Name: Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda ensaios de transcrição in vitro para estudar regulação transcricional e avaliar agentes antibacterianos. Este método permite visualizar produtos de transcrição em gel de sequenciamento de RNA.

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Este trabalho reconhece uma bolsa de início de carreira do corpo docente da Universidade de Newcastle (CM).

Cuidado: As experiências envolvem o uso do isótopo radioactivo 32 P e nenhum trabalho deve ser realizado até que tenham sido cumpridas todas as condições de segurança adequadas. Geralmente são necessárias de pessoal para participar de um curso de segurança e submetidos a prática supervisionada antes experimentos utilizando reagentes radioativos. Por favor, usar equipamento de proteção individual (dosímetro termoluminescente, óculos de segurança, luvas, sala de radiação jalecos, calças de comprimento total, fechou-toe sapatos) ao realizar a reação. 1. Preparação de Materiais de Ensaio <ol><li> Obter a proteínas necessárias para o ensaio de transcrição. <ol><li> Para o experimento descrito aqui, produzir mais e purificar E. coli RNAP em laboratório, conforme descrito 11, ou obter a partir de uma fonte comercial (Lista de Materiais). Nota: Ambos fornecem resultados semelhantes. Outros métodos para purificação de RNAP nativo ou de afinidade marcado pode também ser usado 12,13. / factores nusa Sigma pode ser obtido sob a forma described em trabalhos anteriores 14,15. </li></ol></li><li> Água Preparação de dietil pirocarbonato (DEPC) tratados Nota: Como alternativa, água RNase-livre pode ser obtida a partir de fontes comerciais (lista de materiais). <ol><li> Adicionar 1 ml de pirocarbonato de dietilo (DEPC) a 1 L de água purificada (0,1% v / v) e misturar durante a noite. </li><li> água DEPC autoclave e dicas duas vezes. </li></ol></li><li> Template Preparação DNA <ol><li> Purifica-se o plasmídeo pSG1154 16 e / ou 17 pIA226 utilizando um kit de purificação de plasmídeo (Lista de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Para amplificar o molde para ensaios de transcrição run-off (um fragmento de 360 pb que abrange a região do promotor xil a P), montar uma reacção de PCR em gelo incluindo 25 ul mistura 2x PCR (Lista de Materiais), 2 ul de cada um dos iniciadores (5? M) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(directo) e 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (inverso), 1 ul de plasmídeo pr pSG1154eparation (250 uM) e 20 ul de água purificada). <ol><li> Ou, em alternativa, para os ensaios individuais transcrição redondas, amplificar um fragmento de 447 pb abrangendo a região R promotor λ P de pIA226 17. Defina-se uma reacção de PCR em gelo utilizando 25 ul de mistura de PCR 2x, 2 ul de cada um dos iniciadores (5 uM): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(directo) e 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (inverso), 1 ul pIA226 17 preparação de plasmídeo (250 uM) e 20 ul de água purificada). Nota: Este modelo carece de citosina até que a posição nt 26, que é o dia 26 nucleótidos a partir do sítio do início da transcrição. Por isso, a transcrição utilizando este molde irá permitir a iniciação, a liberação de promotor e parando no nt 26 de modo a formar um complexo estável alongamento transcrição (CE) quando apenas ATP, UTP e GTP estão presentes na reacção. </li></ol></li><li> Defina-se uma reacção de PCR com as seguintes condições: 95 °; C durante 30 seg, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, repetindo-se durante 30 ciclos. </li><li> Purifica-se o produto utilizando um kit de PCR clean-up (Lista de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante e elui-se em 100 ul de tampão de transcrição para o ensaio de transcrição. </li><li> Determinar a concentração de DNA modelo usando um fluorospectrometer (Lista de Materiais). </li></ol></li><li> NTP Preparação Nota: os NTP pode ser obtido de diferentes fontes comerciais (lista de materiais). <ol><li> Dissolve-se os NTP (≥99% de pureza) em água tratada com DEPC para fazer um estoque H, alíquota de 1 ml da solução em tubos de 1,5 ml (50 ul em cada tubo) e armazenar a -20 ° C. </li><li> Pedido α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) antes da experiência. 32 P tem uma meia-vida curta de 14,29 dias. Nota: O uso de UTP marcados com alfa evita comparação da intensidade das bandas com comprimento diferente. </li></ol></li><li> Preparação de ARN Escada <ol><li> Monte o following de reacção à temperatura ambiente: 0,5 ug de ARN mistura Molde (Lista de Materiais), 80 mM de HEPES tampão a pH 7,5, MgCl 2 12 mM, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM / CTP / GTP, UTP 0,5 mM, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 mL T7 RNAP (Lista de Materiais), DEPC-água tratada a 20 l. </li><li> Permitir a reacção prosseguir a 37 ° C durante 1 h. Utilizar imediatamente ou armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de RNA Gel Sequencial <ol><li> Preparação gel <ol><li> Limpar as placas de um aparelho de gel de sequenciação (Lista de Materiais) duas vezes com etanol a 70% e água purificada, e montar a célula com um pente e dois espaçadores. Nota: Uma placa pode ser revestida com reagente de siliconização (Lista de Materiais) para facilitar a remoção de gel no passo 4.2. </li><li> Dissolve-se 33,6 g de ureia em 22 ml de água e 16,4 ml de / borato / EDTA (TBE) de tampão (54 g de tris (hidroximetil) aminometano 5x Tris; 27,5 g de ácido bórico, 10 ml de ácido etilenodiaminotetra-acético 1 M (EDTA), pH 7,4, em 1 L de água) utilizando um agitador magnético. </li><li> Adicionar 16 ml de solução a 40% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) à solução de ureia e filtrar através de um filtro de 0,45 um. </li><li> Adicionar 514 ul de 10% (w / v) recém-preparada de persulfato de amónio em água seguido por 51,4 ​​uL de N, N, N &#39;, N&#39; tetrametiletilenodiamina (TEMED) à solução filtrada. </li><li> Inverta suavemente a solução de gel para evitar a aeração excessiva e injectar imediatamente e sem problemas para dentro da célula seqüenciamento pré-embalados colocada na horizontal a partir do furo de injecção inferior. Tome cuidado para evitar fazer bolhas durante a injeção. </li><li> Permitir 1-1,5 horas até que o gel é completamente definido antes da sua utilização num ensaio de transcrição. O gel pode ser armazenada à temperatura ambiente durante dois ou três dias, quando envolvido com tecido molhado em água na parte superior da célula de sequenciação. </li></ol></li></ol> Reação 3. Transcrição <ol><li> Transcrição Alongamento Pausa Assay <ol><li> A formação de um complexo de transcrição alongamento <ol><li> Adicionar 1 ml de enzima núcleo RNAP (1? M de ações em tampão de transcrição) para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de factor de Sigma-purificada 70 (σ 70; 3 uM em tampão da transcrição) para o RNAP e incubar em gelo durante 10 min para formar RNAP holoenzima. </li><li> Adiciona-se 3 ul de 500 nM ADN molde purificado (λ promotor P R a partir do produto de PCR pIA226) em tampão de transcrição para a holoenzima RNAP e incubar a 37 ° C durante 5 minutos para formar o complexo aberto. </li><li> Prepara-se uma mistura de componentes de reacção na outra tubo de 1,5 ml utilizando 5 ul de tampão de transcrição 10x (Lista de Materiais: 400 mM de Tris-HCl, 1,6 M de KCl, MgCl2 100, 10 mM de DTT, 50% de glicerol, pH 7,9 em tratada com DEPC água), 2 ul de 250 uM cada de GTP e UTP, 1 ul de ATP 1 mM e 1 uL de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Adicionar DEPC água tratada a 41 mL. NãoTE: inibidor de RNase (Lista de Materiais) pode ser utilizada para minimizar a contaminação com RNase. </li><li> Transferir a solução de mistura para o tubo contendo o complexo aberto e incubar a 37 ° C durante 15 minutos para formar o complexo de transcrição alongamento parou em 26 nt. </li><li> Mover a reacção até à temperatura ambiente (~ 21 ° C) e adicionar 1 ul de 2,5 mg / ml de rifampicina a uma concentração final de 50 ug / ml. </li><li> Adicionar 1 ml de 0.1 mM purificados NusA à mistura reaccional e incuba-se durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 ul de 250 uM de CTP na mistura de reacção para fazer um volume final de 50 ul e medir o tempo de reacção, utilizando um temporizador. </li><li> Transferência de 5 ul da solução de reacção em 2 ul de tampão de gel de ARN de carga (formamida a 95%, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% xileno cianol) a 30, 60, 120, 240, 480, 1200 e seg para extinguir a reacção. </li><li> Descarte as pontas 32 ​​P UTP e tubos em um cont resíduos radioactivosainer. </li></ol></li></ol></li><li> Transcrição Iniciação Assay <ol><li> Formação do complexo aberto <ol><li> Diluir purificada σ 70-0,5 uM. </li><li> Repita os passos 3.1.1.1 a 3.1.1.3 utilizando 0,5 mM (em vez de 3 M) purificada σ 70, e do modelo de DNA (região promotora xil o P de produto pSG1154 PCR). </li></ol></li><li> Ensaio de inibição da iniciação da transcrição <ol><li> Adicionar o inibidor concebido para evitar a formação de RNAP holoenzima a enzima RNAP núcleo antes da adição de σ 70 (depois do passo 3.1.1.1), seguido por passos de 3.1.1.2 e 3.1.1.3 examinar se o inibidor é capaz de interromper a formação holoenzima. </li><li> Alternativamente, após a etapa 3.1.1.2, adicione o inibidor para examinar se é capaz de inibir competitivamente σ 70 ligação a RNAP. </li><li> Usar a mesma quantidade de DMSO, o solvente do inibidor, em vez de o inibidor staque nas reacções de controlo. </li></ol></li><li> A conclusão da reacção <ol><li> Dissolve-se heparina em água até uma concentração de estoque de 1 mg / ml e estoque a -20 ° C. Nota: A heparina é um concorrente do DNA que podem sequestrar RNAP que não formou um complexo aberto. Uma vez que o complexo aberto é formado, a heparina não pode entrar no local da ligação do DNA de RNAP e inibir a transcrição a partir do complexo aberto pré-formado. Portanto, a heparina só é necessária para os ensaios rodada único; ele não é necessário para os ensaios multi-redondas. </li><li> Preparar a mistura de reacção utilizando 5 ul de tampão de transcrição 10x (Lista de Materiais), 1 ul de uma solução de heparina mg / ml, 1 ul de 10 mM de cada de ATP, GTP, CTP e UTP 2,5 mM, e 1 ul de 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). Adicionar DEPC água tratada a 45 mL. </li><li> Misturar a mistura de reacção com o complexo de transcrição aberta, rotação do pulso e incubar a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Transferir 10 uL da reacção assimlução em 5 ul de tampão de gel de ARN de carga (formamida a 95%, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% xileno cianol) para extinguir a reacção. