Name: Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda a cultivar macrófagos derivados de monócitos humanos usando M-CSF para biologia imunológica. Este método reduz a dependência de doadores e garante densidades celulares consistentes para pesquisa.

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O Departamento de Medicina Transfusional, Centro Clínico, National Institutes of Health, forneceu monócitos elutriados. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural, Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue, Institutos Nacionais de Saúde.

Leucaférese foi realizado em protocolo de pesquisa de um sujeito humano aprovado por um National Institutes of Health conselho de revisão institucional. 1. Isolamento e criopreservação de monócitos <ol><li> Obtenção de células mononucleares por leucaferese de dadores humanos, monócitos e enriquecer por contínua contra-fluxo centrifugação elutriação de células mononucleares, tal como descrito nas referências 7,8. Obter aproximadamente 100 x 10 6 células elutriados (aproximadamente 80 - 90% de monócitos) em tampão de elutriação especificado pelo fabricante. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. </li><li> monócitos de centrifugação em um tubo de 15 ml de polipropileno a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em FBS, seguido de sulfóxido de dimetilo para alcançar uma concentração final de 90% de FBS / 10% de sulfóxido de dimetilo e 50 x 10 6 células / ml. </li><li> Adicionar cada ml de suspensão de células TO criotubo um indivíduo. </li><li> Coloque as criotubos num recipiente de congelação de células e transferir para um congelador de -80 ° C durante 24 h antes de transferir para um tanque de armazenamento de azoto líquido criotubo para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 2. Diferenciação de monócitos em macrófagos <ol><li> Descongelar um criotubo de células transferindo rapidamente a um banho de água a 37 ° C e, em seguida, imediatamente a remoção quando a suspensão de células foi descongelada cerca de 70%. </li><li> Imediatamente após a descongelação completa à temperatura ambiente, transferir os 1 ml conteúdo criotubo para 50 ml de 37 ° C aqueceu-se Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com 2 mM de L-glutamina, 50 ng / mL de M-CSF, 25 ng / mL interleucina-10 (IL-10), e 10% de FBS (meio completo). </li><li> Transferir 25 ml de suspensão de monócitos em cada um de dois frascos de 75 cm 2 de cultura de células de plástico. </li><li> Incubar as culturas numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de CO 2/95% de ar durante 48 horas. </li><li> Lavar o cultures 3 vezes com 10 ml de meio RPMI 1640 (pré-aquecido a 37 ° C), com cuidado de remover o meio de cultura para evitar a retirada quaisquer células fracamente ligados. </li><li> Após lavagem, adicione meio completo fresco, mudando média a cada 2 dias até monócitos diferenciar e proliferar o suficiente para se tornar confluentes. Isso requer cerca de uma semana de cultura. </li></ol> 3. A colheita em macrófagos para iniciar Experimentos <ol><li> Lavar macrófagos diferenciados em balão de 3 vezes com 10 mL de pré-aquecido solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco a 37 ° C, sem Ca 2+ e Mg 2+ antes da adição de 10 ml pré-aquecida de ácido etilenodiaminotetra-tripsina solução a 37 ° C 0,25% (EDTA). </li><li> Colocar o balão numa incubadora de cultura de células para 10 - 15 min, altura em que aproximadamente 90% dos macrófagos deve ter arredondado e individual. Verificar esta através de exame microscópico do balão. </li><li> Adicionar 10 ml de RPMI 1640 contendo FBS a 10% a stripsinização superior. </li><li> Transferir a suspensão de células de macrófagos de balão para um tubo de polipropileno de 50 ml, de centrifugação 300 x g durante 5 min, e desprezar o sobrenadante. </li><li> Suavemente ressuspender os macrófagos em 1 ml de meio completo. </li><li> Misturar 10 ul de suspensão de células de macrófagos com 10 ul de solução de Azul de Tripano e determinar o número de células de macrófagos e viabilidade (normalmente&gt; 95%), utilizando um hemocitómetro. </li><li> Com base na contagem de células (usualmente cerca de 15 - 18 x 10 5 macrófagos), adicionar meio completo adicional para atingir a densidade celular desejada semeadura. Nota: 1 x 10 5 macrófagos em 1,5 ml de meio por poço de uma placa de 12 poços de cultura irá produzir um quase confluentes. </li><li> Após a sementeira, incuba macrófagos durante a noite numa incubadora a 37 ° C de cultura de células com 5% de ar de CO 2/95% para permitir a fixação das células. Em seguida, começa experiências desejados. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Geração de tipos de macrófagos definidas podem esclarecer alguns dos resultados conflitantes obtidos pelos investigadores quando se estuda a biologia dos macrófagos. A utilização de várias condições de cultura e dos factores de diferenciação para geração de macrófagos primários humanos pode conduzir a tipos muito diferentes de macrófagos, um facto que não pode ser apreciado pelo pesquisador. Por exemplo, macrófagos, por vezes, são geradas a partir de monócitos humanos utilizando nenhum soro, soro humano por si só, de so...

