Name: A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprenda o método Circle-Seq para purificação e detecção de DNA circular extracromossômico em Saccharomyces cerevisiae. Esta técnica combina digestão por exonuclease, amplificação por rolamento e sequenciamento de nova geração.

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Obrigado a Kenn D. Møller e Claus Sternberg (DTU) pela assistência técnica e a Tue S. Jørgensen pela análise quantitativa de PCR.

NOTA: Uma visão geral da purificação DNA circular e método de sequenciação (Circle-Seq) é ilustrada na Figura 1. 1. A cultura, celular e de colheita de plasma de membrana Perturbação <ol><li> Inoculação das células de levedura (por exemplo Saccharomyces cerevisiae) a partir de uma cultura D / N em 50 ml de meio nutriente completa de dextrose peptona de levedura (YPD). Inocular a uma densidade celular inicial baixo de 1-3 x 10 5 células / ml ou uma densidade óptica de aproximadamente 0,01 OD 600. <ol><li> Incubar as células a 30 ° C com agitação a 150 voltas por minuto (rpm) até que as células atingir a densidade máxima de células de cerca de 1 x 10 10 células, aproximadamente após 24 a 48 horas ou uma densidade óptica a 600 OD&gt; 10.0. NOTA: O tempo de cultura não é crucial como concentrações mais baixas de células pode ser utilizado. </li></ol></li><li> Transferir a cultura superada para um tubo cónico de 50 ml, sedimentar as células por centrifugação a800 xg durante 3 minutos e descartar o sobrenadante. </li><li> Lavar o sedimento com 25 ml de solução tampão de Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, re-sedimentar as células por centrifugação a 800 xg durante 3 minutos e descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em 1,2 ml de tampão de ressuspensão fornecido a partir de um kit de plasmídeo coluna de purificação. </li><li> Etapa opcional: Adicionar plasmídeos altamente diluídas como controles para a purificação de elementos circulares de DNA, 20. NOTA: No conjunto de dados atual, uma mistura do plasmídeo 7.7 l foi aplicado para cada amostra contendo 10 a 10 células. A mistura da plasmídeo consistiu de três plasmídeos em diferentes concentrações; pBR322, a 38 ng / amostra, pUC19 a 0,5 ng / amostra, e pUG72 a 0,01 ng / amostra. </li><li> Transferir a suspensão celular em dois tubos de 2 ml de micro-centrífuga, cada um complementado com contas de vidro de 0,5 mm a uma razão de 1: 3 do volume total de suspensão. </li><li> Vortex cada tubo à velocidade máxima por 10 min para perturbar células plasmáticasmembranas. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 268 xg durante 30 seg e transferir os 1,2 ml de sobrenadante combinado a partir dos dois tubos de microcentrífuga para um novo tubo. NOTA: Alternativa para o passo 1,6-1,7, usar zimoliase para romper as células em solução tampão 0,6 ml de ressuspensão. Dez unidades de zimoliase pode perturbar 5 x 10 7 células dentro de 1,5 h a 35 ° C. </li></ol> 2. EccDNA Enriquecimento por cromatografia em coluna <ol><li> Seguir o protocolo de um kit de purificação de plasmídeos coluna. Em resumo, o tratamento de cada amostra com uma solução de 1,2 ml alcalina, misture delicadamente e incubar 3 min a RT. </li><li> Adicionar 1,2 ml de tampão de neutralização, misturar suavemente e centrifugar a 9650 xg durante 5 min. </li><li> Carregar a solução numa coluna equilibrada com solução 1 ml de equilíbrio e permitir que o líquido a fluir através da coluna por gravidade. </li><li> Lava-se a coluna com uma solução de lavagem de 4 ml. Quando a solução foi passada através da resina, adicionar cuidadosamente 0,3 ml de eluição assimlução para substituir a maior parte do volume de vazio de 0,35 ml de coluna. </li><li> Elui-se o ADN para um novo tubo de recolha com uma solução de 1 ml de eluição e precipitar o ADN pela adição de 0,8 ml de mistura de precipitação. Centrifuga-se a 9650 xg durante 10 min. </li><li> Lava-se a pelete de ADN com 0,5 ml de etanol a 70%, centrifugar a 9650 xg durante 5 min, de ar seco durante 5 a 15 minutos e dissolve-se o ADN purificado em 25 uL de água estéril. NOTA: Apenas armazenamento a curto prazo de DNA em água é recomendado. Preferencialmente, seguir diretamente para a etapa 3. </li></ol> 3. A digestão do ADN cromossómico restante linear <ol><li> Passo opcional: Para facilitar a digestão específica de ADN linear pela exonuclease, tratar o ADN purificado com uma endonuclease rara de corte, tais como Notl. Para 5 ug de ADN, usar uma unidade de Notl, 5 ul de tampão de digestão de 10x e água estéril para um volume total de 50 ul. Incubar a reacção a 37 ° C durante 16 h e inactivar pelo calor a endonuclease a 80 ° C durante 5 min. </li><li> Adicionar 20unidades de exonuclease (2 ul), 4 ul de ATP (25 mM), 34 ul de água estéril e 10 ul de 10x tampão de reacção directa com o ADN clivado-endonuclease de 50 ul para chegar a um volume de reacção de 1x de 100 ul, usando a exonuclease dependente de ATP kit. </li><li> Realizar hidrólise de ADN de cadeia simples e de cadeia dupla linear, a 37 ° C durante 5 dias ou mais. Adicionar um ATP adicional de 4 mL (25 mM), 0,6 ul de 10x tampão de reacção e 20 unidades de exonuclease cada 24 horas para prosseguir a digestão enzimática do ADN a um volume de reacção 1x. </li><li> Após a remoção do DNA linear, amostra de 2 ul da solução tratada com exonuclease para confirmar a eliminação do ADN cromossómico linear por reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), usando um marcador cromossómico, tais como o gene da actina ACT1 20. <ol><li> Cada 20 ul qPCR volume reaccional contém 2 mL de amostra tratados com exonuclease, a 150 nm, os iniciadores 5&#39;-ACT1 TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 &#39;e 5&#39;-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 &#39;, 2% (volume / volume) de dimetil sulfóxido, e fluorescente mistura principal 10 ul