 cm de diâmetro interno) com uma rolha de plástico perfurado, depois de ter aberto o portão para a colônia apenas o tempo suficiente para uma abelha para sair e ser preso. </li><li> Antes do experimento, fome individualmente todas as abelhas para 2-4 hr nos frascos de plástico e manter a temperatura ambiente na escuridão completa. </li></ol> 2. Transferência de abelhas dentro dos tubos de exploração ea HFase abituation <ol><li> Após o período de fome, transferir uma abelha diretamente do frasco de plástico em um tubo de retenção. O tubo de retenção é de 15 ml tubo de centrífuga modificado (comprimento: 119 milímetros; diâmetro de 17 milímetros), com um orifício de 4 milímetros perfurados na ponta e uma parte de malha de aço (base: 8 mm; altura 30 mm) fixada no interior por fusão o plástico do tubo com uma agulha de dissecação de aço aquecido. </li><li> Fixar o tubo de retenção contendo a abelha em um suporte de poliestireno com cera dental. Fixar duas peças de cartão em ambos os lados do tubo de retenção. Isto é para proteger a abelha a partir de estímulos visuais que possam interferir com a experiência. </li><li> Posicionar uma câmera microscópica digital de 5 cm acima da ponta do tubo de retenção e conectar a câmera a um computador portátil compatível. </li><li> Ajustar o tubo de espera de modo a que pelo menos os primeiros 18 mm de comprimento da ponta de tubo de retenção está dentro do quadro de vídeo. Antes do experimento, iniciar o período de habituação de 3 min. </li></ol> 3.Fase pré-teste: Apresentando uma gota de Sacarose <ol><li> Ligar uma seringa a um adaptador fêmea, contendo uma gota de solução de sacarose (~ 3,5 mL, sacarose 500 mM dissolvido em água desionizada). Apresentar a sacarose no interior da ponta tubo de retenção para motivar a extensão das tromba. </li><li> Dê a abelha até 5 min para consumir a gota de sacarose. Se a gota não é consumido, remover o abelha do experimento. </li><li> Iniciar a gravação de vídeo após o período de habituação. Neste estudo, a atividade tromba foi gravado em 26,7 frames / seg -1 com uma taxa de ampliação 25X. </li></ol> 4. Fase de Testes: Apresentar a solução de ensaio <ol><li> Encher um tubo microcapilar de 100 ul com a solução de teste. Conectá-lo a um pedaço de tubo de silicone (comprimento 6 cm, 1 mm de diâmetro interno) e corrigi-lo a um micro manipulador. <ol><li> Conecte o tubo através de um adaptador macho para outro tubo de silicone (6 cm de comprimento, 4 mm de diâmetro interno), whiCH actua como um bolbo de pipeta. </li><li> Posicione o microcapilar tubo de 5-10 mm de distância da ponta do tubo de retenção. Suavemente espremer o tubo para manter a solução de alimentação na ponta do tubo microcapilar. </li></ol></li><li> Depois da abelha consome a gota de sacarose, retire imediatamente a seringa contendo a solução de sacarose 500 mM. </li><li> Comece a fase de teste 2 min, quando do bumble contatos tromba a solução dentro do tubo microcapilar. <ol><li> Para controlar possíveis evaporação, encher dois tubos microcapilares adicionais com sacarose ou água e manipulá-lo exatamente como durante a fase de teste. </li></ol></li><li> Antes e após cada ensaio digitalizar os níveis de líquido no interior do tubo microcapilar usando um scanner a 600 dpi para medir a quantidade de alimentos consumidos (Figura 4A). </li></ol> 5. Análise de Imagem <ol><li> Determinar o volume de consumo de solução usando ImageJ (versão 1.48), um proc imagemessing software. <ol><li> Faça o upload do arquivo de imagem e zoom na imagem (~ 400%). Para definir a escala de referência, selecione a ferramenta linha reta e desenhar uma linha entre as duas extremidades do tubo microcapilar. Selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, &quot;Scale Definir &#39;. Introduza o comprimento total do tubo em &quot;distância conhecida &#39;ea unidade correspondente em&quot; Unidade de comprimento &quot;. </li><li> Selecione a ferramenta linha reta novamente e traçar uma linha entre as duas extremidades do nível do líquido. Selecione &quot;Analisar&quot;, em seguida, &#39;Medida&#39;. Na janela de resultados do comprimento do líquido é dado na coluna «comprimento». </li></ol></li><li> Calcular o volume de consumo de solução por meio da seguinte fórmula: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq1.jpg" /> Onde <img alt="equação 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq2.jpg" /> é o comprimento do tubo microcapilar e <img alt="equação 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233eq3.jpg" /> e <img alt= &quot;Equação 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54233 / 54233eq4.jpg&quot; /&gt; são os comprimentos medidos do líquido no interior do tubo microcapilar antes e após a fase de teste, respectivamente. </li></ol> 6. As análises de vídeo <ol><li> Marcar os comportamentos alimentares durante a fase de testes de 2 min de cada vídeo usando um software de registro de eventos (Ver Tabela de Materiais). <ol><li> No início, definir os comportamentos alimentares (ie. Os elementos) no menu aulas de comportamento do software de gravação. Os comportamentos de alimentação são como se segue: (1) proboscis out / contato: a tromba se estende e está em contacto com a solução dentro do tubo microcapilar (2) proboscis out / nenhum contato: a tromba se estende e não está em contacto com a solução dentro do tubo microcapilar, (3) tromba estivada: a tromba não for prorrogado, mas em vez arrumadas sob a cabeça e (4) fora de vista: a abelha está fora do quadro de vídeo. </li><li> Definir cada comportamentocomo um &#39;estado&#39; e &#39;mutuamente exclusivas &quot;no menu de propriedades e fazer gravações contínuas para um intervalo de 2 min. Reproduzir os vídeos no modo slow-motion (2 vezes mais lento) para obter mais precisão. </li></ol></li><li> Medir a velocidade de retracção tromba a partir da solução de ensaio após o primeiro contacto entre duas molduras consecutivas (separadas por 37,5 mseg nas gravações de vídeo mostrados aqui) utilizando um software de seguimento de movimento de vídeo (ver Materiais Tabela). <ol><li> Faça o upload do arquivo de vídeo e pular para o quadro onde a tromba primeiros contatos a solução. </li><li> Para definir a escala de referência, selecione a ferramenta de linha e desenhar uma linha na largura do tubo microcapilar no quadro do vídeo. Botão direito do mouse na linha e selecione &quot;Calibrar medida &#39;. A largura de entrada do tubo capilar e a unidade correspondente. </li><li> Selecione &#39;Imagem&#39; depois &#39;Coordenar origem do sistema&#39;. Na nova janela, clique na ponta da tromba e selecione9; Aplicar &#39;. </li><li> Selecione a ferramenta mover a mão, clique direito sobre a ponta da tromba no quadro de vídeo e selecione &#39;Path Track&#39;. Mover para o próximo quadro e reajustar o ponto de rastreamento para a ponta da tromba. </li></ol></li><li> Botão direito do mouse sobre o ponto de rastreamento e selecione &quot;Configuração&quot;. Selecione &#39;Caminho completo&#39; e selecione &#39;Speed&#39; sob medida. Selecione &quot;Aplicar&quot;. A velocidade é então exibido. