Name: Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a medir fagocitose e atividade de burst oxidativo em granulócitos e monócitos do sangue humano. Este método simples e adaptável auxilia pesquisadores em imunologia e fisiologia do exercício há mais de duas décadas.

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Os autores gostariam de reconhecer Zack Shue, Casey John e Lynn Cialdella-Kam para a sua assistência durante a otimização deste processo.

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este manuscrito fornece um protocolo passo-a-passo para a determinação dos dois indicadores de granulócitos e monócitos. Foram identificadas algumas etapas que são críticos para o sucesso deste ensaio. Um tal passo é a incubação em banho de gelo que ocorre imediatamente antes da adição de bactérias. arrefecimento exaustiva de todas as amostras irá minimizar o efeito da temperatura sobre a actividade de fagocitose e OB. Um outro passo crucial é a adição de bactérias para cada amostra. A 8: 1 bactérias: relação fagócitos ...

A explosão de granulócitos e monócitos fagocitose / oxidativo (OB) ensaio da atividade é uma técnica simples e direta que é frequentemente usado para reunir informações sobre a função imunológica inata após o exercício prolongado e intenso. 1-4 Ao estudar a resposta do sistema imunológico a um estímulo, granulócitos e monócitos são de particular interesse porque eles desempenham um papel central na defesa do hospedeiro e são as primeiras células do sistema imunológico a se acumular no local de infecção. 5 neutrófilos, um tipo de granulócitos, são as primeiras células de se translocar para o músculo danificado tecidos após o exercício intenso. 6 fagocitose ea atividade de OB são as medidas mais comuns da função de granulócitos e monócitos, 7 e são preferidos como indicadores da função celular imune inato por causa de seu papel central, tanto no processo de infecção e o processo de reparação. O ensaio descrito no presente Utili manuscritozes um citómetro de fluxo de base para proporcionar uma determinação quantitativa da fagocitose de granulócitos e monócitos e atividade de OB no sangue total. O uso de sangue inteiro nesta técnica é vantajosa porque permite o ensaio a ser conduzido sem um procedimento de purificação que consomem tempo. Este ensaio pode ser facilmente modificado para acomodar uma variedade de modelos de investigação e de capacidades de laboratório. Por exemplo, Liao et al., Utilizou uma técnica semelhante para demonstrar que a actividade dos neutrófilos OB é aumentada e neutrófilos fagocitose é diminuída após lesão cerebral traumática. 8 Num outro exemplo, McFarlin et al. Descrevem uma modificação elegante desta técnica que utiliza aloficocianina (APC ) -conjugated CD66b e de alto desempenho conjunto rotulagem CD45 APC conjugada com a citometria de fluxo baseada em imagem para classificar os granulócitos em termos de suas atividades fagocitose e OB. 7,9 Nosso grupo de pesquisa tem usado várias adaptações desta technique como um indicador da função imune inata em populações com sobrepeso, obesas, e atléticas por quase 20 anos. 10,11 O texto abaixo irá fornecer o leitor com instruções passo-a-passo para a realização deste ensaio e destacar as áreas que o leitor possa se ​​adaptar para atender às necessidades de suas pesquisas.