verde. </li><li> Utilizar a condição de reacção; 3 min a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 30 segundos a 60 ° C. NOTA: ACT1 é um marcador particularmente adequado para DNA linear desde variações no número de cópias deste gene são deletérios 21-23 tão eccDNA não deve levar ACT1. </li><li> Alternativas a análise da digestão de DNA por qPCR são PCR padrão (4.3) ou coloração com iodeto de propídio (4.4). <ol><li> Use 2 jil de amostra tratada com exonuclease como molde de PCR com os iniciadores 5&#39;-ACT1 TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 &#39;e 5&#39;-GAACGACGTGAGTAACACC-3&#39;. Como controlo positivo ACT1, usar 50-100 ng S. genómico ADN cerevisiae como molde. condições de reacção de PCR; 3 min a 95 ° C, seguido de 35 ciclos de 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 56 ° C e 1 min a 72 ° C. </li><li> Executar reacções de PCR por gel electrophoreSIS em 1% de agarose com 0,5 ug / ml de brometo de etídio. Olhe para uma banda ACT1 0,8 kb. </li></ol></li><li> A ausência ou a presença de DNA linear também pode ser examinado por coloração com iodeto de propidio antes e depois de amplificação de DNA. <ol><li> Misturar cada amostra de ADN numa mistura 1: 1 de volume com uma mistura 1: H 2 O 1,000 solução diluída de estoque 20 mM de iodeto de propídio. Deixar solução no escuro durante 10-20 min à temperatura ambiente e analisar a coloração de ADN por microscopia de fluorescência de uma ampliação de 100X, utilizando um filtro de excitação de fluorescência vermelha em 663-738 nm e um tempo de exposição de 5 a 30 seg. Como controlo ADN-coloração, uso O29-ADN genómico amplificado a partir de levedura e / ou plasmídeo amplificado-O29. </li></ol></li></ol></li><li> Inactivar pelo calor a solução da exonuclease a 70 ° C durante 30 min. </li></ol> 4. DNA Amplification <ol><li> Amplificar o purificado e enriquecido eccDNA a partir do passo 3.5) com DNA polimerase de O29 24-26 acordoção com o protocolo do fabricante polimerase. <ol><li> Em resumo, misture 5 ul enriquecidos eccDNA com tampão de desnaturação 5 mL. </li><li> Depois de 3 minutos à temperatura ambiente, adicionar 10 ul de tampão de neutralização. Misturar suavemente e adicionar 30 ul de mistura mestre contendo tampão de reacção de 29 ul e 1 ul de polimerase de ADN O29. Incubar a reacção a 30 ° C durante 16 horas ou mais (até 72 h). Calor inactivar a polimerase de ADN de O29 a 65 ° C durante 3 min. </li></ol></li></ol> 5. Seqüenciamento e Análise de Dados <ol><li> Tosquiarás o eccDNA amplificado com um ultrasonicator focada para um tamanho médio de pico alvo de 300 pb. Utilize as seguintes definições para uma amostra de DNA ul 130: poder 450W pico de intensidade, 60 seg tratamento, factor de utilização de 30%, a 200 ciclos por explosão, temperatura de 7 ° C. </li><li> Adicione etiquetas de índice de código de barras e adaptadores para o fragmentado lê para a síntese de bibliotecas para sequenciação, utilizando um método adequado para a preparação da biblioteca. </li><li>São profundas sequenciação, por exemplo, como 141-single nucleotide-fim lê numa plataforma de sequenciação de alto rendimento. </li><li> Mapa lê o genoma de referência de levedura sob investigação e permitir que lê para mapear para várias regiões. Por exemplo, usar um sistema de fluxo de trabalho disponíveis gratuitamente 27,28 e curto leitura software de mapeamento alinhador 29. </li><li> Identificar lê a partir de regiões de putativas eccDNAs contígua utilizando leituras, por exemplo, mais do que sete contígua lê (&gt; 1 kb), sem lacunas 20. NOTA: O software está disponível 27,28 para explorar mapeados lê em regiões genômicas de interesse. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método Circle-Seq permite a detecção escala genoma de eccDNA a partir de células de levedura com resolução de nível sequência. O método é uma purificação eccDNA leve que não requer vórtice intensiva ou pipetagem e usa a separação da coluna pela força da gravidade para limitar eccDNA ruptura que levaria a digestão de exonuclease no passo subsequente. Estas características do método pode ser crucial para a detecção de grandes eccDNAs que contêm sequências de genes. Circle-Seq detectado numerosas eccDNAs incluindo genes completos (Conjunto de Dados 1). Ele também detectou a 86 kb levedura DNA mitocondrial. Assim, esse protocolo facilita a purificação de grandes elementos circulares de DNA. Mantendo o número de passos de extracção de ADN para um mínimo reduz o risco de perda eccDNA e maximiza o rendimento. Com base nos resultados de controlo, cravado-em plasmídeos, Círculo-Seq é altamente sensível, a detecção de um único ADN circular de 2.500 células. Além disso, a remoção de plasmídeos endógenos abundantes tais como 2μ; plasmídeo ou ADN mitocondrial pode melhorar significativamente a sensibilidade. Cura de 2μ a partir de culturas de levedura foi descrito 30. Alternativamente, 2μ e remoção do DNA mitocondrial pode ser alcançada com uma endonuclease rara de corte, tais como SwaI. No entanto, o passo enzima de restrição poderia ter como alvo outras eccDNAs de interesse e limitar o rendimento total eccDNA. As etapas críticas para a detecção eccDNA foram remoção de ADN linear (passo 3) e sequenciação de DNA (passo 5) a uma profundidade adequada. Para gravar a maioria dos eccDNAs a partir de uma população de células, sequenciamento de profundidade pode ser necessária 20. sequenciamento-end emparelhado deve fornecer uma confiança ainda maior de detecção eccDNA, como se espera junções circulares de DNA para produzir emparelhado-end lê esse mapa discordantemente. Estas discrepâncias suporta a descoberta de estruturas de ADN circular e pode, potencialmente, ser utilizado como um filtro de detecção de eccDNA adicional. O Círculo-Semétodo q foi validado utilizando três S. independente populações cerevisiae CEN.PK. Sequências