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Com este romance ensaio comportamental, quinino é mostrado para impedir a alimentação da abelha rabo-de-buff. O tempo de contato tromba reduzida e frequência de ataque de alimentação com água ou a solução de sacarose atado com quinino é interpretada aqui como uma recusa de iniciar ainda alimentando-se de soluções não nutritivos ou potencialmente tóxicos. Quando quinina é adicionado à solução de 1 M de sacarose, as abelhas não só reduzir o volume de solução que consomem, eles também retrair a tromba mais rápido, reduzindo assim o tempo de contacto entre as mandíbulas e a solução contendo uma toxina. Juntos, estes resultados sugerem que o quinino é percebida pelas células receptoras gustativas nas peças bucais da abelha, como já anteriormente identificados no mel de abelha 9. A quinina é uma toxina para insetos que induz comportamento mal-estar, como no mel de abelha 10 e knockdown no mosquito da malária (Anopheles gambiae) 23. Este ensaio pode muito bem levar ao identification de alguns compostos de dissuasão e potencialmente tóxicos que são percebidos pelas células receptoras gustativas nas peças bucais nas abelhas. É crucial para o tubo microcapilar para ser preenchida com um volume suficiente de solução de ensaio para durar durante toda a fase de teste. Recomenda-se que, pelo menos, cerca de três quartos do tubo microcapilar (por exemplo, 70-80 ul) é preenchido. No entanto, deve ser tomado cuidado para não encher completamente o tubo microcapilar para reduzir o risco de derrames durante o processo de digitalização e prender o tubo microcapilar para o aparelho experimental. Cuidados também devem ser tomados ao apresentar a gota de sacarose 500 mM à abelha, de modo que o experimentador evita vazamento a gota dentro do tubo de exploração. O buraco 4 mm na ponta do tubo de retenção é grande o suficiente para um adulto trabalhador bumble abelha para estender naturalmente sua tromba na direção da solução de teste. No entanto, é possível quebumble abelhas pode saborear a solução com suas antenas antes de estender as suas trombas. Isso pode afetar a probabilidade de extensão probóscide como PER poderia ser atingida em abelhas, estimulando suas antenas com uma solução de açúcar 15. Na verdade, a antenas de Hymenoptera como a vespa parasita (Trissolcus brochymenae) 24 ou a abelha 13 estão equipados com sensilla gosto, o que lhes permite saborear açúcares e toxinas como o quinino. Consequentemente, contatos antenais iniciais com soluções contendo compostos altamente dissuasão, como o quinino também poderia reduzir a motivação de uma abelha para estender sua tromba e, portanto, afetar a taxa de sucesso experimental. Embora o contato antenal com a solução de teste não pode ser controlada, no presente estudo, não encontramos qualquer efeito significativo de contato antenal na extensão probóscide para a solução de teste. Neste ensaio, imediatamente a configuração do tubo microcapilar após a fase de pré-teste when antenas das abelhas bumble ainda estão dentro do tubo de retenção pode reduzir a oportunidade para as abelhas para saborear a solução de teste com suas antenas. A principal limitação deste ensaio surge quando acompanhando a retração tromba longe da solução de teste após o primeiro contato tromba usando o software de rastreamento de movimento de vídeo. O vídeo mostra apenas o movimento 2D dos probóscide, então a saída dada da medição da velocidade pode ser sob ou sobre estimado. No entanto, com algumas modificações, este aspecto do ensaio pode ser melhorada. Este ensaio pode ser usado para observar as respostas de alimentação natural para soluções contendo diferentes compostos, incluindo metabólitos secundários de plantas naturais que ocorrem. Observando as respostas de alimentação imediatos com este ensaio dá informações detalhadas sobre como as abelhas detectar estes compostos. Isto é vantajoso em relação existente &#39;go-no ir &quot;métodos como PER 18,19 </sup&gt; E mais ensaios de duas escolha 7 porque este método produz várias medidas de resposta comportamental, incluindo o consumo de alimentos durante um ataque de alimentação discreta. Medição de vários parâmetros simultaneamente permite uma melhor avaliação da palatabilidade de um composto. Por exemplo, em nosso ensaio, as abelhas evitar consumir água ou a solução de sacarose atado com quinino. Retracção da tromba poderia ser causada por uma alteração nas respostas das células receptoras açúcar 12,13. Nosso ensaio mostra que as abelhas retrair a tromba mais rápida depois de entrar em contato com a solução de sacarose mais quinino do que a água só; isso poderia sugerir que o quinino afeta um conjunto distinto de neurônios, além de inibir neurônios de detecção de açúcar 9,12,13,25. O nosso ensaio permite a análise do padrão temporal de respostas comportamentais durante a alimentação. Um protocolo semelhante onde o consumo de tempo e o número de acessos é medida tem aipronto foram implementadas para avaliar a resposta de alimentação de Drosophila aos açúcares nutritivos e não nutritivos 26. Prevemos que as abelhas irá apresentar uma resposta mais fiável para alimentar estimulantes no nosso ensaio do que em outros métodos, tais como por porque as abelhas são livres para se moverem no tubo de retenção 21. Esta técnica irá permitir uma análise exaustiva dos limiares de sabor para os nutrientes e toxinas para iluminar os mecanismos de alimentação em abelhas e potencialmente outras espécies de abelhas.