<table><tbody><tr><td>12 tubos de 75 mm, com tampa</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>Vai precisar de 2 tubos por amostra ("H" e "F") mais 3 tubos por lote (para controlos de ensaio; "F", "H" e "Apenas sangue").</td></tr><tr><td>PBS (10x), pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Topo de garrafa 0.2 &micro; m (capacidade de 500 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glicose, pó</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico (anidro, testado para cultura de células, testado para cultura de células vegetais)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio tribásico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetídio (Hidroetidina) (HE)</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO) Anidro</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Cepa de madeira sem proteína A) BioPartículas, conjugado de fluoresceína (FITC)</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus&nbsp;( Estirpe de madeira sem proteína A) BioParticles, não rotulado</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4,0 ml vacutainer contendo 7,2 mg K2EDTA,</td><td>VWR</td> seco <td>por pulverização BD367861</td><td>Vai precisar de 1 tubo de colheita de sangue K2EDTA por amostra.</td></tr><tr><td>Vacutainer de 4,0 ml contendo 68 unidades USP de heparina de lítio,</td><td>BD367884</td><td>VWR</td> revestido por spray <td>Irá precisar de 1 tubo de colheita de sangue de heparina de lítio por amostra.</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>i.e., analisador de hematologia</td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Enxágue</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; Calibrador de Cal T 5diff</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&middot; T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff Diluente</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l ponteiras de pipeta de comprimento estendido</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de gelo isolado</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>Para banho-maria gelada.</td></tr><tr><td>Suporte para tubos metálicos abertos</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine</td><td>Serum Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep Workstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>i.e., estação de trabalho automatizada de preparação de lise celular</td></tr><tr><td>Sistema de reagentes ImmunoPrep</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>i.e., sistema de reagentes de lise de hemácias/WBC</td></tr><tr><td>Sistema de Citometria de Fluxo Cytomics FC500 MCL com Software</td><td>CXP Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow Bainha de Fluido</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Fluorospheres de Verificação de Fluxo&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>i.e., fluoroesferas de verificação de alinhamento e fluidos</td></tr><tr><td>Software</td><td>FlowJo FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>i.e., software de análise de citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Software Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td><>i.e., programa de planilha eletrônica</td></tr></tbody></table>

medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo atividade burst no sangue

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

O ensaio de fagocitose de granulócitos e monócitos e atividade de explosão oxidativa (OB) pode ser usado para estudar o sistema imune inato. Este manuscrito fornece a metodologia necessária para adicionar este ensaio a um arsenal de imunologia do exercício. O primeiro passo neste ensaio é preparar duas alíquotas ("H" e "F") de sangue total (heparina). Em seguida, o diidroetídio é adicionado à alíquota H e ambas as alíquotas são incubadas em um banho de água morna seguido por um banho de água fria. Em seguida, Staphylococcus aureus (S. aureus) é adicionado à alíquota H e S. aureus marcado com isotiocianato de fluoresceína é adicionado à alíquota F (bactéria: fagócito = 8: 1), e ambas as alíquotas são incubadas em banho-maria morna seguido de banho-maria frio. Em seguida, o azul de tripano é adicionado a cada alíquota para extinguir a fluorescência extracelular e as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato. Em seguida, os glóbulos vermelhos são lisados e os glóbulos brancos são fixados. Finalmente, um citômetro de fluxo e um software de análise apropriado são usados para medir a fagocitose de granulócitos e monócitos e a atividade do OB. Este ensaio tem sido usado há mais de 20 anos. Após esforço pesado e prolongado, os atletas experimentam um aumento significativo, mas transitório, na fagocitose e uma diminuição prolongada na atividade do OB. O aumento da fagocitose pós-exercício está correlacionado com a inflamação. Em contraste com indivíduos com peso normal, a fagocitose de granulócitos e monócitos é cronicamente elevada em participantes com sobrepeso e obesidade e está modestamente correlacionada com a proteína C reativa. Em resumo, este ensaio baseado em citometria de fluxo mede a fagocitose e a atividade OB dos fagócitos e pode ser usado como uma medida adicional da inflamação induzida por exercício e obesidade.

o exercício prolongado e intenso tem profundos efeitos sobre a função imunológica inata, incluindo a função natural killer células, resposta mediada por citocinas por macrófagos à infecção viral, e de granulócitos e fagocitose de monócitos e actividade OB. Vários estudos indicam que granulócitos e monócitos fagocitose aumenta significativamente pós-exercício, refletindo a inflamação induzida por lesão muscular e demandas metabólicas. Em contraste, a actividade de granulócitos e monócitos...

O objetivo deste manuscrito é apresentar um método para medir a fagocitose de monócitos e granulócitos e a atividade de explosão oxidativa em amostras de sangue humano.