O estudo de macrófagos cultivados é um modelo útil para entender a função dessas células na inflamação, como ocorre em placas ateroscleróticas. Quando o foco da pesquisa é em doenças humanas envolvendo macrófagos, é útil estudar macrófagos humanos primários em vez de macrófagos não humanos para evitar diferenças de espécies. Além disso, os efeitos da transformação celular podem ser evitados usando macrófagos primários em vez de linhagens celulares de macrófagos. Para isso, macrófagos diferenciados de monócitos isolados de sangue humano servem como meio de obtenção de macrófagos humanos primários. 
Os macrófagos teciduais podem residir nos tecidos ou podem ser derivados de monócitos que migram para o tecido e se diferenciam em macrófagos 1. Foram definidos dois tipos de macrófagos derivados de monócitos humanos que diferem não apenas na morfologia, mas também na expressão gênica e na função celular 2. Esses dois tipos são obtidos a partir de monócitos que são diferenciados em macrófagos na presença de M-CSF + soro fetal bovino (FBS) e monócitos que são diferenciados em macrófagos na presença de fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) + FBS 2-6. Em nossa experiência (observação não publicada), o uso de soro humano em vez de FBS gera o tipo GM-CSF, independentemente de M-CSF ou GM-CSF estar incluído no meio de diferenciação. Os macrófagos do tipo M-CSF tendem a ser mais alongados do que os macrófagos do tipo GM-CSF, que se assemelham a ovos fritos em sua morfologia. Os investigadores devem reconhecer que os macrófagos derivados de monócitos M-CSF e GM-CSF humanos não são os mesmos que os chamados macrófagos derivados da medula óssea de camundongos M1 e M2 6.
Durante a pesquisa usando macrófagos diferenciados M-CSF derivados de monócitos humanos, tivemos dificuldade relacionada à disponibilidade de monócitos para iniciar experimentos e variação nas densidades celulares obtidas de macrófagos durante a diferenciação de monócitos em macrófagos. Para superar esses problemas, desenvolvemos o seguinte protocolo no qual os monócitos são congelados até serem necessários para uso, e os monócitos são diferenciados em massa em macrófagos que podem ser removidos dos frascos de cultura e plaqueados nas densidades celulares desejadas para obter culturas mais uniformes de experimento para experimento.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de 12 poços Cellbind</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, frasco T-75, cultura de tecidos tratada</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio de cultura</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>aquecido a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS sem Ca2+ e Mg2+&nbsp;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de polipropileno de 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro de luz brilhante aprimorado por Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031 http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX congelamento de células recipiente</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>outros recipientes de congelamento também devem&nbsp; ser adequados para esta etapa</td></tr><tr><td>Sistema de Armazenamento de Nitrogênio Líquido, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>qualquer tanque de nitrogênio líquido deve ser adequado</td></tr></tbody></table>

cultura de macrófagos macrófagos colony estimulante fator diferenciado humano monócitos derivados

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). Para o início dos experimentos, monócitos frescos ou congelados são cultivados em frascos por 1 semana com M-CSF para induzir sua diferenciação em macrófagos. Em seguida, os macrófagos podem ser colhidos e semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos. O uso de números definidos de macrófagos em vez de números definidos de monócitos para iniciar culturas de macrófagos para experimentos produz culturas de macrófagos nas quais a densidade celular desejada pode ser alcançada de forma mais consistente. O uso de monócitos criopreservados reduz a dependência da disponibilidade de doadores e produz culturas de macrófagos mais homogêneas.

A viabilidade de monócitos frescos ou criopreservados foi superior a 95% tal como determinado através da coloração com Trypan Blue 9. A Figura 1 e a Figura 2 comparar com ampliações inferiores e superiores, respectivamente, o progresso da (isto é, congelada) diferenciação de monócitos frescos e criopreservados em macrófagos. Note que o fresco comparado com monócitos criopreservado mostrar uma subpopul...

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

O objetivo geral deste procedimento é melhorar a disponibilidade de monócitos e minimizar a variação nas densidades celulares obtidas durante a diferenciação induzida por MCSF de monócitos sanguíneos humanos em macrófagos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia de macrófagos humanos. A principal vantagem desta abordagem é que culturas de macrófagos derivados de monócitos humanos podem ser facilmente obtidas com menor dependência da disponibilidade de doadores.Além disso, a densidade celular desejada de macrófagos e culturas homogêneas podem ser consistentemente obtidas. Para iniciar este procedimento, obtenha as células mononucleares por leucaférese de doadores humanos e, em seguida, enriqueça os monócitos por elutriação centrifuga contracorrente contínua de células mononucleares. Depois disso, conte as células utilizando um hemocitômetro.Em seguida, centrifugue os monócitos em um tubo de polipropileno de 15 mililitros durante cinco minutos à temperatura ambiente. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em soro bovino fetal seguido por dissulfóxido de dimetila para obter uma concentração final de 90% de soro bovino fetal

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra o priming de monócitos primários em macrófagos. Os monócitos humanos primários podem ser isolados e diferenciados para um fenótipo pró-inflamatório semelhante ao M1 usando o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ou para um fenótipo anti-inflamatório semelhante ao M2 usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).

Cultura in vitro e diferenciação de monócitos primários em macrófagos

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para induzir a diferenciação e polarização de monócitos derivados do sangue periférico em macrófagos M1 ou M2. A incubação com fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, lipopolissacarídeo e interferon-gama produz macrófagos M1 pró-inflamatórios, enquanto a incubação com fator estimulador de colônias de macrófagos e interleucina-4 induz a produção de macrófagos M2 anti-inflamatórios.

Diferenciação e Polarização de Células Derivadas de Monócitos em Células Semelhantes a Macrófagos

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Células da medula óssea cultivadas com fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF) geram uma cultura heterogênea contendo macrófagos e células dendríticas (DCs). Este método destaca o uso da ligação de MHCII e hialuronano (HA) para diferenciar macrófagos das DCs na cultura GM-CSF. Os macrófagos nesta cultura têm muitas semelhanças com os macrófagos alveolares.

Geração e identificação de GM-CSF macrófagos derivados e dendríticas células alveolares do tipo de ratinho de Medula Óssea

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.

Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Aprenda a cultivar macrófagos derivados de monócitos humanos usando M-CSF para biologia imunológica. Este método reduz a dependência de doadores e garante densidades celulares consistentes para pesquisa.

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