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. duração e Desenvolvimento RNA Gel <ol><li> Executando o gel de poliacrilamida de desnaturação <ol><li> Submeter o gel a 50 ° C e 50 W, em tampão 1 x TBE durante aproximadamente 1,5 horas até que a temperatura do gel e o tampão é estável a 50 ° C. </li><li> Amostras de calor a 90 ºC durante 30 segundos e movê-los em gelo carregamento antecipado no gel. </li><li> amostras de carga nas cavidades sobre o topo do gel ao lado de uma faixa contendo 2 ul escada de ARN (diluição 1: 100). </li><li> Submeter o gel a 50 W e 50 ºC em tampão 1x TBE até que o corante azul de bromofenol atinge ~ 2/3 para baixo do gel. </li></ol></li><li> Tratamento gel <ol><li> Abrir lentamente e cuidadosamente separar a placa superior da célula de sequenciação. Tome muito cuidado para evitar a quebra do gel. </li><li> chromatograp CutHY papel (Lista de Materiais) para coincidir com o tamanho do gel a partir do topo para o corante azul de bromofenol. Utilizar um contador Geiger para confirmar a posição aproximada dos transcritos de RNA marcados radioactivamente. </li><li> cobrir cuidadosamente o gel com o papel de filtro, e pressione com firmeza até que o gel adere ao papel de filtro. Cortar e descartar o fundo do gel de resíduos radioactivos como os PNT não incorporados correr para o fundo do gel, que pode ser muito quente. </li><li> Coloque um pedaço de tamanho semelhante de papel de filtro sobre a cama de secagem de uma máquina de vácuo de secagem, e colocar cuidadosamente o papel revestido de gel para ele com o lado gel para cima. </li><li> Cobrir o gel com uma película de plástico e seco a 60 ° C durante 1,5 h. </li><li> Envolver o outro lado do papel de filtro de gel revestido com película de plástico, e colocar em uma placa de fósforo fotoestimuláveis ​​no caso de imagem, com o tempo de exposição apropriado, que pode variar de 1 hora a durante a noite, dependendo da eficiência da reacção. </li><li> Imagem da placa de fósforo usandoum scanner gerador de imagens de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a intensidade da banda relativa usando software ImageJ de acordo com o manual do software. </li><li> Use um contador Geiger para verificar a contaminação radioactiva na área de trabalho, limpe os itens suspeitos e área com tecido e um agente de limpeza e descarte o lenço no recipiente de descarte. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Information+processing+by+RNA+polymerase%3A+recognition+of+regulatory+signals+during+RNA+chain+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation.</a> J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).</li>
<li>Burgess, R. R., Anthony, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+sigma+docks+to+RNA+polymerase+and+what+sigma+does%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does.</a> Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).</li>
<li>Gusarov, I., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intrinsic+transcription+termination+by+N+and+NusA%3A+the+basic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms.</a> Cell. 107 (4), 437-449 (2001).</li>
<li>Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NusA+N-terminal+domain+is+necessary+and+sufficient+for+enhancement+of+transcriptional+pausing+via+interaction+with+the+RNA+exit+channel+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase.</a> J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).</li>
<li>Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+RNA+polymerase+and+the+elongation+factor+NusA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA.</a> RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).</li>
<li>Artsimovitch, I., Henkin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+to+analysis+of+transcription+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches to analysis of transcription termination.</a> Methods. 47 (1), 37-43 (2009).</li>
<li>Decker, K. B., Hinton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+at+the+core%3A+Similarities+among+bacterial%2C+archaeal%2C+and+eukaryotic+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases.</a> Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).</li>
<li>Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+easy+to+stop+RNA+polymerase%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Is it easy to stop RNA polymerase?</a> Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).</li>
<li>Murakami, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+bacterial+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Structural biology of bacterial RNA polymerase.</a> Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+as+a+target+for+antibacterial+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).</li>
<li>Yang, X., Ma, C., Lewis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vector+system+that+allows+simple+generation+of+mutant+Escherichia+coli+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase.</a> Plasmid. 75, 37-41 (2014).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+large+scale+purification+of+Escherichia+coli+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase.</a> J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).</li>
<li>Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-overexpression+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+subunits+allows+isolation+and+analysis+of+mutant+enzymes+lacking+lineage-specific+sequence+insertions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).</li>
<li>Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transcription+inhibitor+of+RNA+polymerase+holoenzyme+formation+by+structure-based+drug+design%3A+From+in+silico+screening+to+validation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation.</a> ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).</li>
<li>Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase-induced+remodelling+of+NusA+produces+a+pause+enhancement+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex.</a> Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).</li>
<li>Lewis, P. J., Marston, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+vectors+for+controlled+expression+and+dual+labelling+of+protein+fusions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis.</a> Gene. 227 (1), 101-110 (1999).</li>
<li>Artsimovitch, I., Landick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pausing+by+bacterial+RNA+polymerase+is+mediated+by+mechanistically+distinct+classes+of+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).</li>
<li>Vassylyev, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+bacterial+RNA+polymerase+holoenzyme+at+2.6+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution.</a> Nature. 417, 712-719 (2002).</li>
<li>Artsimovitch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+transcription+regulation+by+alarmone+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp.</a> Cell. 117 (3), 299-310 (2004).</li>
<li>Bordier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rifampicin-resistant+RNA+synthesis+by+rifampicin-RNA+polymerase+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes.</a> FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).</li>
<li>Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+assay+to+measure+the+real-time+kinetics+of+nucleotide+incorporation+during+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation.</a> J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Em todos os organismos, a transcrição é um processo fortemente regulado. Os ensaios in vitro de transcrição têm sido desenvolvidos para proporcionar uma plataforma para testar os efeitos de factores de transcrição, moléculas pequenas e inibidores da transcrição. Neste trabalho método, foi descrito um ensaio para a transcrição bacteriana geral. ensaios de transcrição combinados com eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos são muito importantes para estudos sobre os mecanismos que permitem a ...

