De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

O objetivo geral deste procedimento é cultivar células endoteliais da veia umbilical humana e analisar a dinâmica do citoesqueleto e a migração celular usando imagens de lapso de tempo de células vivas. Os métodos descritos neste vídeo podem ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia celular, molecular e mecanobiológica. Por exemplo, este protocolo pode ser usado para identificar como a forma e a motilidade da célula são moduladas pelo envolvimento de diferentes ECMs.

A demonstração visual é crítica porque as etapas de preparação da amostra são difíceis de executar. Eles exigem o manuseio preciso das células em tempo hábil durante todo o processo. Embora esse método possa fornecer informações sobre a motilidade das células endoteliais durante a angiogênese, ele também pode ser aplicado a investigações microscópicas de praticamente qualquer sistema de modelo de célula aderente.

Usando uma pinça, pegue uma lamínula de um frasco de armazenamento de etanol 100% e passe-a por uma chama de bico de Bunsen para esterilizá-la. Em seguida, coloque-o em uma placa de Petri de 35 milímetros. Preparar uma lamínula para cada amostra.

A um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, adicione 10 microlitros de um miligrama por mililitro de solução estoque de fibronectina e 990 microlitros de PBS. Em seguida, pipete 250 microlitros da solução em cada lamínula. Espalhe a solução uniformemente para cobrir a superfície.

Incube as lamínulas por no mínimo três horas a 37 graus Celsius. Antes de usar, enxágue cada lamínula três vezes com dois mililitros de PBS. Usando um hemocitômetro, determine o número de HUVECs cultivados e transfira um volume contendo 100.000 células por lamínula para experimentos sem migração, ou 500.000 células por lamínula para experimentos de migração para um tubo de microcentrífuga.

Gire as células a 1.400 vezes G por quatro minutos para pelletá-las. Após a centrifugação, para cada condição a ser testada, ressuspenda até um milhão de células em 100 microlitros de tampão de eletroporação e combine-as com um micrograma de cDNA. Transfira as células para uma cubeta de eletroporação.

Transfectar as células e a mistura de DNA usando o programa designado para eletroporação HUVEC. Em seguida, resgate as células transfectadas adicionando 500 microlitros de meio basal endotelial completo. Em seguida, coloque o volume celular apropriado em lamínulas revestidas com fibronectina.

Incube as células a 37 graus Celsius por três a quatro horas para dar tempo para a expressão das construções de cDNA. Em preparação para a imagem, pegue duas tiras de fita dupla face de 2,5 centímetros por 0,65 centímetro e prenda-as horizontalmente ao longo da borda superior e inferior de uma lâmina de vidro limpa. Observe que é importante deixar um pequeno espaço entre a fita e a borda deslizante para vedar a câmara.

Monte a lamínula com o lado da célula voltado para baixo, de modo que as duas bordas da lamínula fiquem apoiadas na fita. Use uma pinça para pressionar suavemente para prender a lamínula. Usando uma micropipeta, adicione 40 microlitros de meio de imagem entre a lamínula e a lâmina.

Certifique-se de que o espaço entre a lamínula e a lâmina esteja completamente preenchido com meio de imagem. Seque qualquer excesso de meio com um lenço de papel, se necessário. Sele todas as bordas deslizantes com VALAP quente.

Verifique se há vazamentos empurrando suavemente a lamínula de vidro. Coloque a lamínula montada e selada em um microscópio stage pré-aquecido a 37 graus Celsius. Usando um microscópio confocal de disco giratório, capture sequências de imagens de lapso de tempo, imagens de proteínas fluorescentes azuis e imagens DIC.

Analise a dinâmica dos microtúbulos e a co-localização conforme descrito no documento anexo. Para realizar um ensaio de migração celular, após a etapa de eletroporação, resgatar as células transfectadas adicionando 80 microlitros de meio basal endotelial completo. Em seguida, pipete toda a amostra de 80 microlitros como uma única gota no centro de uma lamínula revestida com fibronectina seca.

Não espalhe a gota. A secagem da lamínula é necessária para evitar que a gota de 80 microlitros se separe ao entrar em contato com a lamínula. Essa abordagem permite que os HUVECs sejam concentrados em uma pequena área da lamínula e, assim, promove a rápida formação de uma monocamada confluente de células.

Incube a lamínula a 37 graus Celsius por três a quatro horas para dar tempo para que as células adiram em uma monocamada confluente. Em seguida, enxágue as lâminas duas vezes em meio basal endotelial completo para remover quaisquer células que não tenham se fixado. Para criar uma borda enrolada na monocamada HUVEC, use uma pinça para segurar suavemente a lamínula no lugar e arraste firmemente uma lâmina de barbear pelo centro da monocamada da célula.

Deixe as células se recuperarem em uma incubadora de 37 graus Celsius por três horas. Em seguida, monte e monte as lamínulas para geração de imagens como antes. Adquira imagens de contraste de fase em intervalos de 10 minutos por 12 horas usando uma objetiva de fase de abertura numérica de 10X 0,45 e um condensador de longa distância de trabalho de abertura numérica de 0,52.

Use o painel ND Acquisition do programa de software de aquisição de imagem. Por fim, quantifique a ramificação e a migração do HUVEC conforme descrito no documento anexo. HUVECs foram transfectados para expressar EB3 marcado com mApple, uma proteína de ligação final de microtúbulos e imagens de lapso de tempo foram capturadas.

Imagens brutas do EB3 são mostradas à esquerda. Os cometas EB3 azuis rastreados pelo software plusTipTracker são mostrados à direita. Os cometas detectados em cada quadro foram vinculados com base em sua mudança de posição de quadro para quadro para gerar rastros EB3 e uma sobreposição visual de trajetos EB3, como mostrado aqui.

O crescimento lento e de curta duração dos microtúbulos é mostrado em vermelho, o crescimento lento e de longa duração dos microtúbulos é mostrado em verde, o crescimento rápido e de curta duração dos microtúbulos é mostrado em amarelo e o crescimento rápido e de longa duração dos microtúbulos é mostrado em azul. Para analisar a ramificação das células endoteliais, uma DIC e uma imagem fluorescente de um HUVEC individual foram capturadas com ampliação de 60 vezes. Um limite foi desenhado à mão ao redor da borda da célula na imagem fluorescente.

As origens dos ramos foram então definidas desenhando uma linha reta através do ramo e através do maior ângulo de curvatura em ambos os lados do ramo. Os ramos mais longos do que largos e com no mínimo 10 mícrons de comprimento foram contados e o comprimento foi medido desde a origem do ramo até a ponta distal do ramo. Para avaliar a migração da borda da ferida das células endoteliais, os HUVECs foram cultivados em alta densidade e a imagem de lapso de tempo de células vivas foi realizada após a ferida, conforme descrito neste vídeo.

Como mostrado aqui, as células endoteliais da borda da ferida migraram direcionalmente para a área da ferida. Esse movimento foi analisado usando o nucléolo como um marcador fiduciário para rastrear a velocidade, persistência e distância da migração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar, transfectar e preparar HUVECs para experimentos de imagem de forma celular e dinâmica do citoesqueleto ou para estudos de migração de células na borda da ferida.

Após este procedimento, outros métodos como poliacrilamida ou conjugação de colágeno podem ser realizados para responder a perguntas adicionais relacionadas ao envolvimento celular de ECMs modificados. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.