Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

O objetivo geral deste ensaio é medir a fagocitose de granulócitos e monócitos e a atividade de explosão oxidativa no sangue total. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia, como como uma determinada intervenção dietética afeta a resposta imune ao exercício. A principal vantagem desta técnica é que é um ensaio simples e direto que pode ser facilmente modificado para levar em conta os recursos laboratoriais disponíveis e os interesses de pesquisa.

Temos usado essa medida da função imunológica inata nas últimas duas décadas em muitos de nossos testes de exercícios, e compartilharemos alguns desses dados mais adiante no vídeo. Antes de iniciar o procedimento, use um analisador de hematologia para realizar um hemograma completo com análise diferencial de glóbulos brancos nas amostras de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Anote a contagem de glóbulos brancos em células por mililitro e os valores percentuais de neutrófilos e monócitos para as amostras.

Em seguida, para cada tubo experimental e de controle, use uma ponta de pipeta de comprimento estendido para transferir 100 microlitros de cada amostra de sangue total do tubo de coleta de sangue de heparina de lítio para o fundo de um tubo de 12 por 75 milímetros devidamente rotulado. Quando todo o sangue tiver sido transferido, adicione 10 microlitros da solução de trabalho HE aos tubos marcados com tinta vermelha e um H, incluindo o tubo de controle HE. Tampe os tubos.

Faça um vórtice breve das amostras e transfira os tubos para um banho-maria de 37 graus Celsius em uma prateleira de metal aberta com agitação suave a cada cinco minutos. Após 15 minutos, transfira rapidamente o rack e os tubos para um banho de água gelada por 12 minutos, agitando suavemente a cada cinco minutos. No final da incubação, adicione o volume apropriado de solução de trabalho de S.aureus não rotulada aos tubos rotulados com a tinta vermelha e um H, incluindo o tubo de controle HE.

Vortex os tubos brevemente com as tampas. Em seguida, adicione o volume apropriado de solução de trabalho S.aureus marcada com FITC aos tubos rotulados com tinta preta e um F, incluindo o tubo de controle FITC, e faça um breve vórtice das amostras. Em seguida, incube todos os tubos no banho-maria de 37 graus Celsius por 20 minutos, agitando a cada cinco minutos, seguido de um resfriamento de um minuto na água gelada.

Depois de colocar as amostras em temperatura ambiente, use uma pipeta repetidora para adicionar 100 microlitros de solução de têmpera gelada a todos os tubos e vórtice as amostras. Retorne as amostras para o banho de gelo. Após um minuto, use a pipeta repetidora para adicionar um milímetro de PBS gelado a cada um dos tubos.

Em seguida, vórtice os tubos e adicione mais dois mililitros de PBS às amostras. Agora centrifugue as células e aspire o sobrenadante. Usando a pipeta repetidora, adicione 50 microlitros de FBS gelado aos tubos.

Após o vórtice, transfira todos os tubos para um carrossel. Use uma estação de trabalho automatizada de preparação de lise celular para lisar os glóbulos vermelhos e fixar os glóbulos brancos de acordo com as instruções do fabricante. Para analisar os resultados do ensaio por citometria de fluxo, abra o software de aquisição do sistema de citometria de fluxo e crie um novo protocolo.

Escolha FITC para o parâmetro FL1 para o ensaio de fagocitose e HE para o parâmetro FL2 para o ensaio de atividade de explosão oxidativa. Crie um gráfico de pontos de dispersão para frente versus lateral, um histograma FL1 e um histograma FL2. Em seguida, crie regiões poligonais para as populações de glóbulos brancos, granulócitos e monócitos no gráfico de dispersão direta versus lateral e crie regiões lineares nos histogramas.

Agora execute a amostra de controle negativo somente de sangue seguida pelas amostras de controle positivo HE e FITC, revisando os histogramas e ajustando as tensões do tubo fotomultiplicador dos canais FITC e PE conforme necessário. Em seguida, inicie a aquisição de dados para as amostras de controle. Após um período de equilíbrio de 15 minutos, carregue as amostras experimentais no carrossel de acordo com a ordem na lista de trabalho e sendo a análise da amostra do estudo.

