Name: Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a preparar colônias-coorte único de abelhas Apis mellifera e aplicar tratamentos hormonais com hormônio juvenil e ecdisona para analisar a fisiologia associada às funções das operárias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por uma Bolsa de Auxílio para Pesquisa Científica (B) e uma Bolsa de Auxílio para Pesquisa Científica em Áreas Inovadoras 'Etologia Molecular de Sistemas' do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT) do Japão. T.U. recebeu um Subsídio da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência para Jovens Cientistas.

1. Preparação de colónias-coorte Individual <ol><li> Prepare três colônias de abelhas para criar duas colónias-coorte único e obter um número suficiente de trabalhadores recém-emergidas. <ol><li> Verifique se algum pupas nas células periféricas tampadas nos favos, tem olhos castanhos e uma cutícula pigmentada abrindo os pentes tampado com uma pinça. Se existem essas pupas em células pente periféricos, a maioria das pupas em todo o pentes vão surgir em cerca de 1-3 dias. </li><li> Posteriormente, recolher os favos que contenham esses pupas depois de todas as abelhas adultas aderentes foram removidas com uma escova, e misture pentes das três colónias para minimizar a variabilidade entre as colônias. </li></ol></li><li> Coloque os pentes recolhidos em uma caixa colmeia vazia e incubar a 33 ° C sob condições de umidade (&gt; 60% de umidade relativa). Recolher cerca de 6.000 trabalhadores recém-emergidas durante 3 dias (3.000 trabalhadores por colónia) dos pentes recolhidos. </li><li> Determinar a quantidade de workers com base no peso de cinco trabalhadores recém-emergidas coletadas aleatoriamente a partir de colónias não manipuladas. <ol><li> Pesar cinco trabalhadores recém-emergidas recolhidos aleatoriamente a partir de colónias não manipuladas utilização de máquinas de pesagem. Nota: O peso de cinco trabalhadores recém-emergidas é geralmente 500-600 mg. </li><li> Estimar a quantidade de trabalhadores recolhidos pela divisão do peso dos trabalhadores recolhidos pelo peso médio de cinco trabalhadores recém-emergidas. </li></ol></li><li> Aplicar marcas de tinta para as thoraces de cerca de 1.800 trabalhadores (900 trabalhadores por colônia), utilizando marcadores de tinta à base de água poster. Nota: marcador lavável, que é usada para aplicar a tinta está listada na tabela de materiais. </li><li> Introduzir uma rainha e aproximadamente 3.000 dos trabalhadores 0-2 dias de idade para uma nova caixa de colmeia que contém dois pentes, um pente contendo mel e pólen como conservas e outro pente vazio para postura de ovos pela rainha. Recolher o pente contendo mel e pólen from outra colônia unmanipulated depois de todas as abelhas aderentes são removidas. Nota: O uso da caixa de ramificação nuclear (caixa pequena colmeia tamanho) é recomendado. </li><li> Recolher as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces com marcas de tinta de 6 a 8 dias após a criação de colónias-coorte único. <ol><li> Para a coleta de abelhas enfermeira, pegar os trabalhadores que colocam suas cabeças em células pente para cuidar da prole. Use uma pinça para recolher as abelhas enfermeira de pentes que contêm muitos trabalhadores de cria e adultos. Nota: Se HPGS de trabalhadores recolhidos são desenvolvidas quando dissecado tal como descrito na etapa 1.7, estes trabalhadores são definidos como abelhas enfermeira. Segurando as thoraces por pinças é recomendado para pegar os trabalhadores dos favos. </li><li> Para a coleta de forrageiras, utilize uma rede de insetos para capturar os trabalhadores que retornam para suas colméias com cargas de pólen em suas pernas traseiras. Nota: Se HPGS dos trabalhadores capturados aparecem quando encolhido dissecado tal como descrito no passo 1.7, os trabalhadores são definidos como forrageiras. </li></ol></li><li> clasSIFY o HPG em três grupos, &quot;desenvolvidos&quot;, &quot;intermediário&quot; e &quot;encolhida&quot; pela dissecção sob microscópio estereoscópico. <ol><li> Anestesiar 10-15 abelhas em uma gaiola de inseto em uma geladeira por 10-15 minutos até que as abelhas não podem voar ou a pé. Em