Name: Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a usar microscopia intravital fluorescente com modelos genéticos para estudar a enxertia de células hematopoiéticas em nichos de medula óssea. Esta técnica permite visualizar processos celulares em tempo real.

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Imagem latente foi realizado no centro de Indiana para microscopia biológica na Universidade de Indiana, dirigido pelo Dr. Ken Dunn. O dispositivo estereotáxica é um protótipo projetado e feito por Mark Soonpaa, centro de poços de pesquisa pediátrica. Este trabalho foi financiado pelo NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), a pesquisa do MPN Foundation (NC) e o CTSI Collaborative projeto Importantíssima/Notre Dame (NC).

Todos os procedimentos que envolvem a utilização de animais foram realizados com autorização do cuidado Animal e usar o Comité da Indiana University School of Medicine. Certifique-se para aderir à legislação na experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.
1. preparação dos ratos de destinatário Mx1CreRBPJ- / - 
<ol><li>Cruzar os ratos Mx1-Cre+ com RBPJsalmão/salmão ratos10 para obter Mx1-Crenegativo para positivo RBPJsalmão/salmão ratos12 e Mx1-Cre littermates desalmão/salmão RBPJ para usar como controles. Verifique se o genótipo por PCR10.</li>
	<li>Usar de 6-8 semanas-velho Mx1Cre+/RBPJsalmão/salmão fumado e Mx1Cre ratos desalmão/salmão –/RBPJ para realizar a indução de polyI:C.</li>
	<li>
Injete polyI:C 200 µ g i.p. em Cre+ e Cre– ratos. Dê uma injeção de polyI:C todos os dias durante 3 dias na primeira semana. Dê uma injeção de polyI:C na segunda semana, 7 dias depois da injeção anterior (quatro injeções no total).
	<ol>
<li>Use RBPJKO (induzida Mx1Cre+/RBPJsalmão/salmão) e RBPJWT (induzido por Mx1Cre–/RBPJsalmão/lox) ratos como destinatários 3 semanas após a última injecção de polyI:C. Nota: É recomendável usar ratos induzidos por pI: pC 3 semanas após a injeção. A resposta IFNα desencadeada por polyI:C induz mudanças significativas na BM, resultando na expansão imunofenotípica do HSC e diminuição da saída de progenitores maduros para o sangue periférico16,17. Representação de subconjuntos hematopoiéticos é normalizado a 3 semanas após a injeção e os ratos podem ser utilizados sem os confundimento efeitos da inflamação. Este protocolo de indução foi otimizado para RBPJ. Se a exclusão de um gene diferente, o protocolo de indução pode variar dependendo da construção, e exclusão deve ser validado. Nós validado ~ 100% exclusão da região entre sites loxP por RT-PCR após um total de quatro injeções de polyI:C RBPJ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparação de Lys-EGFP células de medula óssea de doador para transplante
<ol><li>Eutanásia em um rato de Lys-EGFP (dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical) 1 ou 2 h antes do transplante.</li>
	<li>Borrife a superfície do corpo animal com etanol a 70%.</li>
	<li>Use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão na pele em ambas as pernas ao redor do tornozelo e com fórceps cirúrgico afastar pele e pele juntos para expor o tecido muscular limpa.</li>
	<li>Use uma tesoura cirúrgica para remover tanto músculo das pernas quanto possível. Usando uma tesoura, corte os ossos (no joelho e articulação do tornozelo) e limpar qualquer tecido muscular remanescente dos fêmures e tíbias usando esponjas de gaze. Coloque os ossos (dois fêmures e dois tíbias) em uma placa de 6 contendo DMEM 10% FBS.</li>
	<li>Esmaga os ossos em um almofariz com 10ml frio 2mM EDTA PBS e pipetar as células da medula óssea para trazer as células em suspensão de célula única. Alternativamente, limpar os ossos com tempos de 2 mM EDTA PBS 3 de cada lado com uma seringa de 1 mL.</li>
	<li>Filtre as células de medula óssea usando um filtro de 70 µm em um tubo de centrífuga de 15 mL. Lave o filtro com 2-3 mL de PBS. Girar as células para baixo de 10 min a 460 x g, Ressuspender as células em 10 mL de DMEM fresco 10% FBS.</li>
	<li>Contar as células de medula óssea em um hemocytometer e ajustar a concentração de 1,5 x 107 células/mL em IMDM sem soro. Use 3 x 106 células por animal com um volume de 200 µ l. Cerca de 1/3 do total BM são células GFP + mieloides. Embora as células no gelo até que esteja pronto para a injeção. Use 0.5 x 105 células para determinar a expressão de GFP por FACS9.</li>
</ol>3. medula óssea transplante de células de Lys-GFP em ratos RBPJKO
<ol><li>Contenha o destinatários ratos em uma gaiola de torta. A irradiação de ratos com uma dose letal de radiação gama (1.200 Rad) sobre uma difusora de Cs-137. Usar um protocolo de dose dividida: 900 rads à noite seguido por 300 rads (16 h separado) na manhã seguinte.</li>
	<li>Os ratos de destinatário letalmente irradiados RBPJWT e RBPJKO de transplante 5-6 h após a segunda dose de radiação. BM de injetar células colhidas de ratos de Lys-EGFP em uma concentração de 3 x 106 células por animais através de injecção veia cauda (veja mais detalhes para a colheita de células na secção 2).</li>
	<li>Coortes independentes dos ratos transplantados por IVFM nos pontos de tempo diferente da imagem: 24 h e em semanas 2, 4 e 6, conforme descrito abaixo (ver secção 4 & 5 na vivo procedimento de imagem).</li>
</ol>4. cirúrgica preparação para a imagem latente Intravital
<ol><li>Esterilize instrumentos cirúrgicos. Dois belos fórceps (um direto, um ângulo), um par de tesouras bem e um par de suportes de agulha. Prepare a área operacional com todos os suprimentos necessários para o procedimento.</li>
	<li>Dê o mouse uma injeção de IP de coquetel anestésico cetamina (xilazina 2,5-5 mg/kg + acepromazina 1.0-2.5 mg/kg + cetamina 90-100 mg/kg) usando uma seringa de agulha de 26-28 G.  Animal será monitorizada cada 15 minutos durante o procedimento e anestesia será complementada conforme necessário em ¼ da dose da original.</li>
	<li>Coloque o mouse sobre uma fonte de calor adequada (almofada de aquecimento de 37 ° C, animal protegido do contato direto com a almofada de aquecimento) e monitorar visualmente a taxa respiratória.</li>