detectadas incluído anteriormente relatado eccDNAs, plasmídeos endógenos e cravado-in plasmídeos e centenas de eccDNAs putativos (Conjunto de Dados 1). Estes resultados suportam conjuntos de dados Círculo-Seq anteriores de S. cerevisiae S288c 20. A descoberta de vários eccDNAs comuns para as populações CEN.PK S288C e indica que estes loci têm uma propensão para existir como elementos circulares (Figura 4). Temos anteriormente demonstrado que o [círculo GAP1] é enriquecido em condições limitadas de nitrogênio no fundo CEN.PK 8, embora não tenha sido encontrada evidência de [círculo GAP1] em outra estirpe fundos. Encontrar de eccDNA do CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 e HXT6 HXT7 loci tanto S288c e CEN.PK sugere que uma predisposição para a circularização do DNA é conservido entre as estirpes de levedura. Ele continua a ser mostrado se [HXT6 / 7 círculo], [círculo ASP3-1], [círculo COS111] e [círculo CUP1-1 RSC30] conferem vantagens selectivas para células ou se a sua existência é meramente um efeito de altas taxas de circularização do ADN. Tomados em conjunto, os resultados indicam que o círculo-Seq é bem adequado para detectar eccDNAs quilobases de tamanho e tem vantagens para a identificação de genes completos com eccDNAs. Circle-Seq é um método altamente sensível que permite telas inteiras escala genoma de eccDNAs de levedura. O método Circle-Seq poderia abrir um novo campo de investigação destinada a elucidar o papel de eccDNA na geração de deleções de genes e amplificações. Dado que a arquitetura e estrutura do DNA são em grande parte conservada desde levedura eucariótica para eucariotas superiores, o método Circle-Seq deve, em princípio, ser applicablE para todas as células eucarióticas, com ligeiras modificações. Actualmente, o método não parece ter quaisquer limitações, embora a sua capacidade de purificar eccDNAs tamanho Megabase-se ainda a ser mostrado. Além disso, a utilização de O29 ADN-polimerase, que utiliza um método de amplificação de rolamento-círculo 31, cria uma tendência para as pequenas eccDNAs eccDNA tornando mais difícil a quantificação. Circle-Seq detecta eccDNAs grandes o suficiente para transportar genes completos, tornando-o adequado para estudos de DNA minutos circular dupla a partir de células somáticas humanas. Minutos duplas podem contribuir para o câncer quando proto-oncogenes são amplificados sobre esses elementos 32-37. Estudos de eccDNAs em células germinativas poderia ser usado para medir as taxas de mutação germinativa e avaliar a qualidade do esperma, por exemplo, na pecuária. Assim, Círculo-Seq tem o potencial para produzir insights sobre a taxa a que a variação genética surge sob a forma de variação do número de cópias, e levam a uma nova compreensão das doenças que envolvem contra cópia do genevariação do número 38-40.

Detecção de amplificação cromossómico cedo ou transiente é difícil porque requer a identificação de alterações nas moléculas de ADN em grandes populações de células. Cromossómicas variações no número de cópias (CNVs) são geralmente bem detectado após o seu estabelecimento, deixando apenas a estrutura final CNV como prova de que o mecanismo de variação gerado a 1,2. Detecção e recuperação DNA extrachromosomal circular (eccDNA) nos estágios iniciais de formação de CNV poderia elucidar os processos em curso no rearranjos genômicos. Anteriormente, de novo descoberta de eccDNA foi de micrografias eletrônicas 3, Giemsa de cromossomos em metáfase 4 ou eletroforese bidimensional 5. Estes métodos oferecem pouca ou nenhuma informação sobre a sequência do DNA circular. Técnicas visados ​​como o Southern blotting 6,7, inverse PCR 8, ou de fluorescência em hybridizatio situn 9 fornecer provas apenas cerca elementos eccDNA específicos. Nenhum destes métodos proporcionam a sequência de todos os tipos eccDNA existentes numa população de células. Divergência genómico em uma associação de células pode ser caracterizado por sequenciação do genoma e / ou matrizes ladrilhos 10,11. Detecção de uma deleção ou amplificação por métodos de purificação de ADN convencionais geralmente requer que um alelo mutado representam, pelo menos, 0,1-1% da população de células 12,13. Acentric eccDNAs se espera que sejam ainda mais transiente em uma cultura de células, devido à sua falta de centrómeros e potencial ausência da síntese de ADN em replicação. Assim, desde que a maioria eccDNAs presumivelmente estão em quantidades baixas e as suas sequências de se parecer com o genoma, métodos de extracção de ADN alternativos são necessários para detectar eccDNAs. Várias técnicas de purificação de ADN circular explorar as diferenças estruturais entre os cromossomas e ADN circular. Por exemplo, ultracentrifug de alta velocidadeção em gradientes de césio-cloreto é usado para isolar 350-3000 pares de bases (pb) a partir de grandes eccDNAs a linha celular de cancro humano HeLa 14. No entanto, a alta velocidade pode quebrar ou entalhe da espinha dorsal das estruturas circulares de DNA super-enrolados, alterando a velocidade de sedimentação 15 e no rendimento eccDNA. Dutta e colaboradores desenvolveram um método para de novo, a identificação escala genoma de ADN circular a partir de tecidos de ratinho, bem como a partir de culturas de células humanas e de galinha 16,17. Seu método é a extração de núcleos de tecido homogeneizado por ultracentrifugação sacarose seguida de purificação de plasmídeos e várias rodadas de reações enzimáticas e extrações de DNA. Seu protocolo identifica principalmente 200-400 eccDNAs pb, chamados microDNAs. Dutta e colegas de trabalho também tentou a purificação de microDNAs de Saccharomyces cerevisiae, mas não foram capazes de gravar microDNA desta espécie de levedura 16. Desenvolvemos um novo método para adetecção de novo de eccDNA de fungo chamado Círculo-Seq. Este método permite pesquisas