seguida, mover-se sobre gelo e abelhas completar a anestesia em gelo durante 5 min. Nota: Demora cerca de total de 15-20 minutos para alcançar a anestesia. Se o tempo de anestesia deve ser reduzido, o número de abelhas em uma gaiola deve ser reduzida para 1-3 por gaiola abelhas. </li><li> Dissecar a cabeça do corpo com tesouras e pinças. Fixar a cabeça em cera dental colocado em uma placa de Petri com alfinetes. Inserir dois pinos para as bases das antenas para fixar a cabeça. Soak cabeças fixas em solução salina de insectos (130 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM CaCl2). </li><li> Remover o aspecto anterior da cutícula da cabeça utilizando uma pinça fina e uma faca cirúrgica sob um microscópio binocular. Nota: Os HPGS podem ser facilmente encontrados na cabeça após a remoção de Cuticle. A HPG é um órgão botrióide que existe em torno do cérebro na cabeça. </li><li> Remover o tecido traqueal, que é um tecido membranoso branco sob a cutícula. Então, dissecar os HPGS da cabeça, puxando-os lentamente com uma pinça. </li><li> Classificar HPGS com ácinos grande e circular como &quot;desenvolvido&quot;. Classificar HPGS com pequena e distorcida ácinos como &#39;encolhido&#39;. Classificar HPGS correspondente a nenhum &quot;desenvolvido&quot; nem &quot;encolhida&quot; como &quot;intermediário&quot;. Nota: Fotografias representativas que mostram estas três classes de estados HPG são indicados na Figura 2. </li><li> Assunto &quot;desenvolvido&quot; e HPGS &#39;Shrunken&#39; para extração de RNA como &#39;enfermeira abelha HPGS&#39; e &#39;HPGS de forrageiras &quot;, respectivamente, e comparar a expressão do gene nos HPGS entre abelhas de enfermagem e forrageiras (Seção 4). </li></ol></li></ol> 2. Injecção de 20E <ol><li> Recolha abelhas enfermeira de colónias típicas como described no procedimento 1.6.1. Nota: HPGS não pode ser examinada nessas abelhas como as abelhas serão criados. </li><li> Anestesiar as abelhas a 4 ° C num frigorífico (não em gelo). Nota: Demora cerca de 30 min para conseguir anestesia. Se o tempo de anestesia é reduzido, o número de abelhas na gaiola deve ser reduzida para 1-3 abelhas por gaiola. </li><li> Com uma pinça, imobilizar as abelhas em cera dental colocados em uma placa de Petri. </li><li> Injectar 1 ul de uma solução 20E no aspecto anterior da cabeça utilizando uma ponta de injecção feita a partir de uma micropipeta capilar calibrado usando um extractor de agulha de vidro. <ol><li> Dissolve-se em solução salina de etanol 20E-inseto (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 1 mM) mistura (1: 4) a 2,5 ug / ul. </li><li> Ligue a ponta de injecção para um tubo de borracha, e ligar uma ponta de micropipeta de amarelo para o lado oposto do tubo. </li><li> Coloque 1 ml de solução 20E em parafilme utilizando uma micropipeta, segure a ponta da micropipeta amarelo na boca, umd desenhar a solução para a ponta de injecção. </li><li> Inserir a ponta de injecção para a base da antena, e injectar a solução por sopro através da ponta da micropipeta amarelo. Nota: O protocolo mostrado neste passo é o método de injecção representativo, mas o uso da máquina de injecção automatizado é recomendado para a segurança como necessário 20. </li></ol></li><li> Traseira as abelhas injetados em gaiolas de insetos em 33-36 ° C (a temperatura ideal é de 35 ° C) em condições escuras e úmidas (&gt; 60% de umidade relativa) durante 1 ou 3 dias. Fornecimento mistura mel-água (1: 1) para as abelhas. Se necessário, a contagem de sobreviventes abelhas após a injecção. </li></ol> 3. Aplicação de Methoprene <ol><li> Recolher os favos que contêm pupas de colónias típicas depois de todas as abelhas adultas aderentes são removidas com uma escova. Incubar os pentes de 33-36 ° C (a temperatura ideal é de 35 ° C) em condições húmidas (&gt; 60% de humidade relativa) durante 1 dia. </li><li&gt; Recolha abelhas recém-emergidas dos pentes recolhidos e aplicar marcas de tinta para os seus thoraces usando tinta cartaz como descrito no protocolo para a preparação de colónias-coorte único. Retornar as abelhas marcadas para suas colônias. </li><li> Após 6 dias, recolher trabalhadores pintadas (6 dias de idade) a partir das colónias. Pegar