Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas primárias de órgãos placentários e deciduais humanos para o estudo da infecção da interface materno-fetal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia placentária e doenças infecciosas, como onde os patógenos cruzam a interface materno-fetal durante a gravidez? As principais vantagens desta técnica simples e eficiente são que são utilizados espécimes humanos frescos e a estrutura do tecido tridimensional é mantida na cultura de órgãos.

Este método pode ser usado para estudar infecções na interface materno-fetal. Também pode ser aplicado a outras áreas de pesquisa, como o desenvolvimento placentário. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a seleção do tecido apropriado para cultura é difícil, sem conhecimento prévio da microanatomia e demonstrando este método será a Dra. Gabrielle Rizzuto.

Usando a técnica estéril em uma capa de cultura de tecidos, encha os frascos de matriz extracelular no gelo e, em seguida, dilua a matriz extracelular aquecida um a um com meio de coleta gelado. Misture a suspensão com pipetagem, tomando cuidado para não induzir bolhas. Em seguida, coloque inserções trans-well com poros de 0,4 mícron em poços individuais de uma placa de cultura de tecido de seis poços e cubra cada inserto com 100 microlitros da suspensão da matriz extracelular.

Coloque a placa no gelo e enxágue as amostras duas vezes em meio de coleta, transferindo o tecido para uma placa de Petri estéril sob um microscópio de dissecação após a segunda lavagem. Os espécimes contêm dois tipos distintos de tecidos deciduais, decídua parietalis e decídua capsular. Usando tesouras e pinças de dissecação springer estéreis, microdisseque a decídua parietalis em pedaços de 3 milímetros cúbicos, usando os forceptos para retirar qualquer sangue materno coagulado e use uma pinça para transferir três ou quatro pedaços de decídua para cada poço trans.

Identifique as vilosidades bem vascularizadas, com colunas de células trofoblásticas extra-vilosas proeminentes e use fórceps para transferir três ou quatro árvores vilosas para cada trans-poço. Ajuste os galhos para que as árvores fiquem posicionadas planas sobre a matriz extracelular e separe os galhos agrupados. Em seguida, adicione um mililitro de meio de coleta no fundo de cada poço e incube as culturas durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono.

12 a 16 horas depois, adicione um mililitro do meio de cultura apropriado ao topo de cada poço trans. Antes de iniciar a infecção, inocule uma única colônia de L. monocytogenes a partir de uma placa de ágar de infusão cérebro-coração listrada em três mililitros de caldo de infusão cérebro-coração. Incube a cultura durante a noite em uma posição inclinada a 30 graus Celsius para permitir que o crescimento bacteriano atinja uma fase estacionária.

Na manhã seguinte, use uma pinça estéril para remover quaisquer pedaços de cultura de órgãos flutuantes que não invadiram a matriz extracelular e aspire cuidadosamente o meio do fundo de cada poço trans. Em seguida, pipete suavemente um mililitro de PBS quente nos poços trans superior e inferior duas vezes, removendo cada lavagem com aspiração cuidadosa. Após a segunda lavagem, pipetar suavemente um mililitro do meio adequado para os poços trans superior e inferior, tendo o cuidado de não perturbar as culturas de órgãos e devolvê-las à incubadora durante uma hora.

No final da incubação, substitua o meio no topo dos poços trans por um mililitro de inóculo e coloque as placas de volta na incubadora de cultura de células para facilitar a invasão bacteriana, substituindo todo o meio em cada poço diariamente. Para culturas de órgãos vilosidades, é essencial dissecar apenas os ramos vilosos placentários que terminam em colunas trofoblásticas extra-vilosas bem vascularizadas, fofas ou difusas. Em contraste, árvores vilosas com vasculatura não prontamente visualizada e trofoblastos extra-vilosos são subótimas para cultura.

A análise de uma cultura de órgãos vilosos 72 horas após a infecção por Listeria monocytogenes demonstra uma carga bacteriana pesada nos trofoblastos extra-vilosos e uma relativa falta de bactérias na camada de sinciciotrofoblasto do revestimento das árvores. Para culturas de órgãos deciduais, é importante saber que os espécimes gestacionais iniciais consistem em grande parte de decídua capsular, facilmente distinguida por sua natureza fina e membranosa e decídua parietalis, que é aparada conforme demonstrado e usada para as culturas. A coloração H e E da cultura de órgãos deciduais embebidos em parafina revela glândulas revestidas epiteliais e vasculatura revestida endotelial posicionadas heterogeneamente dentro do compartimento de células estromais deciduais.

48 horas após a infecção, os macrófagos positivos para CD-14 localizam-se perto da vasculatura e se espalham por todo o estroma decidual, enquanto grandes agregados de listeria monocytogenes se agrupam predominantemente dentro do estroma. Uma vez dominadas, as culturas de órgãos podem ser estabelecidas em menos de 60 minutos por amostra, se preparadas adequadamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a esterilidade na capa de cultura de tecidos e ao trabalhar no microscópio de dissecação.

Após sua preparação, essas culturas de órgãos podem ser infectadas com os patógenos bacterianos, fúngicos ou virais relevantes de interesse, para responder a perguntas adicionais sobre quais tipos de células são mais vulneráveis à infecção. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os microbiologistas explorarem a patogênese das infecções placentárias com patógenos clinicamente relevantes, como a listeria monocytogenes. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer culturas de órgãos deciduais e vilosas em inserções trans-well de cultura de tecidos revestidas com matriz extracelular.