escala genoma para moléculas circulares de DNA, grandes o suficiente para transportar genes inteiros e tão grande como o DNA 86 quilobases (kb) mitocondrial (mtDNA). O método de círculo-Seq foi desenvolvido a partir de um método de purificação de plasmídeo procarióticos bem estabelecida 18,19, optimizado para as células de levedura e eucariotas combinado com sequenciação profunda. Utilizando a abordagem Círculo-Seq, 1756 eccDNAs diferentes, todo maior do que 1 kb, foram detectados a partir de dez S. cerevisiae S288c populações 20. Um tamanho de corte foi escolhido para se concentrar em eccDNA que eram grandes o suficiente para transportar genes inteiros. Circle-Seq foi altamente sensível; ele detectou um único eccDNA dentro de milhares de células 20. No estudo atual, Circle-Seq foi usado para isolar e identificar 294 eccDNAs de três repetições biológicas de outro S. cerevisiae cepa de levedura, CEN.PK. Os dados revelam que eccDNA é um eleme genética comumnt em S. cerevisiae.

<table><tbody><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD Difco</td><td>211677</td><td>produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>600882</td><td>Para análise de qPCR. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Dextrose (D-glicose)</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.4</td><td>Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Grânulos Disruptores, 0,5 mm</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-BG05</td><td>Grânulos de vidro para romper as membranas das células plasmáticas. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Carl Roth</td><td>2218.2</td><td>Coloração em gel de agarose para detecção de DNA/RNA.</td></tr><tr><td>Kit de minipreparação de plasmídeo GeneJet</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0502</td><td>Purificação de plasmídeo de bactérias. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>NotI, FastDigest</td><td>Life Technologies -&nbsp; Thermo Fisher Scientific, EUA</td><td>FD0594</td><td>Endonuclease. Produto alternativo pode ser usado.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit Plasmid Mini AX&nbsp;</td><td>A & Um</td> kit de purificação de plasmídeos <td>010-50</td> da Biotechnology, Poland <td>usado para purificar eccDNA.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kit DNase dependente de ATP seguro para plasmídeo</td><td>Epicentro, EUA</td> Kit de exonuclease dependente de ATP <td>E3105K</td><td>. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich, EUA</td><td>81845</td><td>Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>plasmídeo pUG6</td><td>EUROSCARF, Alemanha</td><td>P30114</td><td>Gene marcador: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP.</td></tr><tr><td>QIAGEN genômica-ponta 100/G&nbsp;</td><td>Qiagen, EUA</td><td>13343</td><td>Purificação de DNA genômico de levedura. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Protocolo REPLI-g Mini Kit&nbsp;</td><td>Qiagen, EUA</td><td>150023</td><td>Amplificação do eccDNA pela polimerase phi29.</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>BD Difco</td><td>210929</td><td>produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T (Lyticase, Enzima Lítica de Levedura)</td><td>Nordic BioSite, Suécia</td><td>Z1004-3</td><td>Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Acesso a dados a arquivos de sequência</td><td>European Nucleotide Archive&nbsp;</td><td></td><td>Conjunto de dados EccDNA de Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7D. Número de acesso do estudo PRJEB9684. O 2º número de acesso é ERP010820. O prefixo da tag locus é BN2032.&nbsp;</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7D</td><td></td><td></td><td>Genótipo MATa MAL2-8c SUC2</td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae pool de biblioteca de deleção de levedura</td><td>EUROSCARF, Alemanha</td><td></td><td>S288c BY4741 pool de 4400 mutantes viáveis de deleção de um único gene eliminados pelo módulo KanMX. Genótipos MATa his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 met15&Delta; 0 ura3&Delta; 0 genexxx::KanMX.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA Spectrophotometer&nbsp;</td><td>Espectrofotômetro NanoDrop 1000, Thermo Fisher</td><td></td><td>Medindo a concentração de DNA. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência</td><td>Nikon Optronics Magnafire. Filtro de fluorescência de excitação vermelho, 663-738 nm.</td><td></td><td>Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Sistema robótico de construção de biblioteca</td><td>Apollo 324, IntegenX Inc.</td><td></td><td>Preparação da biblioteca de DNA. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Plataforma de sequenciamento</td><td>Plataforma Illumina HiSeq 2000, Illumina Inc.</td><td></td><td>Sequenciamento de DNA. Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes</td><td></td><td>Produto alternativo pode ser usado.</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Métodos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% YPD media&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Misture 10 g de Dextrose, 10 g de extrato de levedura, 20 g de Bacto peptona e adicione H2O a um volume total de 1000 ml e autoclave.</td></tr><tr><td>Teste Circle-Seq em DNA</td><td></td><td></td> genômico <td>O DNA genômico foi purificado (Qiagen) de um pool da biblioteca de deleção de leveduras (Euroscarf). A concentração de DNA foi medida por nanodrop e 30 &micro; g DNA genômico foi pipetado em dois tubos de microcentrífuga. Um tubo de microcentrífuga foi suplementado com plasmídeo de 100 nanogramas (pUG6). As amostras de DNA foram purificadas por Circle-Seq, omitindo as etapas do protocolo 1.1-1.3 e 1.5-1.7. As concentrações de DNA eluído foram medidas por nanogota e todo o rendimento de DNA das amostras GD e GD+P foi tratado com exonuclease por um período de 29 horas. Uma fração de 10% foi coletada para amplificação de phi29 e análise de PCR, enquanto o DNA restante foi submetido a tratamento com exonuclease de 72 horas. As amostras foram analisadas quanto ao conteúdo de DNA linear por PCR, utilizando o gene ACT1 como marcador cromossômico. Uma fração de 5% de cada uma das amostras tratadas com exonuclease foi amplificada pela DNA polimerase phi29 por 16 horas (Qiagen). A presença de DNA em cada amostra foi examinada carregando uma quantidade igual (7 &micro; l) em poços em 0,5 &micro; g/ml de gel de agarose de brometo de etídio a 0,9% após a execução de eletroforese em gel.