A transcrição é o processo em que o ARN é sintetizado a partir de um molde de ADN específica. Em células eucariotas, existem três RNAPs distintas: eu RNAP transcreve precursores de rRNA, RNAP II é responsável pela síntese de ARNm e de certos RNAs nucleares pequenos, e a síntese de rRNA 5S e tRNA é realizada por RNAP III. Em bactérias, existe apenas uma RNAP responsável pela transcrição de todas as classes de ARN. Existem três fases de transcrição: iniciação, alongamento e terminação. A transcrição é um dos processos mais altamente reguladas na célula. Cada etapa do ciclo de transcrição representa um ponto de verificação para a regulação da expressão do gene 1. Para a iniciação, RNAP tem de se associar com um factor sigma para formar holoenzima, o que é necessário para dirigir a enzima para locais específicos chamados promotores de 2 para formar um complexo promotor aberta. Posteriormente, um grande conjunto de fatores de transcrição são responsáveis ​​pela regulação oatividades f RNAP durante as fases de alongamento e terminação. O fator de transcrição aqui examinado é a proteína altamente conservada e essencial, Nusa. Ele está envolvido na regulação da transcrição e a pausa de terminação, bem como anti-terminação durante a síntese de rRNA 3-5. Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos como poderosas ferramentas para estudar os passos de regulação complexos durante a transcrição 6. Em geral, um fragmento linear de ADN incluindo uma região promotora é necessária como molde para a transcrição. O molde de ADN é normalmente gerado por PCR ou por linearização um plasmídeo. proteínas e os NTP (incluindo uma NTP marcado radioactivamente para fins de detecção) purificados são então adicionados e produto analisado a seguir ao período de incubação necessário. Usando modelos apropriados e condições de reacção, todas as etapas de transcrição foram examinadas utilizando esta abordagem, o que permitiu a caracterização molecular detalhada da transcription ao longo do último meio século 7. Em combinação com a informação sobre a estrutura 3-dimensional da RNAP Também foi possível investigar o mecanismo molecular da inibição da transcrição pelos antibióticos e conduz a antibióticos, e utilizar essa informação para o desenvolvimento de novas e melhores drogas 8-10. Neste trabalho fornecem exemplos de como ensaios de transcrição pode ser usada para determinar o mecanismo de regulação da transcrição por alongamento / factor de terminação NusA, e a forma como o mecanismo de acção de um inibidor da ligação de iniciação da transcrição podem ser determinados novos.