Para avaliar a atividade fagocítica das amostras, primeiro consolide todas as amostras marcadas com F e os arquivos de dados do modo de lista de controle em uma única pasta e arraste os arquivos para o espaço amostral no software de análise de citometria de fluxo. Clique duas vezes em uma amostra de controle e use o seletor de porta de polígono para definir uma porta para a população total de glóbulos brancos, tomando cuidado para incluir todas as células nas bordas do gráfico. Rotule esta porta WBC.

Clique duas vezes na porta WBC e use o seletor de porta elíptica para definir a porta de linfócitos. Rotule a porta de acordo e arraste a porcentagem de dados da porta para o lado para que as células sejam facilmente visualizadas. Em seguida, use o seletor de porta de polígono para definir a porta de granulócitos e a porta de monócitos.

Rotule cada porta de acordo e arraste a porcentagem de dados da porta para o lado. Clique duas vezes na amostra de controle FITC seguida pela porta do granulócito e use os menus suspensos para definir o eixo X para FL1 e o eixo Y para dispersão lateral, ou SS. Use o seletor de porta quadrada para definir uma porta negativa de fagocitose e uma porta positiva de fagocitose. Destaque a porta positiva para fagocitose da população de granulócitos.

Em seguida, clique em Área de trabalho e em Adicionar estatística. Realce Média geométrica e FL1 para gerar a intensidade de fluorescência dos granulócitos positivos para fagocitose e clique em Adicionar. Em seguida, escolha a frequência da estatística pai e clique em Adicionar para gerar a porcentagem de granulócitos que são positivos para fagocitose.

Para aplicar essas configurações a todas as amostras de estudo, realce todas as portas e estatísticas criadas na amostra de controle FITC e arraste-as para a área Todas as amostras no painel de grupo. Salve o trabalho como um arquivo WSP na mesma pasta que contém a pasta de dados do modo de lista. Agora clique na primeira amostra experimental no conjunto de dados e confirme se a porta dos glóbulos brancos se encaixa adequadamente na distribuição celular em cada uma das amostras, ajustando as bordas da porta conforme necessário.

Agora clique na porta dos glóbulos brancos na primeira amostra experimental e confirme se as portas de granulócitos, monócitos e linfócitos se encaixam na distribuição celular em cada uma das amostras, ajustando as portas conforme necessário. Depois de salvar o arquivo, clique no ícone do editor de tabelas e arraste cada estatística de interesse para a tabela. Clique em Criar tabela para exibir os dados em um formato de planilha e salvar o trabalho como um arquivo XLSX.

Em seguida, repita a análise para as amostras de atividade de explosão oxidativa marcadas com H e arquivos de dados do modo de lista de controle, conforme demonstrado. Conforme demonstrado neste experimento representativo, a fagocitose mediada por granulócitos de S. aureus é aumentada imediatamente e 1,5 horas após uma sessão de ciclismo de 75 quilômetros, voltando ao normal na manhã seguinte. A atividade de explosão oxidativa de granulócitos diminui por pelo menos 21 horas após esse nível de atividade.

Além disso, há uma correlação modesta entre a fagocitose de granulócitos e os níveis séricos de proteína C reativa, conforme observado nesta análise de 106 mulheres com sobrepeso ou obesas, indicando que a fagocitose alta de granulócitos e monócitos em indivíduos em repouso pode ser indicativa de inflamação sistêmica. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída para aproximadamente 30 amostras em sete horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de resfriar completamente as amostras antes de adicionar as bactérias para ajudar a minimizar qualquer variabilidade inexplicável entre as amostras.

Após este procedimento, outros métodos, como a quantificação de citocinas, podem ser realizados para determinar o efeito de sua intervenção na resposta inflamatória. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem os efeitos de uma variedade de mudanças no estilo de vida e na função imunológica inata em humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a fagocitose de granulócitos e monócitos e a atividade de explosão oxidativa com um citômetro de fluxo.

Não se esqueça de que trabalhar com sangue humano pode ser extremamente perigoso e que devem ser sempre tomadas precauções, como usar o EPI adequado, ao realizar este procedimento.