&nbsp;</td></tr><tr><td>Software de mapeamento</td><td>Bowtie2 alinhador, John Hopkins University</td><td></td><td>Alinhamento de leitura curta ultrarrápido. Referência: 29.</td></tr><tr><td>Imagens</td><td></td><td></td><td>de DNA corado com iodo de propídio foram capturadas por microscopia de fluorescência com ampliação de 100x (óleo 100x/1,30, Nikon) no canal RFP (filtro de fluorescência de excitação vermelho, 663-738 nm) usando tempo de exposição idêntico (5 segundos).&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de bioinformática de fluxo de trabalho</td><td>Galaxy, Open source.</td><td></td><td>Uma plataforma gratuita baseada na web para pesquisa biomédica intensiva em dados. Referências: 27-28.</td></tr></tbody></table>

a purificação de todo o genoma de dna circular extracromossômica de células eucarióticas

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

<html> DNAs circulares extracromossômicos (eccDNAs) são elementos genéticos comuns em Saccharomyces cerevisiae e são relatados em outros eucariotas também. EccDNAs contribuir para a variação genética entre células somáticas em organismos multicelulares e evolução das eucariotas unicelulares. métodos sensíveis para detectar eccDNA são necessários para esclarecer como esses elementos afetam a estabilidade do genoma e como fatores ambientais e biológicos induzir a sua formação em células eucarióticas. Este vídeo apresenta um método eccDNA-purificação sensível, chamado Circle-Seq. O método envolve a purificação de DNA circular, a remoção do restante DNA linear cromossômica, amplificação rolling-círculo de eccDNA, sequenciamento de profundidade, e mapeamento de coluna. tratamento exonuclease extensa foi necessária para a degradação do DNA cromossômico linear suficiente. O passo de amplificação rolling-círculoine-height:. normal; &quot;&gt; φ 29 polimerase enriquecido para DNA circular sobre o DNA linear de validação do método Circle-Seq em três populações de S. cerevisiae CEN.PK de 10 a 10 células detectadas centenas de perfis eccDNA em tamanhos maiores do que 1 quilobases . resultados repetidos de ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 genes no DNA circular em ambos S288c e CEN.PK sugere que circularização DNA é conservado entre as estirpes nestes loci. em suma, o método Circle-Seq tem ampla aplicabilidade para rastreio de escala genoma para eccDNA em eucariotas, bem como para a detecção de tipos específicos eccDNA.

Para validar o método Circle-Seq, três S. populações cerevisiae CEN.PK de 1 x 10 10 células foram testadas depois as células foram cultivadas separadamente em meio YPD durante dez gerações. Eliminação cromossómica de ADN linear foi confirmada pela ausência de um sinal de qPCR ACT1 como descrito anteriormente 20 (dados não mostrados). eccDNA purificado e enriquecido foi sequenciado até 68 milhões lê (141 single-nucleotide-end lê) e mapeado para o genoma de referência CEN.PK113-7D (versão 19 de junho de 2012). As gravações de eccDNAs putativos das três amostras chamados C1, C2 e C4 foram atribuídos a regiões genómicas mapeados por contígua lê mais do que 1 kb. Com base em 10.000 simulações de Monte Carlo, o significado de cada região contígua lê mapeado por mais do que uma kb foi estimada. A partir deste regiões 79, 159 e 56 foram anotados como sequências eccDNA prováveis ​​(p &lt;0,1, Dataset 1). O número de contiguo gravadanos lê&gt; 1 kb aumentou em função da profundidade de sequência, sugerindo que, mesmo mais elementos eccDNA teria sido registada se as amostras tinham sido sequenciados mais (Figura 2). Como esperado, o método de círculo-Seq extraída numerosos lê a partir de um número de elementos conhecidos circulares de DNA incluindo o plasmídeo 2μ, DNA mitocondrial, genes de ARN ribossomal no cromossoma XII, e os três plasmídeos de controlo interno pBR322, pUC19 e pUG72 que foram misturados em amostras apenas antes da purificação em coluna (Figura 3). O vídeo mostra um exemplo de contígua lê que mapeada para o locus de HXT7 _ARS432_ HXT6 no cromossoma IV. Anteriormente, o [HXT6 / 7 círculo] foi detectada por Círculo-Seq em dez populações S288C (cada um com 1 x 10 10 células) e a estrutura de ADN circular foi confirmada por análise de PCR inverso 20. A ci [HXT6 / 7rcle] também foi registada em cada uma das três populações CEN.PK (Figura 4A). Além disso, a maioria dos genes comuns eccDNA entre as amostras replicadas de CEN.PK sobreposto eccDNA genes a partir de conjuntos de dados S288C (Figura 4B). Para testar a especificidade do protocolo Círculo-Seq para a purificação de ADN circular, de duas amostras, cada uma com o ADN genómico de 30 ug, foram testados. Uma amostra foi suplementado com 100 ng de DNA plasmídeo e eccDNA de ambas as amostras foram purificadas pelo protocolo Círculo-Seq. Após separação em coluna, o rendimento de ADN foi de 1,27% (380 ng) para a amostra sem plasmídeo (GD) e 1,60% (480 ng) para a amostra com o plasmídeo (GD + P). A eficiência do tratamento de exonuclease foi testado para o teor de ADN linear após 29 h e 72 h utilizando PCR contra ACT1. Sem amostras continham amplificado ACT1 (dados não mostrados). Uma fracção de cada amostra tratada com exonuclease foi ainda umamplified pelo O29 polimerase e os produtos de