O uso de uma bateria de métodos químicos e ecotoxicológicos para a avaliação da eficácia dos Processos de Tratamento de Águas Residuais remover estrogénica Potência

O objetivo geral da bateria de testes descrita aqui, incluindo métodos de química analítica e abordagens in vitro e in vivo, é determinar a eficácia de tecnologias emergentes e inovadoras de tratamento de águas residuais na remoção de contaminantes estrogênicos. Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na engenharia ambiental, por exemplo, ao selecionar os processos de tratamento de águas residuais mais eficazes frente à variação da potência estrogênica do efluente. A principal vantagem dessas técnicas é que são sensíveis a concentrações muito baixas de compostos ativos, evidenciando assim as melhores tecnologias para proteger a vida aquática.

Os procedimentos serão demonstrados pelo pesquisador pós-doutorando, Dr. Chris Green, a estudante de pós-graduação, Angela Pinzon, a pesquisadora visitante, Dra. Alice Baynes, e a técnica sênior de pesquisa, Nicola Beresford. O processo de SPE exige atenção rigorosa à limpeza e à organização para prevenir contaminação das amostras. Pré-limpe todos os tubos, torneiras e filtros com metanol.

Antes de analisar as amostras, conecte as linhas de transferência ao manifold de extração e enxágue todo o sistema com água desionizada. Para analisar as amostras, primeiro conecte os insertos descartáveis para válvula e, em seguida, conecte as cartuchas de SPE de estireno-divinilbenzeno. Depois, pipete cinco mililitros de acetato de etila em cada reservatório para condicionar as cartuchas.

Nesta etapa, certifique-se de que o SPE está selado. Em seguida, ligue a bomba de vácuo para obter uma vazão de 10 milímetros por minuto. Antes que as cartuchas sequem, adicione cinco mililitros de metanol, seguidos por cinco mililitros de água.

É muito importante que as cartuchas de EPE não sequem. Depois que a água tiver sido quase totalmente aspirada, desligue a bomba e reabasteça o reservatório de cada cartucha com água. Em seguida, conecte tubos de PTFE de 1/8 de polegada entre os reservatórios das cartuchas e os frascos de amostra de vidro.

Agora, altere o vácuo para uma vazão abaixo de 10 mililitros por minuto e deixe a amostra inteira passar através do cartucho. Em seguida, seque completamente os cartuchos de extração em fase sólida até que a cor do conteúdo do cartucho mude. Utilize vácuo ou um fluxo de gás.

Agora, carregue frascos de coleta de vidro limpos e secos de 10 mililitros em uma grade e coloque a grade dentro do manifold de extração. Verifique se cada liner está posicionado acima de um frasco. Carregue os reservatórios da amostra com duas vezes quatro mililitros, totalizando oito mililitros de diclorometano, ligue a bomba de vácuo e deixe o líquido passar pela SPE e cair nos frascos de coleta.

Em seguida, utilize um concentrador para reduzir o volume em todas as provetas de coleta para um mililitro. Transfira cada amostra para um frasco de amostragem automática e concentre-as ainda mais até 100 microlitros, utilizando equipamento de evaporação com nitrogênio. A próxima etapa do processo é usar a CLP para remover interferências macromoleculares.

Primeiro, injete 95 microlitros do extrato da amostra eluída no sistema de CLAE equipado com GPC. Concentre o extrato do GPC até 200 microlitros, utilizando um concentrador e o aparelho de evaporação com fluxo de nitrogênio, e em seguida complete o volume até dois mililitros com hexano. A seguir, acople revestimentos descartáveis para válvulas, cartuchos de amino purple e reservatórios para cartuchos ao conjunto de SPE, juntamente com os frascos de coleta de vidro de 10 mililitros.

Agora, adicione dois mililitros de hexano em cada cartucho para condicioná-los e descarte o solvente. Em seguida, adicione o extrato da amostra de GPC no reservatório e aspire-o através do cartucho. Reserve a coleta do extrato e substitua o frasco no suporte para coletar a lavagem.