trabalhadores pintadas dos pentes, mantendo suas thoraces com uma pinça. </li><li> Anestesiar as abelhas a 4 ° C num frigorífico (não em gelo) como no procedimento 2.2. Usando pinças, imobilizar as abelhas em cera dental colocados numa placa de Petri e aplicar 1-5 uL de uma solução de metopreno (50-250 mg / mL) dissolvido em acetona para as suas cabeças utilizando uma micropipeta. Utilizar uma ponta de filtro que é resistente à acetona. Nota: Acetona pode ter efeitos nocivos sobre as abelhas, levando à morte. Se é observada a uma elevada mortalidade de abelhas, a redução do volume de acetona para 1 ml no mínimo é recomendado. </li><li> Traseira as abelhas em gaiolas de insetos em 33-36 ° C (o ideal temperature é de 35 ° C) durante 7 dias sob condições escuros e úmidos (&gt; 60% de umidade relativa). Fornecimento mistura mel-água (1: 1) para as abelhas. Se necessário, a contagem de sobreviventes abelhas após a aplicação tópica. Nota: Neste artigo, abelhas sobreviventes são contadas 7 dias após a aplicação (Tabela 3). </li></ol> 4. Extracção de ARN e RT-PCR quantitativo <ol><li> Anestesiar abelhas e dissecar HPGS como descrito nos passos 1.7.1 a 1.7.4. </li><li> Recolher os HPGS dissecados em um tubo de microcentrifugadora em gelo seco e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li><li> Adicionar 400 ul de reagente para a desnaturação da proteína. Nota: Este reagente está comercialmente disponível (ver a tabela de materiais). </li><li> Homogeneizar os tecidos HPG usando uma mão batedeira com um pilão de homogeneização que se encaixa dentro de um tubo de microcentrífuga. Homogeneizar a uma velocidade de rotação de aproximadamente 300 rpm durante 1 min em gelo para quebrar e lisam células de tecido. Tabela de Materiais). </li><li> Adicionar 80 ul de clorofórmio e misture bem. Incubar durante 5 min à TA. </li><li> Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. Adicionar um volume igual de isopropanol e 1 ul de glicogénio (5 mg / ml). Incubar a -20 ° C durante pelo menos 20 min. </li><li> Centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 10 min a 4 ° C e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar 400 ul de etanol a 75% ao sedimento e misturar bem, centrifugar os tubos de microcentrífuga a 14170 xg durante 15 min a 4 ° C, e remover o sobrenadante. Repita estes procedimentos mais uma vez. </li><li> Ar seco o sedimento durante 5-10 min e depois dissolvê-lo em 10 de água livre de RNase mL. Nota: a secagem completa do pelete pode causar insolubilização do sedimento de ARN em água. Assim, o sedimento que é ligeiramente molhado é apropriado paradissolução. </li><li> Medir a concentração de RNA usando um espectrofotómetro, tal como NanoDrop ou semelhante. </li><li> Tratar 500 ng de ARN total com 2,0 U de ADNase I por incubação a 37 ° C durante 30 minutos para degradar qualquer ADN genómico contaminante. </li><li> Reverse-transcrever 200 ng de ARN tratado com ADNase I e realizar PCR em tempo real utilizando kits disponíveis comercialmente (ver a lista na Tabela de Reagentes e Materiais) e iniciadores específicos do gene (mrjp2; 5&#39;-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3 &#39;, e 5 &#39;-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3&#39;, Hbg3; 5&#39;-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3 &#39;e 5&#39;-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3&#39;). Executar a PCR como se segue: [95 ° C x 30 seg + (95 ° C x 5 segundos + 60 ° C x 15 seg + 72 ° C x 20 seg) x 45-55 ciclos]. </li><li> Normalizar a quantidade de transcrição com o do factor de elongação 1α-F2 (EF1α˗F2) ou ribosomal da proteína 49 (rp49) 9,16,21,22. Estes genes são o controle confiável genos para analisar a expressão do gene nas HPGS utilizando qRT-PCR. </li><li> Execute bicaudal t-teste para detectar as diferenças significativas entre dois grupos experimentais (abelhas enfermeira vs. forrageiras precoces, abelhas tratadas-20E contra as abelhas de controle, e as abelhas tratadas com methoprene vs. abelhas controle) usando o software estatístico. Nota: Se o teste F assume a homogeneidade da variância, teste t de Student pode ser usado. Se não, o teste t de Welch pode ser usado. </li></ol>