reacções enzimáticas foram analisadas por coloração com iodeto de propídio (Figura 5A-F) e electroforese em gel de agarose (Figura 5G). As amostras após o tratamento de exonuclease mostrou mínima de propídio iodo-mancha (Figura 5A-B). O O29 - amostra amplificada com apenas ADN genómico revelou estruturas fio (Figura 5C) semelhantes à amostra controle (Figura 5E). O O29 - amostra amplificada que tinha plasmídeo acrescentou revelou focos (Figura 5D) assemelham-se o controle de plasmídeo (Figura 5F). As imagens indicou que O29 polimerase de ADN enriquecido para circular sobre o ADN linear. A maioria do ADN cromossómico linear foi removido a partir de amostras após o tratamento 29 horas exonuclease (Figura 5A-B, G). No entanto, a extensa tratamento exonuclease por mais de 100 horas e usando mais de 100 unidades foi<html> necessária para remover todo o ADN cromossómico linear, como O29 - amostras amplificadas ainda mostrou um fundo de estruturas em forma de fio após 72 horas de tratamento com exonuclease (Figura 5C-D). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig1.jpg" /> . Figura 1. Esquema do método de círculo-Seq O protocolo possui 5 etapas: 1) cultura das células, 2) purificação e do enriquecimento de eccDNA por cromatografia em coluna, 3) digestão de ADN cromossómico restante linear da fracção de eluato, 4) de amplificação ADN por O29 a polimerase de ADN, e 5) a sequenciação de eccDNA altamente enriquecido e mapeamento das leituras para a S. genoma de referência cerevisiae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Adjacente lê&gt; 1 kb como função da profundidade sequência. EccDNA a partir de 1 x 10 10 células aumentam em função da profundidade de sequência (em milhões de mapeado lê). Mostrado: triplicados biológicos de haplóides CEN.PK S. cerevisiae populações (C1, C2, C4) separados por 10 a 10 divisões celulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig3.jpg" /> Figura 3. Detecção de elementos de DNA circular conhecidos. (AB) Espalhe parcelas de cobertura de leitura (ler densidade) em por cento para plasmídeos em CEN.PK biológica replica C1, C2 e C4. (A) lê mapeada para os plasmídeos de levedura endógenos foram: 2μ; [Círculo rDNA] (genes de ARN ribossómico de cromossoma XII); e mtDNA (o ADN mitocondrial). (B) original lê mapeado para controlar plasmídeos. plasmídeos de controlo foram doseadas em amostras antes da purificação em coluna. rácios de plasmídeo por célula foram: pBR322 (mais sinais) 1: 1, pUC19 (círculos) 1:50, e pUG72 (triângulos) 1: 2500. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig4.jpg" /> Figura 4. Elementos eccDNA comum em CEN.PK e S288c. (A) diagrama de Venn exibindo sobreposição entre os 476 genes em 294 eccDNA elementos nas três amostras CEN.PK (C1, C2, C4). Os 16 sobrepostas genes eccDNA / plasmídeos comuns são anotados (todos os nomes de genes estão em Dataset 1). (B) diagrama de Venn de todos os genes registados em eccDNAs putativos das três amostras CEN.PK (C1, C2, C4), em comparação com todos os genes registados em eccDNAs putativas a partir de 10 amostras de S288C: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (ver referência 20). São mostrados 13 repetições biológicas (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) com genes / plasmídeos e regiões eccDNA putativos que se sobrepunham um mínimo de 2 estirpe origens e 3 ou mais experimentais configurações. As amostras C, CEN.PK; amostras R e Z, S288c BY4741; Amostras S, S288c M3750. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54239/54239fig5.jpg" /> Figura 5. A visualização das amostras de ADN depois de exonuclease e O 2 9 de tratamento. (AF) de iodeto de propídio a coloração do ADN. Barra de escala, 10 | im. (A, C e E) com amostras de ADN genómico (GD); (B e D) GD amostras com mais de plasmídeo (GD + P). ( <str<html> ong&gt; AB) Após o tratamento exonuclease 29 hr (EXO 29 h); (CD) após o tratamento com exonuclease 72 h seguido por O29 a amplificação com polimerase (exo 72 H +) O29. (E) o controle DNA genômico depois e: a amplificação da polimerase O29; (F) Controlo de plasmídeo (5,5 kb) depois amplificação 29 polimerase; (Ø G) agarose gel-eletroforese. A partir da esquerda: L, 1 marcadores kb; P, o controlo de plasmídeo (5,5 kb) depois EXO 29 h; GD, após EXO 29 h (amostra, tal como em A); GD + P, depois de EXO 29 hr (amostra como B); GD e GD + P, depois de EXO 29 hr + O29; GD e GD + P, depois de EXO 72 hr + O29 (amostra como no CD). Veja a Tabela S1 para fornecer mais detalhes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/54239fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Aset 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg &quot;/&gt; Conjunto de Dados 1. regiões DNA circularização potenciais em CEN.PK. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54239/DATASET1-CENPK.xlsx">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> São mostrados os dados de sequências e análises para 348 regiões. As colunas são AD, mapeamento eccDNA. A (primeira coluna a partir da esquerda), a amostra a partir do qual foi identificado eccDNA putativo; B, cromossoma; CD, início e fim coordenadas eccDNAs putativos. EH, o conteúdo eccDNA. E, sequência de replicação autónoma (ARS) na região; F, gene completo da região; L, parte do gene incluído na região; H, BLASTN do gene identificado. IO, a cobertura EccDNA e valores de p. I, região mais longo com uma sequência anotada exclusivamente no pb; J, número de todos mapeados lê; K, a cobertura de todos mapeados lê por fragmentos por kb a partir de um milhão mapeado lê (FPKM); L, p-valor para o putativo eccDNA comparado a ocorrência por acaso a partir de simulações de Monte Carlo; M, número de uniquely mapeados lê; NÃO; como K e L utilizando apenas mapeados exclusivamente lê (UFPKM). Parâmetros para mapeamento de leituras e simulações de Monte Carlo foram descrito 20.

Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

Purificação em todo o genoma de DNA circular extracromossômico de células eucarióticas. Olá, sou Rasmus. Aqui apresentarei toda a descrição do método para a purificação de DNA circular.No primeiro passo, as células de levedura são cultivadas e colhidas. Em seguida, o DNA circular é purificado e amplificado em três etapas. Primeiro, por separação em coluna, na qual os círculos de DNA são purificados e enriquecidos.Em seguida, pelo tratamento do DNA com exonuclease para digerir todo o DNA linear remanescente e, finalmente, pela amplificação dos círculos de DNA utilizando a polimerase phi-29. Na quinta parte deste protocolo, os círculos de DNA são sequenciados e as leituras são mapeadas no genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae. Ao final deste vídeo, mostraremos alguns resultados representativos.Discutiremos as perspectivas para estudos futuros e as vantagens do uso deste método. Parte um, colheita de células. O cultivo inicial é crescido a 30 graus sob agitação até a densidade máxima, que é aproximadamente 200 milhões de células por mililitro e é alcançada após 24 a 48 horas.O cultivo crescido é transferido para um tubo Falcon e centrifugado por três minutos para formar um pellet. O sobrenadante é removido. O pellet grande é vortexado em tampão TE e centrifugado novamente para reprecipitação.Parte dois, purificação em coluna. Nesta etapa, utilizamos um kit comercialmente disponível de purificação em coluna que fornece plasmídeos altamente purificados a partir de DNA bacteriano genômico. Antes de usar este kit com levedura, a parede celular precisa ser rompida.Isso é feito ressuspendendo o pellet celular lavado no tampão L-1 do kit. A suspensão celular é transferida para um tubo de microcentrífuga e as esferas de vidro são adicionadas até um terço do volume total. A amostra é vortexada em velocidade máxima por 10 minutos e as esferas são removidas por centrifugação a 2.000 rotações por minuto durante 30 segundos.O sobrenatante é transferido para um novo tubo. Neste método, adicionamos plasmídeos altamente diluídos ao sobrenatante em três proporções diferentes. Propomos incluir plasmídeo altamente diluído no ciclo.Isso pode servir como guias de referência interna. Você pode utilizá-los para verificar a qualidade da purificação e amplificação do seu DNA e, além disso, fazer uma estimativa semi-quantitativa do número de DNAs não circulares por célula utilizando esses plasmídeos de controle. Apenas plasmídeos altamente diluídos devem ser adicionados, pois eles afetarão a resolução da sequência de outros DNAs circulares.A suspensão celular contendo plasmídeos adicionados é tratada com a solução L-2 do kit, seguindo o protocolo do kit. Após a aplicação na coluna, proteínas, lipídios e DNA cromossômico são removidos por meio de duas lavagens da coluna. O DNA circular extracromossômico é altamente enriquecido na fração eluída.Parte três, digestão de DNA linear. Nesta etapa, utilizamos uma exonuclease para digerir o DNA linear remanescente. Uma exonuclease dependente de ATP direciona especificamente o DNA linear de dupla e de fita simples, sem digerir o DNA circular.A especificidade da exonuclease para DNA linear foi confirmada por eletroforese em gel após 29 horas de tratamento com DNase. Os resultados mostram que o DNA genômico é digerido, enquanto o DNA plasmidial permanece, conforme indicado pela seta vermelha. O levedo contém 16 cromossomos, com até 1.500 quilobases de comprimento.Para facilitar a digestão por exonuclease, utiliza-se uma endonuclease de corte raro para obter um número aumentado de extremidades de DNA acessíveis. Se for usada a enzima de restrição baseada em ate, NotI, cada cromossomo é clivado até sete vezes, conforme indicado. O DNA purificado em coluna é tratado com NotI a 37 graus em um bloco de aquecimento durante a noite.Após a inativação térmica da NotI, o DNA clivado é tratado com exonucleases a 37 graus de acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento com exonuclease, as enzimas são inativadas termicamente a 70 graus por 30 minutos. Pode levar vários dias para digerir todo o DNA cromossômico linear com adição adicional de ATP e exonuclease. Para garantir que todo o DNA linear seja completamente digerido, as amostras são analisadas por métodos de PCR ou qPCR utilizando um gene de referência interno, como ACTI.Parte quatro, amplificação de DNA. Nesta etapa, enriquecemos e amplificamos o DNA circular utilizando a polimerase phi-29. A reação ocorre a 30 graus usando oligonucleotídeos hexaméricos aleatórios e phi-29.A polimerase possui alta fidelidade e atividade de correção de leitura, garantindo amplificação de DNA não tendenciosa. Cada polimerase pode, por meio da replicação em círculo rolante, sintetizar até 100 quilobases de DNA. A polimerase também é altamente processiva, amplificando o DNA até 10 elevado à nona potência vezes.Parte cinco, sequenciamento. Seguindo o protocolo para uma plataforma de sequenciamento de nova geração de alto rendimento, o DNA é sonicado até um tamanho médio de 300 pares de bases