	<li>Verifica reflexos usando o dedo beliscar a resposta. Certifique-se de que o animal está sob anestesia antes de iniciar qualquer procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Uso um 26-28 gauge agulha seringa para dar ratos uma injeção de veia da cauda de um marcador fluorescente de vascular (dextrano, 100 μL de solução 20 mg/mL).</li>
	<li>Aplica pomada de vet para ambos os olhos. Grampeie a superfície dorsal da cabeça do animal com tosquiadeiras elétricas pequenas. Aplica uma creme para esponjas de gaze de uso de 5 min. remover o creme e em seguida enxaguar com solução salina de depilação. Prepare o couro cabeludo limpo com álcool 70%, usando um cotonete.</li>
	<li>Use pinça fina e tesoura para fazer uma pequena incisão de pele (10-20 mm) no couro cabeludo para expor a superfície dorsal do crânio subjacente. Use seda cirúrgica 5-0 para colocar duas suturas de estadia na pele de cada lado da incisão, criando uma aba para expor a calvária para a imagem latente.</li>
	<li>Posicionar os ratos em suas costas e couro cabeludo exposto em um prato fundo de vidro enchido com o óleo do microscópio, mergulhe. Transporte o animal para o mutiphoton sala de imagem.</li>
	<li>Coloque o animal no palco microscópio com a calvária posicionada sobre o prato de vidro acima do objectivo e, em seguida, cubra com um 37almofada de aquecimento ° C (animal deve ser protegido do contato direto com o calor).</li>
</ol>5. in Vivo imagens de alta resolução da calvária de rato
<ol><li>Usar um sistema confocal invertido modificado para a imagem latente do multiphoton (ver tabelade materiais ). Seguir indicações do fabricante sintonizar um 2-fóton laser de 830 nm, lugar a 20 W X, at 0.95 lente objetiva no pedaço de nariz de microscópio e verificar o alinhamento do feixe de laser. Nota: Microscópio vertical sistemas são mais comumente utilizados para estes estudos, mas também pode ser utilizado um sistema do multiphoton invertido. Neste estudo, utilizou-se um dispositivo estereotáxica atraumática projetada personalizada. Embora haja vários dispositivos estereotáxicos comercialmente disponíveis para sistemas de microscópio vertical, não há nenhum dispositivo disponível comercialmente estereotáxica para um sistema de microscópio invertido que visavam garantir o crânio do mouse. Como alternativa a um dispositivo personalizado estereotáxica, o crânio pode ser fixado na posição acima o objetivo utilizando vários métodos de fita ou cola para a estabilidade.</li>
	<li>Abra um software de aquisição de imagem. Nas configurações de"aquisição" painel Verifique se um modo de digitalização direcional é selecionado. Configurar a velocidade de varredura de 4 μs/pixel, taxa de quadros para 512 x 512 pixels e zoom para 1,5. Selecione 20 objetivo X W at 0,95 de lista de disponíveis lentes objetivas para coincidir com a lente posicionada no inalador nasal.</li>
	<li>Acessar a lista de"tintura" no painel de "Controle de aquisição de imagem" e selecione "Dois fótons". Abra a janela "Caminho da luz & corantes" e selecione DM690-980 excitação DM. Open o obturador de laser 2P, marcando a caixa de verificação na unidade Laser 2. Na janela "Controlador de microscópio", selecione RDM690 espelho.</li>
	<li>Selecione "Lâmpada de EPI", escolha o cubo do epi-filtro B/G e focar o objetivo para o espécime para visualizar fluxo vascular e o nicho de medula óssea de calvária, usando como referência a bifurcação da veia central (a) e a sutura coronária (b) (Figura 2A).</li>
	<li>
Recolha imagens usando o modo de não-descanned. Selecione três detectores externos: PGTO detector1 para coletar o sinal SHG de colágeno (filtro de emissão - 430/100 nm), GaAsP detector2 para coletar sinal GFP (filtro de emissão - 525/50) e GaAsP detector3 para coletar o sinal do TRITC-dextran (filtro de emissão - 605/90 nm).
	<ol>
<li>Realize imagens a uma taxa de varredura de 4μs/pixel com nenhuma média para minimizar a fototoxicidade. Recolha imagens em um ganho de potência e detector laser constante ajustada para utilizar a gama dinâmica plena do detector com saturação mínima.</li>
		<li>Recolha série de secções através da profundidade do tecido (60 x 1 μm Z-pilhas) de 6 regiões da medula óssea de calvária. Use as configurações de tamanho de passo de 1 μm, zoom 1.5 e 512 x 512 pixels tamanho do quadro (423 µm x 423 µm). Nota: Total, tempo total necessário para a imagem de um rato é 1-1,5 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. análise quantitativa
<ol><li>Executar as reconstruções de quantificação e 3D de imagem usando um software de visualização e quantificação de dedicado imagem 3D/4D conforme as instruções do fabricante (ver Tabela de materiais). Visualize interativamente Z-pilhas em 3D utilizando a projeção de intensidade máxima (MIP), alfa-mistura ou algoritmos de processamento de volume de projeção sombra.</li>
	<li>Segmento de células GFP usando o "módulo de segmentação local objeto". Aplica processamento aritmético de pilha (subtração de canal) para eliminar falsa positiva contagem de células GFP (isso elimina o sinal das células ósseas exibindo forte fluorescência nos canais verdes e vermelhos).</li>
	<li>Execute a segmentação da vasculatura e osso superfície usando o módulo de superfície de segmentação. Se necessário, calcule distâncias de células para qualquer das superfícies acima aplicando algoritmos X-tensão, chamados "distância do ponto à superfície".</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um delineamento experimental otimizado para estudar a cinética da enxertia de células hematopoiéticas por microscopia Intravital fluorescente. Neste estudo, a expansão de células progenitoras mieloides em um BM WT ou em um entalhe sinalização defeituoso BM foi controlada a calvária óssea por células mieloides positivas seguintes de Lys-GFP após TMO em destinatários RBPJWT ou RBPJKO. Esta abordagem é proposta como um modelo que pode ser aplicado para responder a perguntas semelhantes, por exemplo: ...