<ol><li>Wilson, E. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+EO+%22The+insect+societies%22">The insect societies</a>. , Harvard university press. (1971).</li>
<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+ML+%22The+biology+of+the+honey+bee%22">The biology of the honey bee</a>. , Harvard university press. (1987).</li>
<li>Lindauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ein+Beitrag+zur+Frage+der+Arbeitsteilung+im+Bienenstaat%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+vergleichende+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat.</a> Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).</li>
<li>Sakagami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+uber+die+Arbeitsteilung+in+einen+Zwergvolk+der+Honigbienen.+Beitrage+zur+Biologie+des+Bienenvolkes%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Jap+J+Zool%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L.</a> I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).</li>
<li>Kubo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+expression+of+hypopharyngeal-gland+proteins+of+the+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+with+age+and%2For+role%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role.</a> J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).</li>
<li>Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+mode+of+gene+expression+of+the+hypopharyngeal+gland+cells+with+an+age-dependent+role+change+of+the+worker+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L.</a> Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).</li>
<li>Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+amylase+and+glucose+oxidase+in+the+hypopharyngeal+gland+with+an+age-dependent+role+change+of+the+worker+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L).</a> Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).</li>
<li>Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+and+analysis+of+expression+of+the+gene+for+alpha-glucosidase+from+the+hypopharyngeal+gland+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L.</a> Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).</li>
<li>Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+the+hypopharyngeal+glands+of+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+associated+with+an+age-dependent+role+change%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change.</a> Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).</li>
<li>Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+and+genetic+control+of+behavioral+integration+in+honey+bee+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies.</a> Science. 246 (4926), 109-112 (1989).</li>
<li>Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+hormone+paces+behavioral+development+in+the+adult+worker+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Behav%22%5BJournal%5D)">Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee.</a> Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).</li>
<li>Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+gene+action+across+different+time+scales+on+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influence of gene action across different time scales on behavior.</a> Science. 296 (5568), 741-744 (2002).</li>
<li>Lehman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%3A+the+role+of+tyramine+beta-hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).</li>
<li>Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+PTEN--description%2C+developmental+knockdown%2C+and+tissue-specific+expression+of+splice-variants+correlated+with+alternative+social+phenotypes%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes).</a> PLoS One. 6 (7), e22195(2011).</li>
<li>Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+in+the+brain+predict+behavior+in+individual+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees.</a> Science. 302 (5643), 296-299 (2003).</li>
<li>Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Gene+Expression+Profiles+of+the+Hypopharyngeal+Gland+of+Worker+Honeybees+in+Association+with+Worker+Behavior+and+Hormonal+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors.</a> PLoS One. 10 (6), e0130206(2015).</li>
<li>Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+ecdysteroid-regulated+gene+E74+of+the+honeybee+in+ovary+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain.</a> Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).</li>
<li>Takeuchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+gene%2C+Mblk-1%2C+that+encodes+a+putative+transcription+factor+expressed+preferentially+in+the+large-type+Kenyon+cells+of+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain.</a> Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).</li>
<li>Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcR-A+expression+in+the+brain+and+ovary+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L).</a> Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).</li>
<li>Yamane, T., Miyatake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+female+mating+receptivity+and+activation+of+oviposition+in+two+Callosobruchus+species+due+to+injection+of+biogenic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines.</a> Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).</li>
<li>Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+changes+in+phototaxis%3A+a+possible+role+for+the+foraging+gene+in+honey+bee+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor.</a> J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).</li>
<li>Danforth, B. N., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+factor-1+alpha+occurs+as+two+copies+in+bees%3A+implications+for+phylogenetic+analysis+of+EF-1+alpha+sequences+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects.</a> Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).</li>
<li>Pandey, A., Bloch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+hormone+and+ecdysteroids+as+major+regulators+of+brain+and+behavior+in+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees.</a> Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Preparação de colónias-coorte única Aqui descrevemos o protocolo utilizado em nosso estudo anterior 16 para preparar colónias-coorte único para análise da HPG fisiologia associada com a mudança no papel das abelhas operárias. Abelhas de enfermagem e forrageiras precoces que satisfizeram os critérios descritos nos procedimentos de 1,6-1,7 e Figura 2 foram observadas nas colônias-coorte único (Tabela 1). As fotografias da Figura 2 s...

