Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

O objetivo geral deste protocolo é usar o peixe-zebra para observar o efeito de nefrotoxinas, como gentamicina ou cisplatina, para modelar a lesão renal aguda. A principal vantagem dessa técnica é que o modelo de peixe-zebra permite imagens em tempo real do dano celular e regeneração após lesão renal aguda. Para iniciar este procedimento, prepare uma ferramenta de manipulação de embriões para posicionar os embriões para microinjeção, anexando uma ponta de carregamento de gel na extremidade de uma agulha de dissecação reta de cinco polegadas e prenda-a com fita adesiva ou super cola.

Em seguida, prepare algumas agulhas de microinjeção cônicas finas puxando os vidros de borossilicato polido com filamento usando um extrator de pipeta. Em seguida, use uma lâmina de barbear ou uma ponta de pinça fina para cortar as pontas da agulha para criar pontas de injeção angulares afiadas. Em seguida, coloque as agulhas em uma tira de massa de modelar em uma placa de Petri para proteger as pontas das agulhas.

Para fazer a bandeja de microinjeção, prepare a solução de 1,5% de agarose E3 em um frasco Erlenmeyer de 100 mililitros, dissolvendo a agarose com E3 no microondas. Em seguida, deixe a mistura esfriar em temperatura ambiente por aproximadamente dez minutos. Despeje a solução de agarose E3 resfriada em uma placa de Petri para fazer uma base com uma profundidade de aproximadamente 0,5 centímetros.

Depois de solidificar, despeje uma segunda camada de solução de agarose E3. Em seguida, insira o molde do poço de embrião pré-fabricado no ágar, em um ângulo para evitar bolhas de ar, e deixe a agarose solidificar à temperatura ambiente. Depois que toda a bandeja de microinjeção endurecer, levante o molde do embrião pré-fabricado lentamente e com cuidado, encha o prato com solução E3 e armazene a quatro graus Celsius.

Neste procedimento, configure os tanques de acasalamento do peixe-zebra colocando divisórias nas câmaras de acasalamento e encha com água do sistema. Em seguida, coloque um peixe de cada lado da divisória, de modo que cada câmara de acasalamento contenha uma fêmea e um macho, e cubra ambas as câmaras de acasalamento. Na manhã seguinte, remova as divisórias para permitir a desova.

Após aproximadamente 30 minutos, verifique se há embriões no fundo do tanque. Em seguida, devolva os peixes ao aquário e colete seus embriões passando a água do tanque de acasalamento por uma ferramenta de filtro de malha de arame fino. Em seguida, inverta o filtro sobre uma placa de Petri e enxágue com E3 para coletar os embriões.

Posteriormente, incubar os embriões a 28,5 graus Celsius durante a noite. Quando os embriões atingirem o estágio 24 a 26 de somitos, decantar a maior parte do meio E3. Em seguida, descoriote-os adicionando meio E3, depois 100 microlitros de 50 miligramas por mililitro de pronase a cada prato de embriões e, em seguida, incubando os embriões a 28 graus Celsius por 15 minutos.

Após 15 minutos, encha o prato com E3 e gire suavemente para desalojar os córions dos embriões. Em seguida, decantar a pronase E3 e enxaguar o prato com 25 mililitros de E3.To fresco bloquear o desenvolvimento da pigmentação, substituir E3 por 25 mililitros de PTU E3 fresco 24 horas após a fertilização. Para experimentos que duram vários dias, substitua a solução E3 PTU por mídia nova uma vez ao dia para manter o prato limpo.

No dia da injeção, prepare a solução de nefrotoxina desejada com o controle apropriado do veículo. Vortex ou misture suavemente. Depois, verifique as laterais do tubo e a parte superior da coluna de água para garantir que os medicamentos sejam dissolvidos em solução.

Carregue uma agulha de microinjeção aparada com dois a três microlitros de nefrotoxina enfiando uma ponta de carregamento de gel fino na parte de trás da agulha e suspenda a agulha verticalmente com um pedaço de fita adesiva para permitir que a solução preencha a ponta da agulha aparada por gravidade. Quando a ponta da agulha estiver cheia, prenda a agulha carregada no micro manipulador. Teste o volume de microinjeção colocando uma gota de óleo mineral em uma lâmina micrométrica e injete no óleo para avaliar o tamanho da gota.

Em seguida, remova o prato de embriões da incubadora e anestesize-os adicionando cinco mililitros de tricaína a 0,2% ao prato de embriões. Posteriormente, transfira os embriões para o molde de injeção com uma pipeta de transferência. Manobre cada embrião em um poço diferente do molde, colocando a cabeça na área mais profunda do poço, de modo que o tronco repouse ao longo da depressão e a cauda se projete um pouco.

Agora, insira a agulha cheia no micro manipulador e posicione a ponta da agulha ao lado de um embrião. Insira suavemente a agulha na veia da cauda para microinjeção. A etapa mais crítica do procedimento é a microinjeção.

Para garantir o sucesso, a agulha deve ser cortada em um ângulo agudo, deve ser movida cuidadosamente para a posição ao lado do embrião. Se a injeção for bem-sucedida, você deverá ver o líquido entrando na circulação. A co-injeção do nefrotóxico com dextrina conjugada fluorescentemente permitiria ao pesquisador verificar o sucesso da injeção após o procedimento.

Depois, remova suavemente a agulha do embrião. Transfira o embrião para um prato limpo e enxágue para remover a tricaína com PTU E3 fresco. Em seguida, incube o embrião até o ponto de tempo desejado para avaliar a morfologia, que pode ser documentada por fotografia em meios de montagem de metilcelulose.

Ou processo para análise experimental conforme desejado. Observe que a recuperação dos embriões deve ser avaliada a cada 12 a 24 horas após a injeção para determinar a porcentagem de indivíduos com edema, o que geralmente indica lesão renal. A transparência do embrião de peixe-zebra facilita o procedimento de microinjeção e pode ser aprimorada ainda mais pelo tratamento químico PTU a 24 hpf, para diminuir o desenvolvimento da pigmentação durante um curso de tempo experimental típico.

Aqui, as amostras de embriões foram autorizadas a se desenvolver até o estágio de 72 hpf e, em seguida, foram injetadas simuladas, microinjetadas com veículo salino ou microinjetadas com 2,5 miligramas por mililitro de gentamicina. A observação ao vivo subsequente foi realizada um e dois dias após a injeção usando iluminação de transiluminação com um microscópio estéreo. Em comparação com embriões simulados ou injetados com solução salina, apenas os indivíduos injetados com gentamicina apresentaram o desenvolvimento de edema.

Neste caso, edema pericárdico sugerindo uma revogação da funcionalidade renal normal consistente com observações publicadas anteriormente. Após este procedimento, outros métodos, como a hibridização C2 de montagem inteira, podem ser realizados para avaliar as mudanças na expressão gênica após a exposição à nefrotoxina.