<table><tbody><tr><td>Obter as proteínas necessárias para o ensaio</td><td></td><td></td><td></td> de transcrição</tr><tr><td>E. coli RNAP</td><td>Epicentro</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr>Preparação de dietilpirocarbonato de água <td></td><td></td><td></td><td>tratada com</td></tr><tr><td>DEPC (DEPC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Água sem RNase&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template template template</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wizard&nbsp; Sistema de Purificação de DNA Plus&nbsp;SV Minipreps</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td>PCR</tr><tr><td>Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluoroespectrômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>rNTPs de alta pureza</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-32P UTP&nbsp;</td><td>PerkinElmer&nbsp; &nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td> Preparação de escada de RNA <td>composto radioativo</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&ndash; 1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel de preparação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT célula de sequenciamento de ácido nucleico&nbsp;</td><td>Bio-Rad&nbsp; &nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>ureia&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hidroximetil)aminometano&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>154563</tr><tr><td>ácido bórico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrilamida/bis-acrilamida&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td>Persulfato de amônio <td>A9926</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr>Ensaio <td></td><td></td><td></td><td>de Transcrição</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicina&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Formamida R3501</td><td></td></tr><tr><td> &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xileno cianol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de Ribonuclease RNasin</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Transcrição&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de potássio Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de magnésio Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>TDT&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td><td></td>de filtro</tr><tr><td>Whatman&nbsp; 3MM Chr Cromatografia Papel</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Descontaminante</td><td></td><td></td><td></td>radioativo</tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Tratamento</td><td></td><td></td><td></td>em gel</tr><tr><td>Typhoon Trio + imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