Microscopia de fluorescência do multiphoton intravital (IVFM) é uma poderosa técnica de imagem que permite para o de alta resolução, em tempo real de imagens de tecidos com profundidade de até 1mm, dependendo do tecido. Quando aplicado a calvária de rato, permite observar o comportamento das células hematopoiéticas dentro da BM de forma não-invasiva acima de 60-100 μm11. Esta abordagem é usada aqui para determinar a cinética de enxertia de progenitores mieloides normais nos ratos nocaute BM de RBPJ falta canônica de sinalização Notch.
Trabalho recente do nosso grupo demonstrou que defeituoso sinalização de entalhe canônico na BM microambiente conduzem a uma doença mieloproliferativa, como12. Perda de sinalização Notch foi obtida pela exclusão condicional do domínio de ligação do DNA de RBPJ, o fator de transcrição crítica a jusante de entalhe canônico, sinalização, usar Mx1-Cre induzida por recombinação10. Neste estudo, utilizou-se o modelo de ratos desalmão/salmão Mx1-Cre/RBPJ. Exclusão condicional do motivo do DNA-ligando de RBPJ resulta na perda de sinalização de todos os receptores Notch. No modelo de Mx1-Cre, Cre expressão é conduzido pelo promotor Mx1 ativado após administração de polyI:C resultando na indução de supressão do gene alvo em células do sangue, bem como em componentes estromais de múltiplos órgãos, incluindo a BM, o baço e o fígado.
Mx1-Cre+/RBPJsalmão/salmão fumado e Mx1-Cre–/RBPJsalmão/salmão ratos induzida com polyI:C (aqui indicado como RBPJKO e RBPJWT, respectivamente) foram letalmente irradiados e transplantado com células hematopoiéticas normais, de tipo selvagem. A partir da semana 4 após transplante, destinatários RBPJKO desenvolveram leucocitose significativa, seguido por esplenomegalia. Apesar de ratos RBPJKO apresentaram aumento percentual de progenitores mieloides no BM na semana 8 após transplante e nos pontos de tempo mais tarde, análise do BM em semanas 4 e 6 não revelou diferenças marcantes em seu conteúdo de células mieloides em relação ao controle RBPJWT destinatários. Esta observação, juntamente com o fato de que a Mx1-Cre é expresso em diferentes órgãos hematopoiéticos, levantou a questão se o microambiente BM teve impacto direto sobre a iniciação do fenótipo mieloproliferativa.
Para determinar se a BM foi um crítico site inicial do desenvolvimento da doença, IVFM da calvária de rato foi usado em combinação com BM transplante (BMT), o modelo de mata-mata RBPJ e uma sistema de rastreamento de linhagem. Ratos transgênicos expressando EGFP sob o controle do promotor (Lys-GFP) lisozima específica9 foram usados para obter células de doador que podem ser visualizadas durante a BM de imagem após TMO. Expressão de lisozima é específico para células mieloides e Lys-GFP marca células do progenitor mieloide comum (CMP) para os granulócitos maduros13.
IVFM do BM em pontos diferentes do tempo demonstrou que células de Lys-GFP homed da mesma forma para os destinatários BM de RBPJWT e RBPJKO, mas expandido e incorporada mais rápido em destinatários BM de RBPJKO. Esta diferença foi dramática no ponto anterior de tempo (semana 2) e diminuiu ao longo do tempo (semanas 4 e 6). No entanto, estes pontos de tempo mais tarde, avaliação do compartimento hematopoiética do receptor, mesmo mostrou um aumento constante no número de células mieloides circulantes em PB e localizadas no baço de ratos RBPJKO, indicando um aumento da produção de células partir do BM na circulação. Análise de Lys-GFP células localização na BM de ratos transplantados com 6 semanas revelou que células mieloides residiam mais longe da vasculatura no microambiente RBPJKO do que no controle.
Coletivamente, a combinação de IVFM com estes modelos animais específicos fornecidos introspecções na dinâmica das células mieloides no microambiente BM RBPJKO enxertia. O delineamento experimental e abordagem quantitativa descrita aqui é proposto como um paradigma que pode ser aplicado para resolver questões semelhantes. Por exemplo, o uso de outra linhagem de células específicas rastreamento modelos, tais como RAG1-GFP14 ou15 ratos Gata1-GFP pode permitir seguindo o comportamento linfoide ou eritroide progenitores, respectivamente, no BM.