A abelha europeia, Apis mellifera, é um inseto eusocial com uma sociedade altamente organizada 1. Abelhas operárias (casta de trabalho) estão envolvidos em várias tarefas para manter a atividade colônia, e estas tarefas mudar de acordo com a idade da abelha trabalhador após a eclosão, o que é referido como a divisão relacionada com a idade do trabalho 2-4. Os trabalhadores jovens (&lt;13 dias de idade) cuidar da ninhada na colmeia através da secreção de geléia real (abelhas enfermeira), enquanto os trabalhadores mais velhos (&gt; 15 dias de idade) recolhem o néctar e pólen fora da colméia (forrageiras) 2-4. A fisiologia dos trabalhadores muda em associação com esta mudança de papel. Por exemplo, a função das glândulas hipofaringe (HPGS), emparelhado glândulas exócrinas localizadas na cabeça, alterações em associação com a mudança de papel a partir de enfermagem para forrageamento 2,5. HPGS enfermeira abelha sintetizar principalmente principais proteínas da geléia real, que são os principais componentes do leite de abelha. Por outro lado, HPGS de forrageiras, principalmente,sintetizar enzimas metabolizadoras de hidratos de carbono, tais como α-glucosidase III, para processar néctar em mel através da conversão de sacarose em glicose e frutose. Os nossos estudos anteriores revelaram que a expressão de mrjp2, que codifica uma proteína principal da geleia real, e Hbg3, que codifica α-glucosidase III, alterações durante o deslocamento papel 6-9. Para determinar se as alterações fisiológicas dos tecidos de trabalho, incluindo as HPGS, está associada com a mudança de papel ou com a idade dos trabalhadores, seria útil para manipular a composição da população de uma colónia de abelhas, tal como para preparar uma única coorte colónias em que os trabalhadores de quase a mesma idade executar diferentes tarefas 10,11. Robinson et al. (1989) descreveram um método para o estabelecimento de uma colónia única de 10-coorte. colónias-coorte único compreendem inicialmente uma rainha e 0-2 dia os trabalhadores de idade. Vários dias depois de estabelecer as colônias, os trabalhadores de almost a mesma idade assumir diferentes tarefas. Alguns trabalhadores executar tarefas de enfermagem como em colónias típicas, enquanto outros trabalhadores executar tarefas de forrageamento mais cedo do que o habitual e são assim chamados forrageiras precoces. Comparações de expressão genética entre as abelhas de enfermagem e forrageiras precoces iria fornecer informações úteis sobre a fisiologia associada ao papel dos tecidos trabalhador 12-16. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de colónias-coorte único para análise da fisiologia de papéis e / ou associada à idade de HPGS 16. Também descrevemos brevemente como analisar a expressão gênica de mrjp2 e Hbg3 por quantitativa reação em cadeia de polimerase reversa (RT-PCR) para avaliar HPG fisiologia. Para além da análise de fisiologia trabalhador em colónias-coorte único, o exame do sistema endócrino é importante para analisar os mecanismos de regulação da fisiologia associada trabalhador-papel. hormônio juvenil (JH), que é known como o hormônio &#39;status quo&#39; em larvas de insetos, acelera a mudança no papel da enfermagem para forrageamento de abelhas operárias 11. Além disso, de ecdisona, que é conhecida como a hormona de muda durante a metamorfose, podem estar envolvidos na mudança de papel como genes que codificam para moléculas de sinalização de ecdisona são expressas nos corpos de cogumelo, um centro superior do cérebro trabalhador 17-19. Por isso, também descrevem o protocolo detalhado utilizado no nosso estudo anterior 16 para tratar os trabalhadores com 20E, que é uma forma activa de ecdisona, e metopreno, um análogo de JH, para análise do efeito do sistema endócrino em HPG fisiologia (expressão de mrjp2 e Hbg3).