interações planta-polinizador são complexas. Polinizadores visitam flores para a obtenção de néctar e pólen como alimento; por sua vez, polinizadores facilitar a reprodução sexual em plantas. Enquanto esta relação é principalmente mutualista, o néctar floral e pólen, por vezes contêm toxinas ou outra planta compostos 1-5 o que pode prejudicar polinizadores. A lógica ecológica para a presença desses compostos no néctar e pólen não é claro em todas as configurações. Uma questão pendente neste campo é como polinizadores, como as abelhas podem detectar e evitar as flores com néctar contendo toxinas. As espécies de abelhas bumble, Bombus terrestris (Linnaeus, 1758), é um polinizador generalista que visita as flores de muitas espécies de plantas, incluindo os néctar produzir toxinas contendo 6. As abelhas foram mostrados para evitar soluções consumindo contendo altas concentrações de toxinas num ensaio de 24 h duas-7 escolha. este ensaiodo consumo de alimentos descrito por Tiedeken et al. 7 revelou que as abelhas podem detectar compostos amargos em soluções. No entanto, este ensaio foi incapaz de distinguir o gosto dos processos pós-ingestivo, tais como mal-estar que podem afetar o comportamento alimentar durante este intervalo de tempo 8-10. As abelhas possuem sensilla gustativa em suas antenas, peças bucais e tarsos para detectar compostos 11-13. O reflexo de extensão probóscide (PER) experimentos envolvem restringindo abelhas individuais em um chicote de fios e, em seguida, estimulando sensilas antenais da abelha para produzir a alimentação reflexo 14-17. As abelhas pode ser contido em arneses individuais e, em seguida, estimulada para produzir o reflexo de alimentação como um ensaio da sua capacidade de provar compostos 18,19. Outros têm modificada do ensaio PER para estudar a sensibilidade do aparelho bucal ou antenas de toxinas 9,20. No entanto, as abelhas são submetidos ao estresse durante aproveitamento. Isso pode afetar a forma comoeles respondem a compostos 21. Aqui, um novo ensaio é descrito para avaliar a resposta ao gosto comportamental de livremente mover as abelhas para sacarose e quinino, um alcalóide que foi previamente relatado para ser dissuasivo 9 e tóxica 10 para as abelhas (Apis mellifera) e abelhas (Bombus terrestris) 7, 22. Embora quinina não foi encontrado no néctar planta, este alcalóide é frequentemente utilizado como um estímulo aversivo em estudos comportamentais e fisiológicas em abelhas 7,9,12,13,22. O método envolve a gravação de peças bucais das abelhas bumble vídeo em ótima resolução durante o contato tromba inicial com as soluções de ensaio. Especificamente, a estrutura fina da resposta de alimentação é examinado por conseguir continuamente o comportamento ao longo de um intervalo de 2 min. O volume de solução consumida é medida durante o período de alimentação e assim a quantidade de comida ingerida pode ser correlacionada com a microestrutura deo comportamento de alimentação. Também a velocidade de retracção da tromba é medida, como um indicador de uma evitação activa, e, por conseguinte, a detecção pré-ingestivos.

