Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar as células murinas C1498 e a leucemia aguda que elas induzem após injeção intravenosa em camundongos. A principal vantagem desse procedimento é que a leucemia mielomonocítica murina induzida após a injeção de células C1498 apresenta muitas características da doença humana. Este modelo animal pode ajudar a responder a questões-chave no campo da Hematologia, como quais são os mecanismos que levam ao desenvolvimento da leucemia e à deficiência imunológica.

A implicação desse modelo animal se estende ao tratamento da leucemia, pois facilita o teste de novos agentes quimioterápicos e imunoterpúticos. Comece transferindo um camundongo C57 preto congênito fêmea de cinco a seis semanas de idade para uma capa de fluxo laminar estéril. Em seguida, coloque o animal em uma contenção.

Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 29 com 100 microlitros de células. Segure a cauda da extremidade distal e desinfete a pele da cauda com uma gaze embebida em etanol a 70%. Prossiga para injetar lentamente uma vez 10 para as sextas células em uma veia da cauda lateral.

Quando todas as células tiverem sido entregues, remova a agulha e aplique uma leve pressão no local da injeção com gaze estéril. Em seguida, devolva o animal à gaiola com monitoramento cuidadoso pelas próximas semanas. 17 a 19 dias depois, insira um tubo capilar no canto medial do olho do animal leucêmico anestesiado.

100 a 200 microlitros de sangue serão retirados do seio oribtal para o tubo capilar. Remova o tubo e controle o sangramento com a aplicação suave de uma esponja de gaze estéril no olho. Em seguida, transfira o sangue para um tubo de EDTA e armazene o tubo no gelo até o isolamento da célula mononuclear.

Para isolar as células mononucleares do sangue, primeiro adicione PBS suplementado com um EDTA milimolar até um volume final de 500 microlitros. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga. Em seguida, use uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 30 para colocar cuidadosamente 500 microlitros de solução separadora sob o sangue, tomando cuidado para não misturar as camadas.

Separe as células por centrifugação e use uma pipeta para transferir a camada de células mononucleares brancas opacas para um novo tubo de microcentrífuga. Em seguida, lave as células imunológicas em um mililitro de PBS. Centrifugue-os e ressuspenda o pellet em 600 microlitros de tampão FACS para coloração e análise por citometria de fluxo.

Para isolar a medula óssea, coloque o rato de costas em uma placa de plástico e prenda os membros dos animais. Desinfete o animal com etanol 70%. Em seguida, corte cada perna na parte superior do fêmur acima da articulação e puxe suavemente as tíbias para desconectá-las dos fêmures.

Use fórceps e tesouras para remover a pele e os músculos dos ossos e transfira os ossos para uma placa de Petri no gelo. Use uma tesoura para remover as extremidades. Em seguida, insira uma agulha de calibre 26 presa a uma seringa de 10 mililitros contendo cinco mililitros de PBS frio na extremidade de um osso de cada vez e lave as medulas.

Passe a suspensão celular pela ponta da agulha várias vezes para romper as células da medula óssea. Em seguida, filtre as células através de um novo filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros para obter uma única suspensão celular. Centrifugue as células e ressuspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lise.

Encha imediatamente o tubo com até 50 mililitros de PBS frio e centrifugue as células. Em seguida, ressuspenda o pellet de medula óssea de uma vez 10 elevado à sexta células por mililitro em tampão FACS frio. Para preparar as células da medula óssea para coloração primeiro, coloque as lâminas em câmaras descartáveis com cartões de filtro pré-anexados e coloque as câmaras em uma citocentrífuga.

Adicione 100 microlitros de tampão FACS a cada câmara de cartão de filtro e centrifugue brevemente as lâminas. No final da centrifugação, adicione 100 microlitros de células a cada câmara e centrifugue as células. Em seguida, remova cuidadosamente as lâminas das câmaras para secagem ao ar.

Para corar as células da medula óssea, mergulhe as lâminas em um frasco de coplin contendo a solução de May-Grunwald por cinco minutos. Em seguida, transfira as lâminas para um frasco de solução tampão com pH de 6,8 por um minuto. Em seguida, transfira as lâminas para a solução Giemsa R por 10 minutos.

Seguido de uma lavagem de 10 segundos com água de pH neutro. Após a lavagem, deixe as lâminas secarem ao ar e aplique uma gota de meio de montagem em cada amostra. Em seguida, coloque uma borda de uma lamínula na lâmina e abaixe cuidadosamente a lamínula nas células, pressionando suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.

Em comparação com os animais de controle, os animais injetados com células C1498 exibem uma infiltração maciça de células C1498 em sua medula óssea, conforme observado pela aparência de explosão das células. As células C1498 infiltrantes da medula óssea demonstram fenótipos monocíticos e granulocíticos indicativos de células monoblásticas e mieloblásticas, respectivamente, característicos de leucemia mielomonocítica aguda. A análise por citometria de fluxo das frequências de células mononucleares em amostras de sangue dos camundongos injetados com C1498 indica que aproximadamente um quarto de toda a população de glóbulos brancos é composta de células leucêmicas.

As frequências de linfócitos T e B são semelhantes entre os animais controle e C1498 injetados. As frequências de monócitos, no entanto, são observadas em níveis mais altos em camundongos injetados em C1498, uma característica da leucemia mielomonocítica aguda. Ao realizar os procedimentos de citoquímica e May-Grunwald Giemsa, é importante lembrar de manter os valores de pH, temperaturas e tempos de incubação apropriados.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como caracterizar a leucemia mielomonocítica aguda. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de Hematologia explorarem a natureza da leucemia aguda espontânea e induzida em outros modelos animais.