transcrição in vitro ensaios e sua aplicação em drug discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos e amplamente utilizados durante muitos anos para estudar os mecanismos moleculares envolvidos na transcrição. Este processo requer múltiplas subunidades de polimerase de ADN dependente de ARN (RNAP) e uma série de factores de transcrição que actuam para modular a actividade de RNAP durante a expressão do gene. eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos radiomarcados é usado para fornecer informações mecanicista detalhadas sobre como rendimentos de transcrição e quais parâmetros podem afetá-lo. Neste artigo descrevemos o protocolo para estudar como o factor de alongamento essencial NusA regula a pausa de transcrição, bem como um método para identificar um agente antibacteriano alvo de iniciação de transcrição através da inibição da formação holoenzyme RNAP. Estes métodos podem ser usados ​​como uma plataforma para o desenvolvimento de abordagens adicionais para explorar o mecanismo de acção dos factores de transcrição que ainda permanecem incertos, bem como novos agen antibacterianats alvo de transcrição que é um alvo da droga subutilizados em pesquisa e desenvolvimento de antibióticos.

eficiência da transcrição pode ser determinada pela medição do nível de radiação nas bandas a diferentes pontos de tempo. O ensaio parando para testar a função do fator NusA visualização da pausa, terminação habilitada, e produtos (Figura 1A) run-off. Na presença do domínio N-terminal de NusA (NTD NusA; resíduos de aminoácidos 1-137), a aparência dos produtos de ARN foi significativamente retardado em comparação com a experiência de controlo sem NusA. A deleção de resídu...