<table><tbody><tr><td>Colônias de abelhas</td><td>Koppert Biological Systems</td><td></td><td>NATUPOL Beehive</td></tr><tr><td>Câmera microscópica digital&nbsp;</td><td>Dino-lite Europa</td><td>AM4815ZT</td><td>Dino-Lite Borda&nbsp;</td></tr><tr><td>100 &mu; l tubo microcapilar&nbsp;</td><td>Blaubrand IntraEND</td><td>709144</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centifuge de polipropileno de 15 ml&nbsp;</td><td>Seringa</td> descartável de plástico Luer Slip <td>Fisher Scientific 11849650</td><td></td></tr><tr><td>1 ml</td><td>BD</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Dell Latitude 3550 laptop</td><td>Dell</td><td></td><td>Verifique a compatibilidade com o software de vídeo&nbsp;</td></tr><tr><td>Canon CanoScan LiDE 120</td><td>Canon</td><td></td><td>Verifique a compatibilidade com o computador/laptop</td></tr><tr><td>Versão do software Observer 5.0.25</td> Versão do software <td>Noldus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kinovea 0.8.15</td><td>Kinovea&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de</td><td></td><td></td> silicone <td>6&nbsp; cm de comprimento, 1&nbsp; mm dentro &Oslash; & 6&nbsp; cm de comprimento, 4&nbsp; mm dentro &Oslash;</td></tr><tr><td>Adaptador de polipropileno barbed de mangueira padrão luer x1/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>TW-45518-22</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de polipropileno barbed de mangueira padrão luer x 1/16"</td><td>Cole-Palmer</td><td>TW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Malha de aço&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Tamanho da malha de 0,5 mm</td></tr><tr><td>Sacarose (grau II)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de quinina di-hidratado</td><td>Software Sigma-Aldrich</td><td>Q1125</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ versão 1.48</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a novel behavioral ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam bumble abelhas (<em&gt; terrestris do bombus</em&gt;)