<table><tbody><tr><td>Lápis UNIPOSCA</td><td>Mitsubishi</td><td>PC-5M</td><td>Caneta marcadora para aplicação de marcas em abelhas&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20-hidroxiecdisona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Metopreno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33375</td><td></td></tr><tr><td>Criadouro de inseto</td><td>IRIS OHYAMA</td><td>CP-SS</td><td></td></tr><tr><td>Electromotion mixier&nbsp;</td><td>Homogeneização ISO</td><td>23M-R25</td><td>do reagente TRIZol tecidual</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>o reagente para extração total de RNA</td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT kit de reagentes</td><td>Takara</td><td>RR037A</td><td>o reagente para transcrição reversa</td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq II</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td>o reagente para PCR</td></tr><tr><td>LightCycle 1.2 em</td> tempo real <td>Instrumento Roche</td><td>12011468001</td><td>o instrumento para PCR em tempo real</td></tr><tr><td>LightCycle Capilares (20&mu; l)</td> <td>Roche</td><td>4929292001</td><td>o material para PCR em tempo real</td></tr></tbody></table>

preparação de colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar fisiologia associated com a função e / ou sistema endócrino

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

As operárias das abelhas estão envolvidas em várias tarefas relacionadas à manutenção da atividade da colônia. As tarefas dos trabalhadores mudam de acordo com sua idade (divisão do trabalho relacionada à idade). As operárias jovens estão envolvidas na amamentação da ninhada (abelhas enfermeiras), enquanto as operárias mais velhas estão envolvidas na busca de néctar e pólen (forrageadoras). A fisiologia dos trabalhadores muda em associação com essa mudança de papéis. Por exemplo, a principal função das glândulas hipofaríngeas (HPGs) muda da secreção das principais proteínas da geléia real (MRJPs) para a secreção de enzimas metabolizadoras de carboidratos. Como as tarefas dos trabalhadores mudam à medida que envelhecem em colônias típicas, é difícil discriminar as mudanças fisiológicas que ocorrem com o envelhecimento daquelas que ocorrem com a mudança de papéis. Para estudar as mudanças fisiológicas nos tecidos das operárias, incluindo os HPGs, em associação com a mudança de papéis, seria útil manipular a população de colônias de abelhas preparando colônias de coorte única nas quais operárias de quase a mesma idade realizam tarefas diferentes. Aqui descrevemos um protocolo detalhado para preparar colônias de coorte única para esta análise. Seis a oito dias após a preparação da colônia de coorte única, forrageadoras precoces que realizam tarefas de forrageamento mais cedo do que o normal aparecem na colônia. Os resultados representativos indicaram alterações associadas ao papel na expressão do gene HPG, sugerindo função HPG associada ao papel. Além de manipular a população de colônias, a análise do sistema endócrino é importante para investigar a fisiologia associada ao papel. Aqui, também descrevemos um protocolo detalhado para o tratamento de trabalhadores com 20-hidroxiecdisona (20E), uma forma ativa de ecdisona, e metopreno, um análogo de hormônio juvenil. A taxa de sobrevivência das abelhas tratadas foi suficiente para examinar a expressão gênica nos HPGs. Alterações na expressão gênica foram observadas em resposta ao tratamento com 20E e/ou metopreno, sugerindo que os tratamentos hormonais induzem alterações fisiológicas dos HPGs. O protocolo de tratamento hormonal descrito aqui é apropriado para examinar os efeitos hormonais na fisiologia do trabalhador.

Uma visão geral do protocolo para a preparação de colónias-coorte único é ilustrado na Figura 1A. Tempo-decorrer de experiências de preparação de colónias-coorte único da recolha da amostra é mostrado na Figura 1B. Trabalhadores que satisfizeram os critérios comportamentais para o comportamento de enfermagem ou de comportamento de forrageamento foram coletados a partir de colónias-coorte único, e desenvolvimento HPG foi estimado nesses trabalhadores <str...

Aqui nós descrevemos nosso protocolo detalhado para a preparação de colônias de abelhas-coorte único - uma ferramenta útil para analisar a fisiologia trabalhador associada à função. Descrevemos também protocolos detalhados para o tratamento de trabalhadores com hormônio juvenil e ecdisona para avaliar o envolvimento desses hormônios na regulação do comportamento do trabalhador e / ou fisiologia.