<table><tbody><tr><td>Coquetel de cetamina</td><td>IU School of Medicine</td><td></td><td>Cetamina 90-100 mg / kg, xilazina 2,5-5,0 mg / kg, Acepromazina 1,0-2,5 mg / kg</td></tr><tr><td>TRITC dextrano</td><td>Tdb Consultoria</td><td>TD150-100mg</td><td>Outra cor dextrana pode ser usada.</td></tr><tr><td>Aparador de cabelo Andis</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Esponja de gaze</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4 camadas, 2 x 2</td></tr><tr><td>Creme depilatório Nair</td><td>Loja</td><td></td><td></td>comercial</tr><tr><td>Saline</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0,9% Cloreto de sódio frasco poli</td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>Fórceps Fino</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>fórceps reto, fórceps angular</td></tr><tr><td>Tesoura</td> Ferramentas de <td>Ciência Fina</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulha</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura de seda</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Outra sutura não absorvível pode ser usada</td></tr><tr><td>WillCo- prato de fundo de vidro</td><td>WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de microscópio óptico</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserção de platina estereotáxica&nbsp;</td><td>IU School of Medicine</td><td>Design</td><td></td></tr><tr><td>personalizado Olympus FV1000 sistema de microscópio confocal&nbsp;</td><td>Objetivo Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pequena almofada de aquecimento</td><td>Loja</td><td></td> comercial <td>Zoo Med réptil almofada de</td></tr><tr><td>aquecimento Imaris 8.1 software de imagem</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3/4 D Software de visualização e análise de imagem</td></tr></tbody></table>