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para examinar funcionalmente a transcrição e a atividade inibitória de agentes antibacterianos direcionados à transcrição bacteriana.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

O objetivo geral deste ensaio de transcrição in vitro é estudar as etapas regulatórias complexas durante a transcrição, fornecendo uma plataforma para testar os efeitos de fatores de transcrição, moléculas pequenas e inibidores de transcrição. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em biologia molecular, como os mecanismos precisos associados à regulação da transcrição, a função de fatores de transcrição com mecanismos desconhecidos e os efeitos de inibidores normais de transcrição. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a visualização direta de todos os produtos de transcrição ao longo de uma linha do tempo a partir de um único gel de sequenciamento de RNA.Inicie este procedimento limpando as placas de um aparelho de eletroforese para sequenciamento duas vezes com etanol 70% e água purificada. Monte a câmara com uma pente e dois espaçadores. Dissolva 33,6 gramas de uréia em 22 mililitros de água e 16,4 mililitros de tampão TBE 5 vezes usando um agitador magnético.Adicione 16 mililitros de uma solução de acrilamida 40% à solução de ureia e filtre por um filtro de 0,45 micrômetro. Adicione à solução filtrada 514 microlitros de uma solução recém-prep

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

O gálio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e seu análogo freebase apresentam baixa citotoxicidade celular micromolar. Este manuscrito descreve uma reacção de transcrição de ARN, ARN de imagem com um gel corado com brometo de etídio, e quantificar RNA com espectroscopia de UV-Vis, a fim de avaliar a inibição da transcrição por corroles e demonstra um método simples de avaliar as propriedades anti-cancro candidatas.

Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio Enzimático para Medir Inibição da transcrição pelo gálio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Aqui, o monitoramento em tempo real do metabolismo das células tumorais, combinado com um modelo de metástase de membrana corio-alantóide (CAM) de embrião de galinha in vivo, é usado para avaliar novos alvos/agentes anticancerígenos quanto à sua capacidade de sensibilizar células tumorais a quimioterápicos prejudiciais ao DNA.

Avaliar a eficácia do Cancer Drogas Sensibilização<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

A resistência aos medicamentos para a terapêutica visados ​​é generalizada e à necessidade de identificar mecanismos de resistência - antes ou após o início clínico - é fundamental para orientar estratégias de gestão de clínicas alternativas. Aqui, apresentamos um protocolo para casal derivação de linhas resistentes a drogas in vitro com sequenciamento para agilizar a descoberta desses mecanismos.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Neste trabalho, fornecemos um fluxo de trabalho experimental de como os intensificadores ativos podem ser identificados e validados experimentalmente.

Previsão e Validação de elementos reguladores de genes ativada durante ácido retinóico induzida estaminais embrionárias Diferenciação Celular

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Nós apresentamos um protocolo para estudar o Regulamento da tradução de mRNA em pilhas poxvirus-contaminadas usando in vitro o ensaio do repórter da luciferase do RNA-baseado transcrito. O ensaio pode ser usado para estudar a regulação da tradução por cis-elementos de um mRNA, incluindo 5 '-região não traduzida (UTR) e 3 '-UTR. Diferentes modos de iniciação de tradução também podem ser examinados usando este método.

Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Aqui, apresentamos um protocolo para a seleção in vitro de repressores transcricionais projetados (ETRs) com alta, longa duração, estável, eficiência de silenciamento no alvo e baixa atividade fora do alvo em todo o genoma. Esse fluxo de trabalho permite reduzir um repertório inicial e complexo de ETRs candidatos a uma lista curta, adequada para avaliação adicional em cenários terapeuticamente relevantes.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de culturas de células ex vivo ou in vitro para pré-processamento de dados transcriptômicos para triagem de drogas baseada em transcriptoma custo-efetivo.

Triagem Transcriptomic-Based Drug Screening Custo-Eficiente

Aprenda ensaios de transcrição in vitro para estudar regulação transcricional e avaliar agentes antibacterianos. Este método permite visualizar produtos de transcrição em gel de sequenciamento de RNA.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

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