A Novel Behavioral Assay to Investigate Gustatory Responses of Individual, Freely-moving Bumble Bees (Bombus terrestris)

Polinizadores generalistas como a abelha-atado lustre, Bombus terrestris, encontrar ambos os nutrientes e toxinas no néctar floral que coletamos de plantas com flores. Apenas alguns estudos têm descrito as respostas gustativos de abelhas em direção toxinas nos alimentos, e estes experimentos utilizaram principalmente a resposta de extensão probóscide em abelhas produtoras de mel contido. Aqui, um novo ensaio comportamental é apresentado para medir as respostas de alimentação de liberdade de movimento, cada trabalhador abelhas para nutrientes e toxinas. Este ensaio mede a quantidade de solução ingerida por cada abelha e identifica como saborizantes nos alimentos influenciar a microestrutura do comportamento alimentar. As soluções são apresentadas em um tubo microcapilar para as abelhas individuais que tenham sido previamente carente de 2-4 hr. O comportamento é capturado em vídeo digital. A estrutura fina do comportamento alimentar é analisado continuamente por atingir a posição do Proboscis (bucais) de gravações de vídeo usando o software de log de eventos. A posição da tromba é definido por três diferentes categorias comportamentais: (1) tromba é estendido e em contacto com a solução, (2) tromba é estendido, mas não em contacto com a solução e (3) tromba é guardado debaixo da cabeça. Além disso, a velocidade de retracção da tromba de distância a partir da solução também é estimado. No presente ensaio o volume da solução consumida, o número de ataques de alimentação, a duração dos episódios de alimentação e a velocidade de retracção da tromba após o primeiro contacto é utilizado para avaliar a actividade phagostimulatory ou o impedimento dos compostos testados. Este ensaio gosto nova permitirá que pesquisadores para medir como compostos encontrados no néctar influenciar o comportamento alimentar de abelhas e também será útil para os biólogos polinização, toxicologistas e neuroethologists estudando sistema gosto do bumble.

