O uso de uma bateria de métodos químicos e ecotoxicológicos para a avaliação da eficácia dos Processos de Tratamento de Águas Residuais remover estrogénica Potência

O objetivo geral da bateria de testes descrita aqui, incluindo química analítica e métodos in vitro e in vivo, é determinar a eficácia de tecnologias emergentes e novas de tratamento de águas residuais, para remover contaminantes estrogênicos. Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave em engenharia ambiental, por exemplo, ao selecionar os processos de tratamento de águas residuais mais eficazes em uma potência estrogênica móvel de águas residuais. A principal vantagem dessas técnicas, é que elas são sensíveis a concentrações muito baixas de compostos ativos, evidenciando assim, as melhores tecnologias para proteger a vida aquática.

Demonstrando os procedimentos estarão o pós-doutorando, Dr. Chris Green, a estudante de pós-graduação, Angela Pinzon, a pesquisadora, Dra. Alice Baynes, e a técnica de pesquisa sênior, Nicola Beresford. O processo SPE requer muita atenção à limpeza e ordem para evitar a contaminação da amostra. Pré-limpe todos os tubos, torneiras e fritas com metanol.

Antes de executar as amostras, conecte as linhas de transferência ao coletor de extração e enxágue todo o sistema com água deionizada. Para executar as amostras, primeiro conecte os revestimentos de válvula descartáveis e, em seguida, conecte os cartuchos SPE de estireno divinilbenzeno. Em seguida, pipete cinco mililitros de acetato de etila em cada reservatório para condicionar os cartuchos.

Durante esta etapa, certifique-se de que o SPE esteja lacrado. Em seguida, ligue a bomba de vácuo para uma vazão de 10 milímetros por minuto. Antes que os cartuchos sequem, carregue cinco mililitros de metanol, seguidos de cinco mililitros de água.

É muito importante que os cartuchos SPE não sequem. Depois que a água tiver aspirado principalmente, desligue a bomba e encha cada reservatório de cartucho com água. Em seguida, conecte tubos de PTFE de 1/8 de polegada entre os reservatórios do cartucho e os frascos de amostra de vidro.

Agora, mude o vácuo para uma taxa de fluxo abaixo de 10 mililitros por minuto e deixe toda a amostra passar pelo cartucho. Em seguida, seque bem os cartuchos SPE, até que o conteúdo do cartucho mude de cor. Use um vácuo ou um fluxo de gás.

Agora, coloque frascos de coleta de vidro limpos e secos de 10 mililitros em uma prateleira e coloque a prateleira dentro do coletor de extração. Verifique se cada revestimento está acima de um frasco. Carregue os reservatórios de amostra com duas vezes quatro mililitros, para um total de oito mililitros de diclorometano, ligue a bomba de vácuo e deixe o líquido passar pelo SPE e entrar nos frascos de coleta.

Em seguida, use um concentrador para reduzir o volume em todos os frascos de coleta para um mililitro. Transfira cada amostra para um frasco de amostrador automático e concentre-as até 100 microlitros, usando equipamento de descarga de nitrogênio. A próxima etapa do processo é usar o GPC para remover interferências macromoleculares.

Primeiro, injete 95 microlitros do extrato de amostra iludida, no GPC equipado, HPLC. Concentrar o extracto de GPC até 200 microlitros, utilizando um concentrador, e o aparelho de descarga de azoto e, em seguida, enchê-lo até dois mililitros com hexano. Em seguida, conecte revestimentos de válvula descartáveis, cartuchos de amino roxo e reservatórios de cartucho ao coletor SPE e através dos frascos de coleta de vidro de 10 mililitros.

Agora, carregue dois mililitros de hexano em cada cartucho, para condicioná-los e descartar o solvente. Em seguida, carregue o extrato de amostra GPC no reservatório e aspire-o. Reserve a coleta de extratos e recoloque o frasco na prateleira para coletar a lavagem.