combinando a microscopia intravital fluorescente (ivfm) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Aumentando a evidência indica que hematopoiese normal é regulada por distintas pistas microenvironmental na BM, que incluem especializados nichos celulares modulando funções de células-tronco hematopoiéticas crítico (HSC)1,2. De fato, uma imagem mais detalhada do microambiente hematopoiético está a emergir, no qual o endosteal e nichos endoteliais formam unidades funcionais para a regulação da HSC normal e sua progênie3,4,5 . Novos estudos têm revelado a importância das células perivasculares, adipócitos e células neuronais para manutenção e regulamenta HSC função6,7,8. Além disso, há evidências de que células de linhagens diferentes, ou seja, células mieloides e linfoides, lar e residam em nichos específicos dentro do microambiente BM. No entanto, um mapeamento completo do microambiente BM e seus ocupantes ainda está em andamento.
Cepas de rato transgênicas expressando marcadores fluorescentes específicos de linhagem ou camundongos geneticamente modificados para falta de moléculas selecionadas em células específicas do nicho BM estão agora disponíveis. Mata-mata e linhagem rastreamento modelos, em combinação com abordagens de transplante, proporcionam a oportunidade de aperfeiçoar o conhecimento sobre o papel dos específicos "nicho" de células para populações hematopoiéticas definidas como HSC, células B, células T, células mieloides e eritroide de células. Esta estratégia pode ser ainda mais potencializada, mesclando-se o uso da microscopia de dois fotões da calvária. Fornecendo imagens de alta resolução na vivo e renderização 3D da calvária BM, agora podemos determinar precisamente o local onde subconjuntos específicos hematopoiéticos para casa em BM e avaliar a cinética de sua expansão ao longo do tempo. Aqui, Lys-GFP ratos transgénicos (marcação de células mieloides)9 e RBPJ mata-mata ratos (falta de sinalização de entalhe canônico)10 são usados em combinação com IVFM para determinar a enxertia das células mieloides de um microambiente BM defeituoso de entalhe.