Em seguida, passe dois mililitros de acetato de etila e hexano a 30 por cento volume por volume através do cartucho. Então, adicione mais dois mililitros de acetato de etila e hexano, descarte as frações da solução de lavagem coletadas e retorne o frasco coletor de 10 mililitros ao suporte. Agora, adicione dois mililitros de acetato de etila e acetona a 50 por cento volume por volume no reservatório e inicie a bomba com uma vazão baixa, abaixo de dois mililitros por minuto.

Após o líquido passar, adicione mais dois mililitros de acetato de etila a 50% ao reservatório. Agora, utilize um concentrador para reduzir o volume do extrato a um mililitro. Em seguida, transfira a amostra para um frasco de vidro menor e use equipamento de evaporação com jato de nitrogênio para evaporar o extrato até a secura incipiente. Adicione 100 microlitros de metanol, homogeneíze bem a amostra e transfira-a para um frasco de amostragem automática com inserção de 0,3 mililitro.

Em seguida, realize a análise por CL-EM/EM do extrato. No dia anterior ao início do ensaio, prepare meio de crescimento fresco e inóculo-o com o suporte de tenáx da linhagem de HER utilizada. No dia seguinte, prepare o ensaio, fazendo diluições seriadas de 100 microlitros dos produtos químicos em teste ou extratos de efluente, e então a curva padrão de E2 em etanol.

Agora, transfira alíquotas de 10 microlitros para uma placa estéril de 96 poços rotulada. Em seguida, deixe a placa descoberta para evaporar o etanol. A seguir, prepare 50 mililitros de meio de crescimento, com 0,5 mililitros de solução de CPRG.

A partir da cultura de levedura de 24 horas, meça a turbidez em 620 nanômetros para estimar a densidade celular. Em seguida, adicione 40 milhões de células de levedura aos 50 mililitros do meio de ensaio. Transfira o meio de ensaio inoculado para um recipiente estéril e use uma pipeta multicanal para transferir 200 microlitros de meio para cada poço da placa de ensaio.

Substitua a tampa da placa de ensaio, feche as bordas com fita adesiva e agite vigorosamente a placa de ensaio por dois minutos usando um agitador de placas. Em seguida, incube a placa a 32 Celsius, em uma estufa com ventilação natural. Após três dias de incubação, repita a agitação e, então, deixe o fermento sedimentar por cerca de uma hora.

Por fim, meça a absorção luminosa pelas amostras em 540 e 620 nanômetros. Amostras de água de uma estação convencional de tratamento de esgoto para ativar seu processo de lodo ativado foram analisadas por espectrometria de massas com ionização por eletrospray em modo iônico negativo (LCMS), detectando etinilestradiol em uma concentração acima do nível predito de ausência de efeito. Com o uso de tratamento avançado de água, como carvão ativado granulado ou GAC, foi possível reduzir substancialmente os níveis de etinilestradiol.

Todos os extratos de águas residuais foram analisados com um padrão interno marcado isotopicamente, pico vermelho, para permitir a quantificação. O ensaio de triagem de levedura para estrogênio mostrou clara sensibilidade ao estradiol padrão, mas não apresentou resposta ao etanol, que é essencialmente a amostra em branco. As células de triagem de levedura responderam claramente ao efluente do processo de lodo ativado, enquanto o efluente tratado com carvão ativado granular (GAC) produziu uma resposta reduzida, ainda assim sendo mais ativo biologicamente do que o branco.

Utilizando esta nova tecnologia de tratamento de águas residuais, tanto a concentração de etanol estradiol, mostrada em azul, quanto a atividade estrogênica, mostrada em verde, foram significativamente reduzidas pelo tratamento combinado com peróxido de hidrogênio e TAML. As estações de tratamento de esgoto são a principal fonte de contaminação de águas superficiais por substâncias estrogênicas. Novas formas de aprimorar os processos de tratamento de água desses efluentes exigem testes aprofundados da atividade estrogênica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de uma bateria de testes químicos e ecotoxicológicos necessários para medir a atividade estrogênica em amostras de água. É extremamente importante garantir que a contaminação das amostras e extratos seja minimizada com um manuseio cuidadoso dessas amostras e extratos. Por exemplo, plásticos comumente utilizados contêm compostos estrogênicos; portanto, é essencial incluir controles negativos para verificar a contaminação química e controles positivos para confirmar que o método de extração funcionou e que houve boa recuperação dos estrogênios adicionados.