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

O objetivo geral desses procedimentos é examinar a fisiologia de abelhas operárias em associação com o papel das operárias e o estado de seu sistema endócrino. É um método amplamente utilizado para a análise do comportamento de operárias, que também pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a relação entre a fisiologia e o papel das abelhas operárias. A principal vantagem dessa técnica é que ela é relativamente fácil de realizar.Para criar duas colônias de coorte única, comece com três colônias padrão e colete abelhas operárias recém-emergidas de cada uma das três. Usando pinças, inspecione regularmente as colônias quanto ao aparecimento de pupas nas células periféricas seladas com olhos castanhos e cutículas pigmentadas. Uma vez encontradas, a maioria das pupas emergirá nos próximos dias.Em seguida, escove os indivíduos adultos das prateleiras e remova as prateleiras da colônia. Combine uma dessas prateleiras de cada uma das três colônias em uma caixa de colmeia nuclear vazia. Monte duas dessas caixas de colmeia e incube-as a 33 graus Celsius com umidade relativa de pelo menos 60%. Nos próximos três dias, colete cerca de 3.000 operárias recém-emergidas de cada caixa de c

preparation-single-cohort-colonies-hormone-treatment-worker-honeybees

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Demonstramos como implementar um método de farmacologia comportamental em um paradigma de condicionamento apetitivo olfativa de abelhas (Apis mellifera) por aplicação sistêmica de medicamentos. Este método permite investigação dos mecanismos subjacentes à aprendizagem e formação da memória de uma forma simples e confiável.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Neste protocolo, descrevemos duas estratégias que suprimem simultaneamente dois genes (gene knockdown double) em abelhas. Em seguida, apresentamos como usar a resposta de extensão probóscide (PER) ensaio para estudar o efeito do gene knockdown duplo em mel de abelha percepção gustativa.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Em trabalhadores da abelha do mel, o envelhecimento depende de comportamentos sociais, em vez de idade cronológica. Aqui nós mostramos como trabalhador-tipos com padrões muito diferentes de envelhecimento podem ser obtidas e analisadas para a senescência celular.

Obtenção de amostras com retardado, acelerado e invertida Envelhecimento no Modelo Bee Mel

O protocolo de condicionamento Proboscis Extension Response (PER), desenvolvido para a abelha melífera (Apis mellifera), fornece um meio ecologicamente relevante e facilmente quantificável para estudar vários mecanismos diferentes de aprendizagem em muitas espécies de insetos.

Um protocolo de resposta narigudo Extensão para investigar plasticidade comportamental em Insetos: Aplicação para Basic, biomédica e Pesquisa Agropecuária

Consórcios microbianos dentro bumble colmeias enriquecem e preservar o pólen para larvas de abelha. Usando o sequenciamento de próxima geração, juntamente com o laboratório e experiências no terreno, este manuscrito descreve protocolos usados para testar a hipótese de que resíduos do fungicida alteram o pólen microbiome e demografia de colônia, finalmente levando à colônia perda.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Este manuscrito descreve vários protocolos para a administração de agentes farmacológicos para as abelhas, incluindo métodos não invasivos simples para abelhas de vôo livre, bem como variantes mais invasivos que permitem que o tratamento localizado precisa de abelhas dispositivos de retenção.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; Apis mellifera</em

Apresentamos aqui   um método para alimentar pesticida alimentos contaminados se tanto a um indivíduo abelha do mel e uma colónia colmeia. O procedimento avalia o efeito pesticida em abelhas de mel individuais por alimentação in vivo de dieta da larva de base e também na condição natural da colónia colmeia.

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

Doses subletais de pesticidas podem afetar colônias nas maneiras que são difíceis de detectar usando métodos somente periódicos ou visuais. Métodos para medir a massa total de abelha adulta, ninhada e os recursos alimentares por pesagem urticária e partes da colmeia, fotografando quadros e instalação de sensores, são fornecidos. Análise de dados também é abordada.

Monitoramento de nível de colônia os efeitos da exposição de pesticidas subletais em mel de abelhas

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Este protocolo foi desenvolvido para aprimorar a compreensão de como os agrotóxicos afetam a reprodução das abelhas de mel (Apis mellifera),estabelecendo métodos para expor rainhas das abelhas e seus cuidadores de trabalhadores a agrotóxicos em um ambiente controlado e laboratorial e monitorando cuidadosamente suas respostas relevantes.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

Aprenda a preparar colônias-coorte único de abelhas Apis mellifera e aplicar tratamentos hormonais com hormônio juvenil e ecdisona para analisar a fisiologia associada às funções das operárias.

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Explorar mais vídeos