A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

Purificação em todo o genoma de DNA circular extracromossômico de células eucarióticas. Olá, sou Rasmus. Aqui apresentarei toda a descrição do método para a purificação de DNA circular.

No primeiro passo, as células de levedura são cultivadas e colhidas. Em seguida, o DNA circular é purificado e amplificado em três etapas. Primeiro, por separação em coluna, na qual os círculos de DNA são purificados e enriquecidos.

Em seguida, pelo tratamento do DNA com exonuclease para digerir todo o DNA linear remanescente e, finalmente, pela amplificação dos círculos de DNA utilizando a polimerase phi-29. Na quinta parte deste protocolo, os círculos de DNA são sequenciados e as leituras são mapeadas no genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae. Ao final deste vídeo, mostraremos alguns resultados representativos.

Discutiremos as perspectivas para estudos futuros e as vantagens do uso deste método. Parte um, colheita de células. O cultivo inicial é crescido a 30 graus sob agitação até a densidade máxima, que é aproximadamente 200 milhões de células por mililitro e é alcançada após 24 a 48 horas.

O cultivo crescido é transferido para um tubo Falcon e centrifugado por três minutos para formar um pellet. O sobrenadante é removido. O pellet grande é vortexado em tampão TE e centrifugado novamente para reprecipitação.

Parte dois, purificação em coluna. Nesta etapa, utilizamos um kit comercialmente disponível de purificação em coluna que fornece plasmídeos altamente purificados a partir de DNA bacteriano genômico. Antes de usar este kit com levedura, a parede celular precisa ser rompida.

Isso é feito ressuspendendo o pellet celular lavado no tampão L-1 do kit. A suspensão celular é transferida para um tubo de microcentrífuga e as esferas de vidro são adicionadas até um terço do volume total. A amostra é vortexada em velocidade máxima por 10 minutos e as esferas são removidas por centrifugação a 2.000 rotações por minuto durante 30 segundos.

O sobrenatante é transferido para um novo tubo. Neste método, adicionamos plasmídeos altamente diluídos ao sobrenatante em três proporções diferentes. Propomos incluir plasmídeo altamente diluído no ciclo.

Isso pode servir como guias de referência interna. Você pode utilizá-los para verificar a qualidade da purificação e amplificação do seu DNA e, além disso, fazer uma estimativa semi-quantitativa do número de DNAs não circulares por célula utilizando esses plasmídeos de controle. Apenas plasmídeos altamente diluídos devem ser adicionados, pois eles afetarão a resolução da sequência de outros DNAs circulares.

A suspensão celular contendo plasmídeos adicionados é tratada com a solução L-2 do kit, seguindo o protocolo do kit. Após a aplicação na coluna, proteínas, lipídios e DNA cromossômico são removidos por meio de duas lavagens da coluna. O DNA circular extracromossômico é altamente enriquecido na fração eluída.

Parte três, digestão de DNA linear. Nesta etapa, utilizamos uma exonuclease para digerir o DNA linear remanescente. Uma exonuclease dependente de ATP direciona especificamente o DNA linear de dupla e de fita simples, sem digerir o DNA circular.

A especificidade da exonuclease para DNA linear foi confirmada por eletroforese em gel após 29 horas de tratamento com DNase. Os resultados mostram que o DNA genômico é digerido, enquanto o DNA plasmidial permanece, conforme indicado pela seta vermelha. O levedo contém 16 cromossomos, com até 1.500 quilobases de comprimento.

Para facilitar a digestão por exonuclease, utiliza-se uma endonuclease de corte raro para obter um número aumentado de extremidades de DNA acessíveis. Se for usada a enzima de restrição baseada em ate, NotI, cada cromossomo é clivado até sete vezes, conforme indicado. O DNA purificado em coluna é tratado com NotI a 37 graus em um bloco de aquecimento durante a noite.

Após a inativação térmica da NotI, o DNA clivado é tratado com exonucleases a 37 graus de acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento com exonuclease, as enzimas são inativadas termicamente a 70 graus por 30 minutos. Pode levar vários dias para digerir todo o DNA cromossômico linear com adição adicional de ATP e exonuclease. Para garantir que todo o DNA linear seja completamente digerido, as amostras são analisadas por métodos de PCR ou qPCR utilizando um gene de referência interno, como ACTI.

Parte quatro, amplificação de DNA. Nesta etapa, enriquecemos e amplificamos o DNA circular utilizando a polimerase phi-29. A reação ocorre a 30 graus usando oligonucleotídeos hexaméricos aleatórios e phi-29.

A polimerase possui alta fidelidade e atividade de correção de leitura, garantindo amplificação de DNA não tendenciosa. Cada polimerase pode, por meio da replicação em círculo rolante, sintetizar até 100 quilobases de DNA. A polimerase também é altamente processiva, amplificando o DNA até 10 elevado à nona potência vezes.

