Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar as células murinas C1498 e a leucemia aguda que elas induzem após injeção intravenosa em camundongos. A principal vantagem deste procedimento é que a leucemia mielomonocítica murina induzida após injeção de células C1498 apresenta muitas características da doença humana. Este modelo animal pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da Hematologia, como quais são os mecanismos que levam ao desenvolvimento da leucemia e à imunodeficiência.

A implicação desse modelo animal estende-se ao tratamento da leucemia, pois facilita a testagem de novos agentes quimioterápicos e imunoterapêuticos. Comece transferindo um camundongo fêmea congênico C57 black 6 com cinco a seis semanas de idade para uma capela de fluxo laminar estéril. Em seguida, coloque o animal em um dispositivo de contenção.

Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 29 graus com 100 microlitros de células. Segure a cauda na extremidade distal e desinfete a pele da cauda com uma gaze embebida em etanol 70%. Prossiga com a injeção lenta de uma vez 10 à sexta potência de células em uma veia lateral da cauda.

Quando todas as células tiverem sido administradas, remova a agulha e aplique pressão suave no local da injeção com gaze estéril. Em seguida, devolva o animal à sua gaiola com monitoramento cuidadoso nas próximas semanas. Dezoito a vinte dias depois, insira um tubo capilar no canto medial do olho do animal leucêmico anestesiado.

De 100 a 200 microlitros de sangue serão coletados do seio orbital para o tubo capilar. Remova o tubo e controle o sangramento com a aplicação suave de uma gaze estéril sobre o olho. Em seguida, transfira o sangue para um tubo com EDTA e mantenha o tubo sobre gelo até o isolamento das células mononucleares.

Para isolar as células mononucleares do sangue, adicione primeiro PBS suplementado com um milimolar de EDTA até um volume final de 500 microlitros. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga. Depois, use uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 30 graus para aplicar cuidadosamente 500 microlitros de solução separadora sob o sangue, tomando cuidado para não misturar as camadas.

Se pare as células por centrifugação e use uma pipeta para transferir a camada branca opaca de células mononucleares para um novo tubo de microcentrifugação. Em seguida, lave as células imunes em um mililitro de PBS. Centrifugue-as e re-suspenda o pellet em 600 microlitros de tampão FACS para coloração e análise por citometria de fluxo.

Para isolar a medula óssea, coloque o camundongo de costas sobre uma placa de plástico e fixe as patas do animal. Desinfete o animal com etanol 70%. Em seguida, corte cada pata na parte superior do fêmur acima da articulação e puxe suavemente as tíbias para separá-las dos fêmures.

Use pinças e tesoura para remover a pele e os músculos dos ossos e transfira os ossos para uma placa de Petri sobre gelo. Use a tesoura para remover as extremidades. Em seguida, insira uma agulha de calibre 26 acoplada a uma seringa de 10 mililitros contendo cinco mililitros de PBS frio na extremidade de um osso por vez e lave as medulas ósseas para dentro da placa.

Passe a suspensão celular através da ponta da agulha várias vezes para romper as células da medula óssea. Em seguida, filtre as células através de um novo filtro de 70 microns para um tubo cônico de 50 mililitros para obter uma suspensão de células simples. Centrifugue as células e re-suspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lise.

Encha imediatamente o tubo com até 50 mililitros de PBS frio e centrifugue as células. Em seguida, re-suspenda o pellet de medula óssea a uma concentração de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro em tampão FACS frio. Para preparar as células da medula óssea para coloração, primeiro coloque lâminas em câmaras descartáveis com cartões-filtro pré-anexados e posicione as câmaras em uma citocentrifuga.

Adicione 100 microlitros de tampão FACS a cada câmara do cartão com filtro e centrifugue brevemente as lâminas. Ao final da centrifugação, adicione 100 microlitros de células a cada câmara e centrifugue as células. Em seguida, remova cuidadosamente as lâminas das câmaras para secagem ao ar.

Para corar as células da medula óssea, mergulhe as lâminas em um frasco Coplin contendo solução de May-Grunwald por cinco minutos. Em seguida, transfira as lâminas para um frasco com solução tampão de pH 6,8 por um minuto. Depois, transfira as lâminas para a solução de Giemsa R por 10 minutos.

Em seguida, realize uma lavagem de 10 segundos com água neutra em pH. Após a lavagem, deixe as lâminas secarem ao ar e adicione uma gota de meio de montagem a cada amostra. Então, posicione uma borda de uma lamínula sobre a lâmina e abaixe cuidadosamente a lamínula sobre as células, pressionando suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.

Em comparação com os animais controle, os animais injetados com células C1498 exibem uma infiltração maciça de células C1498 na medula óssea, observada pela aparência de blastos dessas células. As células C1498 que infiltram a medula óssea demonstram fenótipos monocíticos e granulocíticos, indicativos de células monoblásticas e mieloblásticas, respectivamente, características da leucemia mielomonocítica aguda. A análise citométrica de fluxo das frequências de células mononucleares em amostras de sangue de camundongos injetados com C1498 indica que aproximadamente um quarto da população total de leucócitos é composto por células leucêmicas.

As frequências de linfócitos T e B são semelhantes entre animais controle e os injetados com C1498. As frequências de monócitos, no entanto, são observadas em níveis mais elevados em camundongos injetados com C1498, uma característica da leucemia mielomonocítica aguda. Ao realizar os procedimentos de citocromia e de May-Grunwald Giemsa, é importante lembrar-se de manter os valores de pH, temperaturas e tempos de incubação apropriados.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar a leucemia mielomonocítica aguda. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de Hematologia explorarem a natureza das leucemias agudas espontâneas e induzidas em outros modelos animais.