O ensaio de novo é usado para testar as respostas de alimentação a 1 M de sacarose, 1 M de solução de sacarose mais quinina 1 mM e água desionizada sozinho. As respostas de alimentação imediatos para cada tratamento são determinados pela quantificação da duração dos contactos tromba com a solução de ensaio, a frequência dos ataques de alimentação e a velocidade da tromba de retracção de distância a partir da solução de ensaio após o primeiro contacto, durante a fase de teste de 2 minutos. O volume de solução consumida é também medido depois da fase de teste. Neste estudo, nós escolhemos um intervalo critério de ataque de 5 segundos (Figura 1, consulte Arquivo Suplementar) com base em trabalhos anteriores por French et al. 25, que usou um limiar de 5 segundos para caracterizar o comportamento tromba retração de Drosophila em resposta a dissuasivo compostos 25. Assim, definimos um ataque de alimentação como um contato entre a tromba estendida e a solução nãot interrompido por uma ausência de contactos de 5 segundos ou mais. Em comparação com sacarose e água desionizada sozinha, a adição de solução de sacarose a quinina, evidentemente, impede a alimentação de abelhas como eles vão afastar rapidamente se detectar uma substância aversivo (Vídeo Figura 1). Nesta experiência, os tratamentos têm um efeito significativo sobre a duração total de contactos tromba durante a fase de teste (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,31 = 41, p &lt;0,001). O período de tempo de contacto com sacarose contendo quinina é significativamente reduzida em comparação com sacarose sozinha (p &lt;0,001), mas não à água desionizada sozinho (P = 0,219) (Figura 2). Da mesma forma, os tratamentos têm um efeito significativo sobre a duração total de surtos de alimentação (ANOVA nos dados transformados de log-F, <sUB&gt; 2,31 = 27,95, p &lt;0,001, Figura 3A). O período de alimentação ataques com sacarose contendo quinina é significativamente reduzida em comparação com sacarose sozinha (p &lt;0,001) mas não em relação à água desionizada sozinha (p = 0,41). Os tratamentos também têm um efeito significativo sobre a frequência de ataques de alimentação (Poisson GLM com uma função de ligação de registo, mudança de desvio em relação à distribuição c 2: p &lt;0,050), em que o número de ataques com sacarose contendo quinina é significativamente mais elevada em comparação com sacarose (p &lt;0,01), mas marginalmente significativamente diferente ao tratamento de água deionizada (p = 0,055, devido a um zangão exibindo sete lutas que alimentam na água, Figura 3B). Da mesma forma, a velocidade de retracção tromba difere significativamente entre os tratamentos (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,31 = 5,12, P &lt;0,050). bumble abelhas retrair o proboscis distância a partir da solução de teste significativamente mais rápida após o primeiro contacto com sacarose contendo quinina que com sacarose ou água desionizada sozinho (p &lt;0,050, Figura 3C). Estes resultados sugerem que o quinino desencadeia um comportamento de evitação ativa em abelhas. Os tratamentos também têm um efeito significativo sobre o volume total da solução consumida (ANOVA nos dados transformados em logaritmos, F 2,32 = 62,5, p &lt;0,001), pelo que o consumo de sacarose contendo quinina é reduzida em comparação com sacarose (p &lt;0,001), mas não a água desionizada (p = 0,457) (Figura 4B). O volume da solução evaporou-se a partir do capilar durante o período de teste é negligenciável. Em condições de laboratório (25 ± 2 ° C e 28 ± 2% de humidade relativa), a evaporação varia entre 0,033 a 0,883 l com uma média de 0,276 mL e 0,171 mL de água desionizada e 1 M de sacarose, respectivamente. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Neste contatos ensaio entre a antena e a solução de teste não pode ser evitada. No entanto, a percentagem de abelhas usando suas antenas para saborear a solução de alimentação durante a fase de teste (sacarose: 46,1%, sacarose mais quinino: 60,0% e água deionizada: 33,3%) não é significativamente diferente entre os tratamentos (binomial GLM, mudança em desvio em relação à distribuição c 2: p = 0,450). Nenhum efeito dos tratamentos é encontrada na latência entre os primeiros contatos antenais e da solução de teste e os primeiros contactos da tromba (mediana: 2,67 seg para a sacarose; 1,10 seg para sacarose mais quinino; 0,80 seg para água deionizada, ANOVA na dados log-transformados, F 2,13 = 0,620, p = 0,550). Além disso, a percentagem de abelhas que se estendem a tromba para saborear a solução de teste permanece constante entre os tratamentos (sacarose: 66,7%; sacarose mais quinino: 50,0%; água deionizada: 52,2%; binomial GLM, mudança de desvio em relação à distribuição c 2: p = 0,840). Em conjunto, estes resultados sugerem que as antenas desempenhar um papel menor na detecção das toxinas no ensaio. Uma experiência separada examina se é necessário testar abelhas por um período de tempo superior a 2 minutos. A quantidade de alimento consumida por abelhas é testada com a sacarose 1 M ou quinino 1 mM em soluções de 1 M de sacarose em duas condições: um período de teste de 2 minutos e um período de teste de 10 min. Para ambos os tratamentos, o consumo total de alimentos não difere para os períodos de ensaio e não há interacções significativas ocorrer entre o período de teste e o tratamento (n = 6 - 13, de ANOVA nos dados de log transformado; efeito dos tratamentos: F = 1,31 54,8, p &lt;0,001; efeito do período de ensaio: F 1,31 = 0, p = 0,979; efeito da interacção: F = 0,1, P = 0,457). Em resumo, uma2 min período de teste é suficiente para avaliar o efeito da solução sobre a quantidade total de alimentos consumidos por abelhas e os efeitos inibidores de substâncias tóxicas ou repelentes neste ensaio. Assim, através da medição do consumo de alimentos e ensaiar o comportamento alimentar, é possível correlacionar consumo total de alimentos para a estrutura fina da alimentação durante o ensaio. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig1.jpg" /> Figura 1: períodos de latência entre a tromba Contatos durante os primeiros 2 min do ensaio de alimentação parcelas densidade dos períodos de latência tempo que separa cada contato tromba com a solução de sacarose 1 M, a solução quinino 1 M de sacarose + 1 mM e água.. Os dados cumulativos de 13, 10 e 11 abelhas estão representados, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &lt;/ P&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig2.jpg" /> Figura 2: Tromba contato durações durante a Primeira 2 Min do ensaio de alimentação parcelas densidade das durações de contacto tromba de abelhas que se alimentam de 1 M de sacarose, 1 M de sacarose quinino mM + 1 ou água.. O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig3.jpg" /> Figura 3: Proboscis Atividade dos zangões de alimentação em 1 M de sacarose, 1 M de sacarose + Quinine 1 mM ou água (A) O período de crises de alimentação durante a fase de teste (B) a frequência de alimentação lutas e (C) a velocidade. da tromba retração após o primeiro contato. Lettering indica uma diferença significativa: tratamentos com letras diferentes indicam P &lt;0,05. Os diagramas de caixa representam a mediana (barras pretas), o menor eo maior número de pontos de dados ainda dentro 1.5 do intervalo interquartil (bigodes) e outliers (círculos). O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54233/54233fig4.jpg" /> Figura 4:. Suprime quinina alimentação por abelhas (A) imagens digitalizadas dos tubos microcapilares mostrando o nível de sacarose 1 M ou solução de quinino 1 M de sacarose, mais de 1 mm (indicado por uma linha preta) antes e depois da fase de teste respectivamente. (B) O consumo de 1 M de sacarose, 1 M de sacarose, mais quinina 1 mM ou água desionizada<html> sozinho por abelhas após a fase de teste. Lettering indica uma diferença significativa: tratamentos com letras diferentes indicam P &lt;0,001. Os diagramas de caixa representam a mediana (barras pretas), o menor eo maior número de pontos de dados ainda dentro 1.5 do intervalo interquartil (bigodes) e outliers (círculos). O tamanho da amostra como na Figura 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/54233fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo Figura 1: As gravações de vídeo a Actividade tromba direccionada no sentido (A) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1A_1M_Sucrose.m4v" target="_blank">1 M de sacarose</a> , (B) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54233/Video_figure_1B_Quinine.m4v" target="_blank">1 H sacarose mais quinina 1 mM</a> e (C)d / 54233 / Video_figure_1C_Water.m4v &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Água deionizada durante a fase de teste.