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

O objetivo geral deste ensaio é medir a fagocitose e a atividade de explosão oxidativa de granulócitos e monócitos em sangue total. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da imunologia, como, por exemplo, como uma determinada intervenção dietética afeta a resposta imune ao exercício. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um ensaio simples e direto, que pode ser facilmente modificado conforme os recursos laboratoriais disponíveis e os interesses da pesquisa.Estamos utilizando esta medida da função imune inata nas últimas duas décadas em muitos dos nossos estudos com exercícios, e compartilharemos alguns desses dados mais adiante no vídeo. Antes de iniciar o procedimento, utilize um analisador hematológico para realizar uma contagem sanguínea completa com análise diferencial de leucócitos nas amostras de sangue, conforme as instruções do fabricante. Anote a contagem de leucócitos em células por mililitro e os valores percentuais de neutrófilos e monócitos para as amostras.Em seguida, para cada tubo experimental e controle, utilize uma ponteira de pipeta de comprimento prolongado para transferir 100 microlitros de cada amostra de sangue total

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para quantificar a fagocitose de esporos de fungos patogênicos marcados com FITC por leucócitos humanos. Os esporos fagocitados são discernidos dos esporos aderentes às células por meio de contracoloração, seguida de análise por citometria de fluxo.

Medição Quantitativa por Citometria de Fluxo de Fagocitose de Esporos Fúngicos por Fagócitos Humanos

Este vídeo demonstra o ensaio para confirmar a atividade fagocítica das células no sangue humano por meio da citometria de fluxo. Os granulócitos e monócitos confirmam sua atividade fagocítica mostrando fluorescência verde e vermelha, confirmando a presença de bactérias engolfadas e atividade de explosão oxidativa, respectivamente.

Um ensaio para avaliar a fagocitose e a atividade de explosão oxidativa em granulócitos e monócitos

Este vídeo mostra um ensaio de monocamada de monócitos utilizando monócitos primários do sangue periférico para avaliar a fagocitose mediada por receptor Fcγ com glóbulos vermelhos R2R2 opsonizados por anticorpos poli D.

Um ensaio para estudar a fagocitose induzida pelo receptor Fcγ em monocamadas de monócitos

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Leucócitos e plaquetas do sangue pode ser usado como um marcador de saúde bioenergética geral de um indivíduo e assim têm potencial para controlar processos patológicos e o impacto de tratamentos. Aqui nós descrevemos um método para isolar e medir a função mitocondrial e do burst oxidativo nestas células.

Bioenergética e os oxidativo estourou: Protocolos para o Isolamento e Avaliação de leucócitos humanos e plaquetas

Este método demonstra uma técnica para avaliar a função dos granulócitos medindo simultaneamente a fagocitose de bactérias e a explosão oxidativa. A citometria de fluxo baseada em imagem permitiu a identificação de três subconjuntos distintos de granulócitos ativados que diferiam em sua capacidade funcional relativa.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

O ensaio de monocamada de monócitos (MMA) é um ensaio in vitro que utiliza monócitos primários isolados obtidos de sangue total periférico de mamíferos para avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcγ (FcγR).

Uso de um monócito monocamada Ensaio para Avaliar a fagocitose mediada pelo receptor Fcy

Aqui descrevemos os métodos usando microscopia confocal de fiação disco de imagem única fagocíticas eventos por macrófagos peritoneais residente do rato. Os protocolos podem ser estendidos a outras células fagocíticas.

Time-Lapse imagem em 3D da fagocitose por macrófagos de rato

Haemophilus influenzae induz inflamação no trato respiratório. Este artigo se concentrará no uso da citometria de fluxo e microscopia confocal para definir respostas imunes por fagócitos e linfócitos em resposta a essa bactéria.

Avaliando as respostas imunes respiratórias ao Haemophilus influenzae

Desenvolvemos aprimoramentos e atualizamos métodos para o ensaio monocito-monocamada (MMA) existente, no qual os macrófagos são usados para ajudar a prever melhor a relevância clínica dos aloanticorpos de glóbulos vermelhos na medicina transfusional e imunologia. Este ensaio é denominado ensaio de monócitos-macrófagos (M-MA).

Previsão da significância do anticorpo eritrocitário usando o ensaio de monócitos-macrófagos

Este trabalho descreve um protocolo in vitro padronizado para quantificar e comparar as taxas de fagocitose de hemácias xenogênicas (humanas) e alogênicas (de ratos) por macrófagos isolados de ratos.

Avaliação quantitativa da fagocitose de eritrócitos alogênicos e xenogênicos por macrófagos de ratos in vitro

Aprenda a medir fagocitose e atividade de burst oxidativo em granulócitos e monócitos do sangue humano. Este método simples e adaptável auxilia pesquisadores em imunologia e fisiologia do exercício há mais de duas décadas.

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

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