Coortes de 2 RBPJKO e 2 RBPJWT de destinatários foram fotografadas em uma sessão individual de imagens em pontos diferentes do tempo: 24h e 2, 4 e 6 semanas após o transplante de células de BM Lys-GFP (fluxo de trabalho é ilustrado na figura 1A).
Em cada rato, imagens foram adquiridas de 6 regiões padrão da calvária BM, identificado por sua posição em relação a bifurcação da veia central (Figura 2A</stro...

Microscopia de fluorescência intravital (IVFM) da calvária é aplicada em combinação com modelos de animais geneticamente para estudar o homing e enxertia das células hematopoiéticas em nichos de medula óssea (BM).

Combinando a microscopia Intravital fluorescente (IVFM) com modelos genéticos para estudar a dinâmica de enxertia das células hematopoiéticas para nichos de medula óssea

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar e medir o enxerto in vivo de células sanguíneas transplantadas para nichos de medula óssea receptora. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a visualização de processos celulares como homing, expansão e localização em diferentes nichos da medula óssea de células hematopoiéticas de doadores após o transplante. Usada em combinação com os modelos animais projetados, essa abordagem pode ajudar na definição de vias moleculares críticas para a regeneração de células hematopoiéticas.Ao contrário da histologia ou de outras técnicas de imagem, a microscopia intravital permite capturar as interações célula a célula em um animal vivo em nível celular e em tempo real. Decidimos usar este método para determinar se o microambiente da medula óssea foi o local inicial do desenvolvimento da doença mieloproliferativa causada pela perda da sinalização Notch. Os desafios para indivíduos novos nessa técnica incluem minimizar o artefato respiratório, posicionar e estabilizar a cabeça de maneira ideal e evitar a saturação da imagem.Uma a duas horas antes do transplante, borrife um camundongo EGFP lisado com etanol 70%. Em seguida, use uma tes

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

O protocolo descreve um novo modelo de câmara de janela de fêmur murino que pode ser usado para rastrear o movimento de células na medula óssea femoral in vivo. A microscopia de fluorescência multifotônica intravital é usada para obter imagens de três componentes da medula óssea femoral (vasculatura, matriz de colágeno e neutrófilos) ao longo do tempo.

Modelo Câmara fêmur Janela para<em&gt; In Vivo</em&gt; Acompanhamento de celular na Murino de Medula Óssea

É apresentado um método para criar e imagem viva diferentes meninos de medula óssea humanizados em camundongos. Com base no nicho de suporte criado por células mesenquimais humanas, a adição de células endoteliais humanas induz a formação de vasos humanos, enquanto que a adição de rhBMP-2 induz a formação de tecido ósseo maduro quimérico humano-rato.

Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

Este protocolo descreve a injeção intrafemoral de algumas células-tronco hematopoiéticas ou leucêmicas, incluindo células editadas por genes, em modelos de xenoenxerto murino, o que permitirá não apenas o transplante rápido e seguro de células, mas também análises seriadas da medula óssea.

Injeções intrafemorais simplificadas usando camundongos vivos permitem análise contínua da medula óssea

As injeções intrafemorais permitem o enxerto de um pequeno número de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), colocando as células diretamente na cavidade da medula óssea. Aqui descrevemos um protocolo experimental de injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes.

Injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas humanas e progenitoras em camundongos imunocomprometidos 

A microscopia intravital permite o estudo de processos biológicos dinâmicos, como regeneração tecidual e desenvolvimento tumoral. A medula óssea da calvária, um tecido altamente dinâmico, oferece informações sobre hematopoiese e função vascular. O uso de um implante de fixação de cabeça impresso em 3D biocompatível permite imagens longitudinais repetitivas, aprimorando nossa compreensão da dinâmica do tecido e do microambiente tumoral.

Imagem longitudinal intravital da dinâmica vascular na medula óssea da calvária

Aprenda a usar microscopia intravital fluorescente com modelos genéticos para estudar a enxertia de células hematopoiéticas em nichos de medula óssea. Esta técnica permite visualizar processos celulares em tempo real.

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