Um novo ensaio comportamental é descrito para investigar as respostas gustativas de curto prazo das peças bucais de abelhas que se movem livremente (Bombus terrestris) em relação a nutrientes e toxinas em solução.

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (<em&gt; Terrestris do Bombus</em&gt;)

Generalist pollinators like the buff-tailed bumble bee, Bombus terrestris, encounter both nutrients and toxins in the floral nectar they collect from ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a sensibilidade gustativa de abelhas operárias adultas de abelha-doméstica em relação a nutrientes e toxinas. Com este método, podemos medir com grande detalhe as respostas naturais de alimentação das abelhas. Isso nos permitirá identificar a capacidade das abelhas de detectar tanto nutrientes quanto toxinas em solução.A principal vantagem desta técnica é que ela fornece diversas medidas de resposta, como a quantidade de alimento consumida pelas abelhas em um curto período e a duração do episódio de alimentação. Isso apresenta várias vantagens em comparação com os métodos existentes de ir-não-ir, como um protocolo de reflexo de extensão do probóscide. Ensaios de comportamento fornecem informações valiosas sobre os mecanismos neuronais.Este ensaio fornecerá uma maneira controlada de estudar as respostas de abelhas em movimento livre a compostos tóxicos na alimentação. Uma demonstração visual deste método é realmente essencial, pois o preparo e a apresentação das soluções podem ser difíceis de aprender. Eles exigem uma entrega realmente precisa das soluções no momento correto.Nesta demonstração, utilizam-se Bombus terrestris audax de colônias criadas comercialmente. Duas horas antes do início do experimento, colete abelhas operárias individuais utilizando um frasco de plástico com uma rolha de plástico perfurada. Para começar, transfira os frascos contendo abelhas coletadas individualmente para um ambiente escuro e mantenha-as em jejum por duas a quatro horas.As abelhas são testadas em um tubo de contenção. O tubo de contenção é um tubo de centrífuga de 15 mililitros modificado, com um orifício de quatro milímetros perfurado na ponta e um pedaço de malha de aço fixado no interior. Em seguida, fixe dois pedaços de papelão nas laterais do suporte de tubo de contenção de poliestireno para proteger a abelha de estímulos visuais durante o experimento.Após o período de privação, transfira uma abelha do frasco para um tubo de contenção. Em seguida, fixe o tubo de contenção no suporte de poliestireno usando cera dental. Depois, posicione uma câmera microscópica digital.Conecte a câmera a uma configuração adequada de computador para gravação. Em seguida, posicione a câmera a cinco centímetros acima da ponta do tubo de retenção. Por fim, ajuste o tubo de retenção para que pelo menos 18 mililitros da ponta estejam dentro do quadro de vídeo.O teste é dividido em duas fases: o pré-teste, em que uma gota de sacarose é apresentada, e a fase de teste, em que a solução de interesse é apresentada. Antes do início do experimento, conecte um tubo de silicone de seis centímetros de comprimento com diâmetro interno de um milímetro, por meio de um adaptador macho, a outro trecho de tubo de silicone de seis centímetros de comprimento, mas com diâmetro interno de quatro milímetros. Isso funcionará como uma pipeta com bola.Agora, prepare as soluções de teste. Primeiro, prepare um tubo microcapilar de 100 microlitros com a solução de teste, em seguida, escaneie o tubo com um scanner de mesa em 600 dpi. Depois, conecte o tubo microcapilar ao tubo de silicone.Agora, insira a capilaridade em um suporte de micromanipulador, como uma seringa modificada de um mililitro. Em seguida, use o manipulador para posicionar a capilaridade em posição de prontidão. Inicie a gravação de vídeo após o período de habituação.Neste estudo, a atividade do probóscide é registrada a 26,7 quadros por segundo com ampliação de 25X. Em segundo lugar, prepare uma seringa com sacarose 500 milimolar dissolvida em água desionizada. Em seguida, acople a seringa a um adaptador fêmea.Agora, inicie o teste. Primeiro, apresente a seringa com uma gota de sacarose de aproximadamente 3,5 microlitros na extremidade do tubo de contenção para motivar a abelha a estender seu probóscide. Dê à abelha até cinco minutos para consumir a sacarose.Se a gota não for completamente consumida, remova a abelha do experimento. Assim que a abelha terminar a gota, remova imediatamente a seringa. Em seguida, posicione a microcapilar a cinco a dez milímetros da ponta do tubo de contenção e pressione suavemente a tubulação conforme necessário para manter a solução na ponta do tubo microcapilar.Realize o teste por dois minutos, iniciando no primeiro contato do probóscide com a solução. Após dois minutos, remova a micropipeta e escaneie-a novamente para medir o volume da solução-teste consumido pela abelha. Compararam-se as respostas alimentares à sacarose a um molar, sacarose a um molar com quinina a um milimolar e água desionizada pura.A atividade contínua do aparelho bucal foi pontuada durante os primeiros dois minutos dos testes. Um episódio de alimentação é definido como o contato entre o aparelho bucal estendido e a solução, sem interrupção do contato por intervalos de cinco segundos ou mais. A duração cumulativa dos episódios de alimentação com sacarose contendo quinina foi significativamente reduzida em comparação com a sacarose isolada, mas não em comparação com água desionizada isolada.Da mesma forma, os tratamentos têm um efeito significativo na frequência de episódios de alimentação durante a fase de teste. Da mesma forma, a velocidade de retração do probóscide diferiu significativamente entre os tratamentos. As abelhas operárias retraiam o probóscide da solução-teste significativamente mais rapidamente após o primeiro contato com sacarose contendo quinina do que com sacarose ou água desionizada isoladamente.O consumo total da solução-teste foi medido após a fase de teste. As abelhas consumiram significativamente menos da solução de sacarose contendo quinina do que da solução de sacarose pura. A resposta à quinina não diferiu significativamente da água desionizada.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas a três horas com aproximadamente oito abelhas, desde que seja executada corretamente e todas as abelhas respondam à solução de interesse. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão do valor deste método para fornecer dados sobre os tipos de substâncias que as abelhas conseguem detectar no alimento. Ao tentar aplicar este método, é muito importante não derramar nenhuma solução no tubo de contenção e não deixar vazar nenhuma parte da solução de interesse para fora do tubo microcapilar.Esperamos que esta técnica permita aos pesquisadores na área da gustação investigar mais a fundo como o sistema sensorial gustativo das abelhas obtém informações sobre nutrientes e toxinas.