Parte cinco, sequenciamento. Seguindo o protocolo para uma plataforma de sequenciamento de nova geração de alto rendimento, o DNA é sonicado até um tamanho médio de 300 pares de bases e sequenciado como leituras simples de 141 nucleotídeos. As leituras de sequência são mapeadas para o genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae, utilizando o banco de dados gratuito Galaxy.

Os dados sequenciados são enviados para o Galaxy e as leituras são mapeadas utilizando o alinhador de leituras curtas Bowtie2, que permite o mapeamento de leituras parciais. Parte seis, resultados representativos. Após o sequenciamento e o mapeamento no genoma de referência de Saccharomyces cerevisiae, as leituras podem ser visualizadas no navegador genômico dentro do software Galaxy.

O DNA de origem circular pode, por exemplo, ser contado como regiões que contêm leituras coerentes maiores que um quilobase, conforme indicado na tela. Um exemplo de uma região no cromossomo quatro que contém leituras coerentes abrangendo mais de um quilobase é a região com os genes do transportador de hexose seis e sete. Ao utilizar este método em uma população de células de levedura, leituras mapeadas são frequentemente encontradas nesse locus e a cobertura de leitura sugere claramente que um círculo de DNA se formou entre os genes parálogos do transportador de hexose.

Devido à alta homologia de sequência entre os genes transportadores de hexose, propomos que a recombinação homóloga ilegítima leve à circularização desse DNA. No modelo de mutação por DNA circular, o processo de reparo de DNA ocorre de forma imperfeita. Por exemplo, se uma quebra de dupla fita ocorrer em um elemento repetitivo, a sequência homóloga no mesmo cromatídeo pode ser usada como molde para o reparo do DNA por recombinação homóloga.

Após a excisão, invasão da fita, síntese de DNA e resolução de todas as junções, um círculo de DNA pode se formar a partir do genoma, causando uma deleção de DNA no cromossomo. Os efeitos do tratamento do DNA com exonucleases e polimerase phi-29 podem ser visualizados usando coloração com iodeto de propídio. Os controles de coloração de DNA genômico aparecem conforme a imagem à esquerda, enquanto o DNA plasmidial aparece conforme a imagem à direita.

Após 29 horas de tratamento com exonuclease em 400 nanogramas de DNA genômico, a maioria do DNA é digerida, conforme indicado na imagem à esquerda. Esse resultado é confirmado por eletroforese em gel, conforme mostrado na imagem do gel à direita. Após 72 horas de tratamento com exonuclease seguido da síntese de DA pela polimerase phi-29, ainda é possível identificar milhões de cópias de DNA.

Da mesma forma, após 29 horas de tratamento com exonuclease de 400 nanogramas de DNA genômico, mais 100 nanogramas adicionais de DNA plasmidial, a maioria do DNA genômico é digerida. No entanto, o DNA plasmidial não é digerido, conforme indicado pela imagem do gel. Após o tratamento com a polimerase phi-29 da amostra tratada com exonuclease por 72 horas, a maior parte do DNA amplificado aparece como plasmídeos corados.

Então, inicialmente realizamos a triagem de genes para DNA circular e ficamos realmente surpresos ao encontrar várias centenas de tipos diferentes de amostras de DNA. Sim, foi realmente surpreendente descobrir o quão comuns são os círculos de DNA na população de leveduras, e acreditamos que este método possa ser utilizado em muitos tipos de estudos. Obviamente, um deles seria analisar tecido humano.

Sabemos que genes podem ser amplificados em elementos circulares em leveduras, é claro, e até em células tumorais. Acho que, em geral, será interessante analisar células somáticas e investigar quais tipos de DNA circular vamos encontrar nelas e como podemos avaliar esse efeito. Na circularização, em células envelhecidas temos círculos que se acumulam com o avanço da idade, e esperamos que mais genes sejam encontrados no DNA circular.

Além disso, gostaríamos de analisar os mecanismos moleculares da circularização do DNA, e uma abordagem óbvia é estudar leveduras nas quais temos mutantes defeituosos na recombinação homóloga e na não homóloga. Ao estudar esses mutantes, esperamos que o perfil de circularização do DNA seja diferente entre os diversos tipos de mutantes, e, com sorte, a partir dos estudos em levedura, seremos capazes de aprender muito mais sobre a circularização do DNA. Assim, em comparação com outros métodos, este é muito mais sensível e pode realmente permitir detectar o círculo de DNA em aproximadamente uma em cada 10.000 células.

E, até onde sei, com base em estudos do ensaio realizado exaustivamente, os alelos mutantes normalmente precisam atingir uma proporção de um a 10% da população para que possam ser detectados. Certo, e com esta técnica você não precisa ter nenhum conhecimento prévio sobre os círculos de DNA formados, ao contrário de técnicas nas quais os círculos de DNA precisam ser parcialmente ligados e, então, podem ser facilmente detectados como amplificações por sequenciamento ou por coloração cromossômica.

Sim, então acho que a principal vantagem é mesmo a sensibilidade, e espero que possamos fazer muitas coisas interessantes com este método.