A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

O objetivo geral desta metodologia é medir a captação de glicose e seu transportador em diferentes subpopulações de monócitos. Este método pode ser utilizado para responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como Qual é a importância do metabolismo das células imunes nos desfechos das doenças? As principais vantagens dessas técnicas são sua rapidez, facilidade de execução, ausência de necessidade de material reagente e exigência de apenas um pequeno volume de sangue.

Em até uma hora após a coleta das amostras de sangue em tubos anticoagulantes com citrato ACD-B, coloque as amostras em uma cabine de segurança biológica. Em seguida, adicione 100 microlitros de sangue de cada amostra em tubos individuais de polipropileno e trate as células com dois mililitros de solução de lise 1X no gelo, pipetando suavemente para homogeneizar. Após 15 minutos, centrifugue as células e realize mais duas centrifugações em tampão de lavagem.

Após a segunda lavagem, utilize uma pipeta para remover cuidadosamente o máximo possível dos sobrenadantes e re-suspender os pellets em 100 microlitros de tampão de lavagem em gelo. Para identificar as subpopulações específicas de monócitos, marque as células com cinco microlitros dos anticorpos apropriados por 100 microlitros de células, durante 30 minutos em gelo e no escuro. Ao final da incubação, lave as amostras duas vezes em solução de lavagem e fixe as células com 200 microlitros de formaldeído 0,5% em PBS.

Em seguida, analise as células dentro de 24 horas em um citômetro de fluxo capaz de detectar quatro cores. Para avaliar a captação de glicose pelas subpopulações de monócitos, transfira 90 microlitros de sangue de cada amostra para tubos individuais de polipropileno e adicione 10 microlitros do análogo fluorescente de glicose de interesse ao sangue. Agite suavemente os tubos para misturar e cubra as amostras com papel alumínio.

Em seguida, coloque as células a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos, seguido pela sua transferência imediata para gelo. A seguir, adicione quatro mililitros de solução lisante FACS aos tubos e centrifugue as células. Depois, realize uma segunda centrifugação em tampão de lavagem.

Decante o sobrenadante e marque as células com os anticorpos apropriados de interesse por 30 minutos a quatro graus Celsius, no escuro. Em seguida, lave as amostras com quatro mililitros de tampão de lavagem gelado, re-suspenda os pellets em 200 a 300 microlitros de PBS gelado e analise os tubos dentro de 10 minutos. Para a análise por citometria de fluxo, utilize primeiro as amostras-controle não marcadas e marcadas individualmente para ajustar a compensação.

Em seguida, no software apropriado de análise de célula única, abra a primeira amostra em um gráfico de dispersão direta por dispersão lateral e selecione os monócitos conforme ilustrado. Depois, clique duas vezes na população de monócitos selecionada e delimite a população negativa para CD3. Agora, clique duas vezes na população negativa para CD3 e configure o eixo x para exibir a marcação de CD14 e o eixo y para exibir a marcação de CD16.

Em seguida, para medir a captação de glicose ou do seu transportador em uma subpopulação específica de monócitos, gere os histogramas apropriados. Depois, quando houver populações celulares definidas, utilize as amostras controle de IgG FITC para definir o gate e determinar a porcentagem total de monócitos positivos para CD14 em cada amostra. Aqui, é mostrada a estratégia inicial de gating para isolamento dos monócitos com base no espalhamento celular e exclusão de linfócitos T mediante seleção dentro da população negativa para CD3.

Os monócitos são então selecionados pela expressão de CD14 isoladamente, ou em combinação com CD16, para identificar os monócitos totais ou subpopulações de monócitos. Podem ser observadas populações distintas de monócitos positivos para o transportador de glicose Glut-1 e positivos para CD14, mais notadamente nos leucócitos circulantes obtidos de indivíduos positivos para HIV. Células positivas para CD14 e para Glut-1 também podem ser observadas dentro de subconjuntos específicos de monócitos em indivíduos não infectados pelo HIV, embora essas populações sejam mais acentuadas em pacientes positivos para HIV.

Conforme esperado pelos dados de expressão do transportador de glicose, o análogo de glicose 2-NBDG também é absorvido em maiores quantidades por células de indivíduos positivos para HIV. Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em uma hora e meia se realizada corretamente. Ao realizar este procedimento, é importante limitar a exposição à luz em todas as regiões.

Após a captação de análogos de glicose, as células podem ser coradas com anticorpos de superfície celular para identificar populações imunes específicas nas quais você está interessado. Após seu desenvolvimento, este método pode ser utilizado para determinar como o HIV afeta o metabolismo das células imunes, podendo também ser explorado por outros pesquisadores em diferentes áreas, como imunologia, virologia e pesquisa em câncer. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar o transportador de glicose um e a captação de glicose em células imunes.

Não se esqueça de que, ao trabalhar com agentes infecciosos, devem ser empregados procedimentos padrão de segurança.