Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados
30 de junho de 2016
Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.
O objetivo geral deste procedimento é melhorar a disponibilidade de monócitos e minimizar a variação nas densidades celulares obtidas durante a diferenciação induzida por MCSF de monócitos sanguíneos humanos em macrófagos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a biologia de macrófagos humanos. A principal vantagem desta abordagem é que culturas de macrófagos derivados de monócitos humanos podem ser facilmente obtidas com menor dependência da disponibilidade de doadores.
Além disso, a densidade celular desejada de macrófagos e culturas homogêneas podem ser consistentemente obtidas. Para iniciar este procedimento, obtenha as células mononucleares por leucaférese de doadores humanos e, em seguida, enriqueça os monócitos por elutriação centrifuga contracorrente contínua de células mononucleares. Depois disso, conte as células utilizando um hemocitômetro.
Em seguida, centrifugue os monócitos em um tubo de polipropileno de 15 mililitros durante cinco minutos à temperatura ambiente. Então, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em soro bovino fetal seguido por dissulfóxido de dimetila para obter uma concentração final de 90% de soro bovino fetal, 10% de dissulfóxido de dimetila e 50 vezes 10 à sexta potência de células por mililitro. Posteriormente, adicione um mililitro da suspensão celular a um criotubo individual.
Coloque os criovials em um recipiente para congelação de células e transfira-o para o congelador a menos 80 graus Celsius por 24 horas. Após 24 horas, transfira o recipiente para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Nesta etapa, descongele um criovial de células mantendo-o brevemente em banho-maria a 37 graus Celsius.
Quando a suspensão celular tiver descongelado cerca de 70%, remova-a imediatamente do banho-maria e transfira-a para a temperatura ambiente. Após a suspensão celular ter sido completamente descongelada, transfira um mililitro do conteúdo do criotubo para 50 mililitros de meio RPMI 1640 com L-glutamina 2 milimolar, M-CSF 50 nanogramas por mililitro, IL-10 25 nanogramas por mililitro e 10% de FBS, a 37 graus Celsius. Em seguida, transfira 25 mililitros da suspensão de monócitos para dois frascos plásticos de cultura celular de 75 centímetros quadrados.
Incube as culturas a 37 graus Celsius por 48 horas. Lembre-se de não trocar o meio antes de 48 horas; caso contrário, as células não aderirão bem e serão removidas com a lavagem. Após 48 horas, lave as culturas três vezes com 10 mililitros de meio RPMI 1640 pré-aquecido.
Remova cuidadosamente o meio de cultura para evitar desalojar quaisquer células fracamente aderidas. Em seguida, adicione meio completo e cultive as células por uma semana. Troque o meio a cada dois dias até que os monócitos se diferenciem e proliferem eficientemente, tornando-se confluente.
Agora, lave os macrófagos diferenciados no frasco três vezes com 10 mililitros de DPBS a 37 graus Celsius sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione 10 mililitros de solução de Tripsina 0,25% EDTA a 37 graus Celsius. Depois, coloque o frasco em uma incubadora de cultura celular por 10 a 15 minutos.
Após isso, aproximadamente 90% dos macrófagos devem estar arredondados e destacados. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS para interromper a tripsinização. Se necessário, utilize um espátula para células para remover completamente as células.
Às vezes, neste procedimento, muitos macrófagos permanecem aderidos. Esses macrófagos podem ser removidos após a tripsinização passando um espátula celular sobre a superfície do frasco. Em seguida, transfira a suspensão celular de macrófagos do frasco para um tubo de polipropileno de 15 mililitros.
Centrifugue por cinco minutos à temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda suavemente os macrófagos em um mililitro de meio completo. Com base na contagem celular, adicione meio completo adicional para atingir a densidade celular desejada para semeadura.
Em seguida, plaque os macrófagos em 1,5 mililitros de meio por poço de uma placa de 12 poços. Uma vez 10 à quinta células em 1,5 mililitros de meio por poço geralmente produz um cultivo quase confluente. Após a semeadura, incube os macrófagos durante a noite a 37 graus Celsius para permitir a adesão celular antes de utilizá-los em experimentos.
Esta figura mostra as imagens microscópicas de contraste de fase de monócitos frescos criopreservados durante sua diferenciação induzida por MCSF em macrófagos, com baixa ampliação. As imagens dos monócitos foram obtidas no terceiro e sétimo dia de cultivo em frasco, e no oitavo dia, um dia após sua coleta e replantio na placa de cultivo de 12 poços. Aqui é mostrada a comparação entre monócitos frescos e criopreservados utilizados para produzir macrófagos com alta ampliação.
As vacúolos na fase solta são macropinossomos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criopreservar e posteriormente diferenciar monócitos humanos com MCSF em macrófagos. Posteriormente, os macrófagos podem ser cultivados em densidades celulares desejadas para experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para o cultivo de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados por fator de estímulo de colônias de macrófagos (M-CSF). Ele enfatiza a criopreservação e a diferenciação em massa para aumentar a disponibilidade e a consistência celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Cultura celular
- Biologia de macrófagos
- Imunologia
Contexto
- Os macrófagos derivados de monócitos humanos são cruciais para o estudo das respostas imunes.