e sequenciado como leituras simples de 141 nucleotídeos. As leituras de sequência são mapeadas para o genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae, utilizando o banco de dados gratuito Galaxy.Os dados sequenciados são enviados para o Galaxy e as leituras são mapeadas utilizando o alinhador de leituras curtas Bowtie2, que permite o mapeamento de leituras parciais. Parte seis, resultados representativos. Após o sequenciamento e o mapeamento no genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae, as leituras podem ser visualizadas no navegador genômico dentro do software Galaxy.O DNA de origem circular pode, por exemplo, ser contado como regiões que contêm leituras coerentes maiores que um quilobase, conforme indicado na tela. Um exemplo de uma região no cromossomo quatro que contém leituras coerentes abrangendo mais de um quilobase é a região com os genes do transportador de hexose seis e sete. Ao utilizar este método em uma população de células de levedura, leituras mapeadas são frequentemente encontradas nesse locus e a cobertura de leitura sugere claramente que um círculo de DNA se formou entre os genes parálogos do transportador de hexose.Devido à alta homologia de sequência entre os genes transportadores de hexose, propomos que a recombinação homóloga ilegítima leve à circularização desse DNA. No modelo de mutação por DNA circular, o processo de reparo de DNA ocorre de forma imperfeita. Por exemplo, se uma quebra de dupla fita ocorrer em um elemento repetitivo, a sequência homóloga no mesmo cromatídeo pode ser usada como molde para o reparo do DNA por recombinação homóloga.Após a excisão, invasão da fita, síntese de DNA e resolução de todas as junções, um círculo de DNA pode se formar a partir do genoma, causando uma deleção de DNA no cromossomo. Os efeitos do tratamento do DNA com exonucleases e polimerase phi-29 podem ser visualizados usando coloração com iodeto de propídio. Os controles de coloração de DNA genômico aparecem conforme a imagem à esquerda, enquanto o DNA plasmidial aparece conforme a imagem à direita.Após 29 horas de tratamento com exonuclease em 400 nanogramas de DNA genômico, a maioria do DNA é digerida, conforme indicado na imagem à esquerda. Esse resultado é confirmado por eletroforese em gel, conforme mostrado na imagem do gel à direita. Após 72 horas de tratamento com exonuclease seguido da síntese de DA pela polimerase phi-29, ainda é possível identificar milhões de cópias de DNA.Da mesma forma, após 29 horas de tratamento com exonuclease de 400 nanogramas de DNA genômico, mais 100 nanogramas adicionais de DNA plasmidial, a maioria do DNA genômico é digerida. No entanto, o DNA plasmidial não é digerido, conforme indicado pela imagem do gel. Após o tratamento com a polimerase phi-29 da amostra tratada com exonuclease por 72 horas, a maior parte do DNA amplificado aparece como plasmídeos corados.Então, inicialmente realizamos a triagem de genes para DNA circular e ficamos realmente surpresos ao encontrar várias centenas de tipos diferentes de amostras de DNA. Sim, foi realmente surpreendente descobrir o quão comuns são os círculos de DNA na população de leveduras, e acreditamos que este método possa ser utilizado em muitos tipos de estudos. Obviamente, um deles seria analisar tecido humano.Sabemos que genes podem ser amplificados em elementos circulares em leveduras, é claro, e até em células tumorais. Acho que, em geral, será interessante analisar células somáticas e investigar quais tipos de DNA circular vamos encontrar nelas e como podemos avaliar esse efeito. Na circularização, em células envelhecidas temos círculos que se acumulam com o avanço da idade, e esperamos que mais genes sejam encontrados no DNA circular.Além disso, gostaríamos de analisar os mecanismos moleculares da circularização do DNA, e uma abordagem óbvia é estudar leveduras nas quais temos mutantes defeituosos na recombinação homóloga e na não homóloga. Ao estudar esses mutantes, esperamos que o perfil de circularização do DNA seja diferente entre os diversos tipos de mutantes, e, com sorte, a partir dos estudos em levedura, seremos capazes de aprender muito mais sobre a circularização do DNA. Assim, em comparação com outros métodos, este é muito mais sensível e pode realmente permitir detectar o círculo de DNA em aproximadamente uma em cada 10.000 células.E, até onde sei, com base em estudos do ensaio realizado exaustivamente, os alelos mutantes normalmente precisam atingir uma proporção de um a 10% da população para que possam ser detectados. Certo, e com esta técnica você não precisa ter nenhum conhecimento prévio sobre os círculos de DNA formados, ao contrário de técnicas nas quais os círculos de DNA precisam ser parcialmente ligados e, então, podem ser facilmente detectados como amplificações por sequenciamento ou por coloração cromossômica.Sim, então acho que a principal vantagem é mesmo a sensibilidade, e espero que possamos fazer muitas coisas interessantes com este método.

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Biology

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