a-novel-behavioral-assay-to-investigate-gustatory-responses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Neste protocolo, mostramos como condição aproveitado abelhas aos estímulos táteis e introduzir uma técnica de captura de movimento 2D para analisar a cinemática de multa escala padrão de amostragem antenal.

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

A vertical, olfatômetro labirinto em T é descrito para o ensaio da resposta comportamental de artrópodes. O olfactómetro permite que o experimentador para medir escolhas realizadas por indivíduos de teste quando submetidos a dois campos de odor potencial. Ambos atração e repulsão de odores pode ser medida com este dispositivo.

Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

O protocolo de condicionamento Proboscis Extension Response (PER), desenvolvido para a abelha melífera (Apis mellifera), fornece um meio ecologicamente relevante e facilmente quantificável para estudar vários mecanismos diferentes de aprendizagem em muitas espécies de insetos.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Apresenta-se um teste de escolha para revelar a influência de odorantes sobre o comportamento de Drosophila, utilizando um ensaio de Y-labirinto.

Prova<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfaction com um Ensaio Y-maze

Este vídeo descreve a identificação por radiofrequência (RFID) e os métodos de gravação de vídeo sensíveis ao movimento para monitorar o comportamento de escolha das abelhas.

Radio Frequency Identification and Video Motion-sensível eficiente Automatizar Gravação de unrewarded escolha Comportamento por Zangões

O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Este manuscrito descreve vários protocolos para a administração de agentes farmacológicos para as abelhas, incluindo métodos não invasivos simples para abelhas de vôo livre, bem como variantes mais invasivos que permitem que o tratamento localizado precisa de abelhas dispositivos de retenção.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; Apis mellifera</em

Apresentamos um mecanismo não letal e automatizado para coletar pólen de trabalhadores de abelhas bumble(Bombus)que retornam a uma colmeia. Instruções para produzir, preparar, instalar e usar os dispositivos estão incluídas. Ao usar objetos impressos em 3D, a modificação no design foi oportuna, eficiente e permitiu uma rápida reviravolta para testes.

Uma armadilha de pólen impresso em 3D para entradas de colmeias de abelhas bumble(Bombus)

Aprenda a avaliar a sensibilidade gustativa de abelhas Bombus terrestris em movimento livre. Este ensaio comportamental mede respostas alimentares detalhadas a nutrientes e toxinas, fornecendo dados sobre mecanismos neurais e detecção de substâncias.

A Novel Behavioral Ensaio investigar as gustativas de um indivíduo, livre-se deslocam Bumble abelhas (

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