A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

O objetivo geral desta metodologia é medir a captação de glicose e seu transportador em diferentes subpopulações de monócitos. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no campo da imunologia, como Qual é a importância do metabolismo das células imunes nos resultados da doença? As principais vantagens dessas técnicas são que são rápidas, fáceis de executar, não requerem material reativo e requerem apenas um pequeno volume de sangue.

Dentro de uma hora após a coleta das amostras de sangue, em tubos anticoagulantes ACD-B de citrato, coloque as amostras em uma cabine de segurança biológica. Em seguida, adicione 100 microlitros de sangue de cada amostra em tubos individuais de polipropileno e trate as células com dois mililitros de solução de lise 1X no gelo, pipetando suavemente para misturar. Após 15 minutos, centrifugue as células e siga com mais duas centrifugações no tampão de lavagem.

Após a segunda lavagem, use uma pipeta para remover cuidadosamente o máximo possível dos sobrenadantes e ressuspenda os pellets em 100 microlitros de tampão de lavagem no gelo. Para identificar as subpopulações específicas de monócitos, core as células com cinco microlitros dos anticorpos apropriados por 100 microlitros de células, por 30 minutos no gelo no escuro. Ao final da incubação, lave as amostras duas vezes em solução de lavagem e fixe as células com 200 microlitros de formaldeído a 0,5% em PBS.

Em seguida, analise as células em 24 horas em um citômetro de fluxo capaz de detectar quatro cores. Para avaliar a captação de glicose das subpopulações de monócitos, transfira 90 microlitros de sangue de cada amostra para tubos individuais de polipropileno e adicione 10 microlitros do análogo fluorescente de glicose de interesse ao sangue. Agite os tubos suavemente para misturar e cubra as amostras com papel alumínio.

Em seguida, coloque as células a 37 graus Celsius por 15 a 30 minutos, seguido de sua transferência imediata para o gelo. Em seguida, adicione quatro mililitros de solução de lise FACS aos tubos e centrifugue as células. Em seguida, execute uma segunda centrifugação em tampão de lavagem.

Transvase o sobrenadante e core as células com os anticorpos apropriados de interesse por 30 minutos a quatro graus Celsius no escuro. Em seguida, lave as amostras em quatro mililitros de tampão de lavagem gelada, ressuspenda os pellets em 200 a 300 microlitros de PBS gelado e analise os tubos em 10 minutos. Para a análise por citometria de fluxo, utilizar primeiro as amostras de controlo não coradas e coradas individualmente para definir a compensação.

Em seguida, no software de análise de célula única apropriado, abra a primeira amostra em um gráfico de dispersão para frente a lado e bloqueie os monócitos conforme ilustrado. Em seguida, clique duas vezes na população de monócitos fechados e bloqueie a população CD3-negativa. Agora clique duas vezes na população CD3-negativa e defina o eixo x para exibir a coloração CD14 e o eixo y para exibir a coloração CD16.

Em seguida, para medir a captação de glicose ou seu transportador em uma subpopulação específica de monócitos, gere os histogramas apropriados. Em seguida, onde existem populações de células definidas, use as amostras de controle FITC igG para definir o portão e determinar a porcentagem total de monócitos CD14-positivos em cada amostra. Aqui, a estratégia inicial de gating para isolar os monócitos por dispersão celular e exclusão de células T por gating dentro da população CD3-negativa é mostrada.

Os monócitos são então bloqueados para expressão de CD14 sozinhos ou em combinação com CD16 para identificar o total de monócitos ou subpopulações de monócitos. Populações distintas de monócitos positivos para o transportador de glicose Glut-1 CD14 positivo podem ser observadas, principalmente nos glóbulos brancos circulantes obtidos de indivíduos HIV-positivos. Células positivas para Glut-1 CD14 também podem ser observadas em subconjuntos específicos de monócitos em indivíduos não infectados pelo HIV, embora essas populações sejam mais pronunciadas em pacientes HIV-positivos.

Como esperado a partir dos dados de expressão do transportador de glicose, o análogo da glicose 2-NBDG também é absorvido em maiores quantidades por células de indivíduos HIV-positivos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em uma hora e meia, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante limitar a exposição à luz a todas as regiões.

Após a captação de análogos de glicose, as células podem ser coradas com anticorpos de superfície celular para identificar populações imunes específicas nas quais você está interessado. Após seu desenvolvimento, esse método pode ser usado para determinar como o HIV afeta o metabolismo das células imunológicas, também pode ser explorado por outros pesquisadores, em diferentes campos, como imunologia, virologia e pesquisa do câncer. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como detectar o transportador de glicose um e a captação de glicose nas células imunológicas.

Não se esqueça de que, ao trabalhar com agentes infecciosos, procedimentos de segurança padrão devem ser empregados.