Em seguida, passe dois mililitros de acetato de etila e hexano a 30% volume por volume pelo cartucho. Em seguida, adicione mais dois mililitros de acetato de etila e hexano, descarte as coleções de solução de lavagem e devolva o frasco de coleta de 10 mililitros ao rack. Agora, adicione dois mililitros de acetato de etila e acetona a 50% volume por volume no reservatório e ligue a bomba em uma vazão baixa, abaixo de dois mililitros por minuto.

Depois que o líquido passar, adicione mais dois mililitros de acetato de etila a 50% ao reservatório. Agora, use um concentrador para reduzir o volume do extrato para um mililitro. Em seguida, transfira a amostra para um frasco de vidro menor e use equipamento de sopro de nitrogênio para evaporar o extrato em incipiente para adicionar 100 microlitros de metanol, misture bem a amostra e transfira-a para um frasco de amostrador automático com uma inserção de 0,3 mililitro.

Em seguida, execute a análise LC-MS/MS do extrato. Um dia antes de iniciar o ensaio, prepare um novo meio de crescimento e inocule-o com a doca tenax da cepa usada por HER. No dia seguinte, preparar-se para o ensaio, fazendo delírios seriados de 100 microlitros dos produtos químicos em estudo ou extractos de efluentes e, em seguida, curva padrão E2 em etanol.

Agora, transfira alíquotas de 10 microlitros para uma placa estéril rotulada de 96 poços. Em seguida, deixe a placa descoberta para evaporar o etanol. Em seguida, prepare 50 mililitros de meio de crescimento, com 0,5 mililitros de solução CPRG.

A partir da cultura de levedura de 24 horas, meça a turbidez em 620 nanômetros para estimar a densidade celular. Em seguida, adicione 40 milhões de células de levedura aos 50 mililitros de meio de ensaio. Transfira o meio de ensaio inoculado em uma calha estéril e use uma pipeta multicanal para transferir 200 microlitros de meio para cada poço da placa de ensaio.

Recoloque a tampa da placa de ensaio, sele as bordas com fita adesiva e agite a placa de ensaio vigorosamente por dois minutos usando um agitador de placas. Em seguida, incube a placa a 32 graus Celsius, em um gabinete de aquecimento naturalmente ventilado. Após três dias de incubação, repita o shake novamente e deixe o fermento repousar por cerca de uma hora.

Finalmente, meça os absorventes de luz pelas amostras, em 540 e 620 nanômetros. Amostras de água de um plano convencional de tratamento de águas residuais para ativar seu processo de lodo, foram analisadas usando eletrospray de íons negativos LCMS, etinilestradiol estava presente em uma concentração acima do nível previsto sem efeito. Usando tratamento avançado de água, como carvão ativado granulado, ou GAC, foi possível reduzir substancialmente os níveis de etinilestradiol.

Todos os extratos de águas residuais foram analisados com um padrão interno marcado isotopicamente, pico vermelho, para permitir a quantificação. O ensaio de levedura para estrogênio foi claramente sensível ao estradiol padrão, mas não escolheu nenhuma resposta ao etanol, que é essencialmente o branco. As células da tela de levedura foram claramente responsivas ao efluente do processo de lodo ativado, enquanto o efluente tratado com GAC produziu uma resposta diminuída, ainda mais biologicamente ativo do que o branco.

Usando esta nova tecnologia de tratamento de águas residuais, tanto a concentração de etanol estradiol, mostrada em azul, quanto a atividade estrogênica, mostrada em verde, foram significativamente reduzidas pela combinação de peróxido de hidrogênio e tratamento com TAML. As estações de tratamento de águas residuais são a principal fonte de contaminação das águas superficiais com substâncias estrogênicas. Novas maneiras de os processos de tratamento de água melhorarem esses efluentes exigem testes aprofundados da atividade estrogênica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de uma bateria de testes químicos e ecotoxicológicos, necessários para medir a atividade estrogênica em amostras de água. É extremamente importante garantir que a contaminação de amostras e extratos seja minimizada com um manuseio cuidadoso de amostras e extratos. Por exemplo, os plásticos comumente usados contêm compostos estrogênicos, portanto, é essencial incluir controles negativos para verificar se há contaminação química e controles positivos para verificar se o método de extração funcionou e se há boa recuperação de estrogênios enriquecidos.