Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e medir o enxerto in vivo de células sanguíneas transplantadas para nichos de medula óssea receptora. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização de processos celulares como homing, expansão e localização em diferentes nichos da medula óssea de células hematopoiéticas de doadores após o transplante. Usada em combinação com os modelos animais projetados, essa abordagem pode ajudar na definição de vias moleculares críticas para a regeneração de células hematopoiéticas.

Ao contrário da histologia ou de outras técnicas de imagem, a microscopia intravital permite capturar as interações célula a célula em um animal vivo em nível celular e em tempo real. Decidimos usar este método para determinar se o microambiente da medula óssea foi o local inicial do desenvolvimento da doença mieloproliferativa causada pela perda da sinalização Notch. Os desafios para indivíduos novos nessa técnica incluem minimizar o artefato respiratório, posicionar e estabilizar a cabeça de maneira ideal e evitar a saturação da imagem.

Uma a duas horas antes do transplante, borrife um camundongo EGFP lisado com etanol 70%. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele de cada perna ao redor do tornozelo e uma pinça cirúrgica para remover a pele e o pelo juntos para expor o tecido muscular limpo. Remova o máximo de músculo possível das pernas.

Em seguida, corte os ossos nas articulações do joelho e tornozelo e use esponjas de gaze para remover qualquer tecido muscular restante dos fêmures e tíbias. Enxágue os ossos limpos em uma placa de seis poços contendo DMEM suplementado com 10% de FBS. Em seguida, transfira todos os quatro ossos da perna traseira para 10 mililitros de EDTA frio em PBS em um pilão e esmague os ossos com um pilão.

Triturar as células da medula óssea para obter uma suspensão unicelular e coar a pasta através de um filtro de 70 mícrons em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Enxágue o filtro com dois a três mililitros de PBS. Em seguida, centrifugue as células e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM fresco mais 10% de FBS.

Para a injeção, centrifugue a suspensão celular, conte e ajuste a concentração de células para 1,5 vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro em IMDM sem soro. Coloque as células no gelo. Cinco a seis horas após a segunda dose de radiação, injete três vezes 10 às sextas células da medula óssea na veia da cauda de cada animal receptor irradiado.

Adicione o ponto de tempo apropriado após o transplante. Coloque o mouse receptor anestesiado em uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius e confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé. Aplique pomada nos olhos do animal e administre 100 microlitros do marcador fluorescente apropriado através da veia da cauda.

Em seguida, use uma pequena tesoura elétrica para remover os pelos da superfície dorsal da cabeça do animal, seguida da aplicação de um creme depilatório. Após cinco minutos, remova o creme com esponjas de gaze e enxágue qualquer solução restante com solução salina. Desinfete o couro cabeludo com um cotonete embebido em etanol a 70%.

Em seguida, use pinças finas e tesouras para fazer uma incisão na linha média da pele de 10 a 20 milímetros no couro cabeludo para expor a superfície dorsal do crânio subjacente. Usando seda cirúrgica 5-0, coloque duas suturas de cada lado da incisão, criando uma aba para expor a calvária para imagem. Aplique uma gota de óleo no crânio exposto.

Com o mouse em decúbito dorsal, mergulhe o couro cabeludo exposto em um prato com fundo de vidro cheio de óleo de microscópio. Em seguida, coloque o animal em um estágio de imagem multifotônica com a calvária acima da objetiva e cubra o animal com uma almofada de aquecimento a 37 graus Celsius. É essencial que a cabeça permaneça estabilizada na posição correta durante a aquisição da imagem multifotônica.

Use um dispositivo estereotáxico ou prenda o mouse com fita adesiva, conforme apropriado. Usando um sistema confocal invertido modificado para imagens multifotônicas, ajuste o laser de dois fótons para 830 nanômetros. Em seguida, abra o software de aquisição de imagem apropriado.

No menu de configurações de aquisição, confirme se o modo de varredura direcional está selecionado e defina a velocidade de varredura para quatro microssegundos por pixel, a taxa de quadros para 512 por 512 pixels e o zoom para 1,5. Selecione o watt 20X em uma objetiva de 0,95. Abra a janela da lista de corantes e selecione dois fótons.

Em seguida, selecione o espelho RDM690 na janela do controlador do microscópio. Na janela de caminho e dados de luz, selecione a caixa de dois da unidade de laser para verificar se o obturador de laser de dois fótons está aberto. Selecione EPI Lamp e escolha o cubo de filtro B/G EPI.

Em seguida, focar o objetivo no espécime para visualizar o fluxo vascular no nicho da medula óssea da calvária, usando a bifurcação da veia central e a sutura coronária como pontos de referência. Usando o modo não digitalizado, selecione três detectores externos e obtenha imagens da amostra a uma taxa de varredura de quatro microssegundos por pixel sem média e uma potência de laser constante e ganho do detector para utilizar toda a faixa dinâmica do detector com uma saturação mínima. Depois de coletar uma série de seções através da profundidade do tecido, abra o software de quantificação e visualização de imagem 3 a 4D dedicado apropriado.

Visualize interativamente as pilhas Z usando o algoritmo de renderização 3D apropriado de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, use o módulo de segmentação de objetos spot para segmentar as células GFP e aplicar o processamento aritmético da pilha para eliminar as células GFP falsos positivas nos canais verde e vermelho. Finalmente, use o módulo de segmentação de superfície para reformar a segmentação da vasculatura e da superfície óssea, aplicando algoritmos de distância de tensão X do ponto à superfície para calcular as distâncias das células a qualquer uma das superfícies distais, conforme necessário.

Aqui, as pilhas Z coletadas de cada uma das seis regiões padrão da calvária da medula óssea foram renderizadas como projeção de intensidade máxima 3D, projeção de sombra 3D incluindo o componente ósseo e imagens segmentadas em 3D, permitindo a quantificação das células e a medição de suas distâncias do osso e vasos. Neste experimento, imagens in vivo de células mieloides no microambiente de medula óssea com defeito Notch revelaram que as células GFP lisadas pelo doador têm uma eficiência de homing semelhante no tipo selvagem e receptores knockout 24 horas após o transplante, enquanto exibem enxerto diferente em momentos posteriores. A análise da dinâmica da expansão do progenitor mieloide mostrou que as células transplantadas de medula óssea se expandiram adaptativamente mais rapidamente e em maior número em receptores nocaute duas semanas após o transplante.

As células da medula óssea do doador em receptores do tipo selvagem se expandiram mais tarde, mas em números duas vezes maiores do que as células do doador e receptores knockout em quatro semanas, um momento em que as células do doador na medula óssea knockout diminuem porque está entrando rapidamente em circulação. E que em seis semanas, as diferenças no número de células doadoras na calvária da medula óssea se estabilizam. Além disso, a análise de segmentação 3D da região média inferior da calvária nocaute e do tipo selvagem seis semanas após o transplante de medula óssea indica que as células GFP lisadas localizadas à mesma distância do osso em ambos os tipos de animais receptores, mas, curiosamente, elas residem mais distantes da vasculatura nos camundongos knockout.

Uma vez dominada, a imagem intravital da medula óssea pode ser concluída em uma hora e 30 minutos por camundongo, se realizada corretamente. Ao usar essa abordagem, é importante lembrar de amostrar várias áreas da medula óssea da calvária por camundongo e analisar pelo menos três camundongos por experimento para abordar quaisquer variações intra e interamostrais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar o transplante de medula óssea e a imagem intravital para determinar a cinética do enxerto de uma subpopulação sanguínea específica para o microambiente da medula óssea.