- A variabilidade na densidade celular pode afetar os resultados experimentais.
- A leucoaférise é utilizada para obter células mononucleares de doadores.
- A elutriação centrífuga de fluxo contracorrente contínuo enriquece efetivamente monócitos.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a disponibilidade de monócitos para pesquisa.
- Para minimizar a variação nas densidades celulares durante a diferenciação.
- Para facilitar culturas de macrófagos consistentes e homogêneas.
Métodos Utilizados
- Leucoaférese para obter células mononucleares de doadores humanos.
- Elutriação centrífuga de fluxo contracorrente contínuo para enriquecimento de monócitos.
- Contagem celular utilizando um hemocitômetro.
- Diferenciação em massa de monócitos em macrófagos utilizando M-CSF.
Resultados Principais
- Culturas consistentes de macrófagos podem ser obtidas com reduzida dependência do doador.
- Densidades celulares desejadas podem ser alcançadas de forma confiável.
- Este método apoia questões-chave de pesquisa na biologia de macrófagos.
- A disponibilidade melhorada de células aumenta a reprodutibilidade experimental.
Conclusões
- O protocolo fornece um método confiável para o cultivo de macrófagos.
- Ele aborda desafios relacionados à variabilidade entre doadores.
- Essa abordagem pode avançar significativamente a pesquisa na biologia de macrófagos humanos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo aumenta a confiabilidade dos modelos de macrófagos humanos ao reduzir a variabilidade entre doadores e permitir densidades celulares consistentes, o que é essencial para estudos reprodutíveis de imunologia e inflamação na descoberta de fármacos. Ao permitir o uso de monócitos criopreservados, melhora a disponibilidade de reagentes e a consistência entre lotes para validação de alvos e ensaios fenotípicos. O método fortalece a desmistificação pré-clínica ao fornecer um sistema escalonável e definido para estudos mecanicistas da função dos macrófagos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de vias mediadas por macrófagos na modulação imunológica e inflamação.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos utilizando culturas de macrófagos humanos fisiologicamente relevantes.
- Valor Preditivo: Melhora a confiança em estudos de engajamento de alvo e mecanismo de ação por meio da redução de ruído biológico.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera populações homogêneas de macrófagos adequadas para triagem padronizada de compostos.
- Reprodutibilidade: Densidades consistentes de semeadura melhoram a precisão do ensaio e a comparabilidade dos dados entre experimentos.
- Escalabilidade: Monócitos criopreservados permitem a preparação em larga escala de macrófagos para aplicações de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Fornece um sistema relevante para humanos para estudar os papéis dos macrófagos em modelos de doenças infecciosas, autoimunes e oncológicas.
- Continuidade Tradutiva: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica utilizando fontes celulares consistentes e independentes de doadores.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite avaliação confiável de efeitos imunomoduladores e atividades fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do composto inicial, apoiando ensaios baseados em macrófagos que orientam decisões precoces de prosseguir ou não prosseguir.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses na polarização de macrófagos, fagocitose e sinalização de citocinas.
- Triagem: Fornece resultados celulares reprodutíveis para a quantificação do efeito de compostos.
- Análises: Permite leituras quantitativas, como expressão de marcadores e atividade funcional, sob condições controladas.
- Pesquisa Translacional: Apoia a continuidade dos achados in vitro para modelos pré-clínicos por meio de preparação padronizada de macrófagos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de cultura celular reutilizável para programas de imunologia e inflamação em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao minimizar a variabilidade derivada do doador nas respostas dos macrófagos.
- Valor Operacional: Padroniza a produção de macrófagos, melhorando a consistência entre laboratórios e entre experimentos.
- Valor Estratégico: Aumenta a eficiência do capital ao reduzir experimentos falhos devido a modelos celulares inconsistentes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos imunomoduladores com base em dados pré-clínicos confiáveis.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de células primárias, criopreservação e técnicas de cultura celular estéreis.
- Depende do acesso a leucaférese, elutriação centrífuga e equipamentos de congelamento com taxa controlada.
- Necessita padronização dos lotes de M-CSF, IL-10 e soro bovino fetal para manter a consistência da diferenciação.
- A adaptação a outros modelos mieloides pode exigir otimização dos coquetéis de citocinas e da duração da cultura.
- A viabilidade após criopreservação de longo prazo deve ser validada por lote de doador para garantir equivalência funcional.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:50
Isolation and Cryopreservation of Monocytes
1:58
Differentiation of Monocytes into Macrophages
3:31
Harvesting Macrophages to Initiate Experiments
5:30
Results: Comparison of Fresh versus Cryopreserved Monocytes Used to Produce Macrophages
6:12
Conclusion
