Name: Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprenda a caracterizar células C1498 murinas e a leucemia mielomonocítica aguda induzida em camundongos usando citometria de fluxo e coloração de May-Grünwald Giemsa. Este modelo animal facilita o estudo de mecanismos da doença.

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Os autores gostariam de agradecer ao "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comité du Septentrion), ao SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) e ao Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) pelo apoio a este trabalho. Eles gostariam de agradecer a Delphine Taillieu e à equipe do biotério por abrigar os ratos e manter seu bem-estar. Agradecemos também a Raphaëlle Caillerez e Nathalie Jouy por suas respectivas ajudas em microscopia e citometria de fluxo.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Em estudos anteriores, a linha de células C1498 foi descrito como um indutor da granulocítica aguda 5, NKT mielomonocítica 6 ou 7 leucemia de células. No entanto, os dados demonstrativos na literatura estavam ausentes ou incompletos. O protocolo aqui apresentado utiliza técnicas diferentes, como a citometria de fluxo, imunofluorescência, a coloração citoquímica MGG e ensaios, para caracterizar as células C1498 em cultura e para determinar a natureza da leucemia que é induzida em ratos depois de serem injectados. Quando fenotipados em células cultivadas in vitro C1498 após imunocoloração e citometria de fluxo foram realizadas análises, observaram-se algumas limitações porque estas células expressaram alguns marcadores da superfície das células hematopoiéticas que foram previamente descritos na literatura 6,7. De acordo com nossos resultados, Labelle et al. Não observar a expressão na superfície celular de madura TCR em células C1498 usando cytomet fluxocoloração ry. No entanto, eles consideram-nos uma linha de células NKT depois de terem detectado CD3ε e TCRVβ8.2 mRNAs 7. Observou-se também a expressão intracelular de cadeias e moléculas TCRVβ CD3ε na maioria das células (&gt; 70%), mas as suas linhagens hematopoiéticas não pode ser determinada porque havia também a expressão intracelular concomitante da molécula de Mac-3. Mieloperoxidase, MGG coloração e avaliações para analisar esterases funcionais usando citoquímica demonstraram que a linhagem de células C1498 teve uma origem mielóide e foi composto por monoblastos e mieloblastos. Estes resultados foram concordantes com a percentagem de Mac-3 + células que foram obtidos na análise de citometria de fluxo de coloração. Embora não quantitativas, estes passos representam experiências principais para ser realizada. Com efeito, eles permanecem, até agora, os melhores métodos existentes para a caracterização da estirpe e diferenciação de células hematopoiéticas fase que não expressam ou fmarcadores fenotípicos específicos ew. Citometria de fluxo coloração foi útil para demonstrar o desenvolvimento de leucemia aguda em ratos congï¿½icas após C1498 células foram injetadas por via intravenosa. As células C1498 CD45.2 + que se infiltrou num sangue periférico e vários órgãos foram isolados, e as suas frequências foram determinados. Quantificação também foi realizado para analisar medular inerente e as células esplénicas após imunofenotipagem. Limitações foram encontrados quando o fenótipo de células C1498 foi examinada em órgãos como expressaram alguns marcadores hematopoiéticas (apenas alguns deles foram B220 +). Para definir a natureza da leucemia aguda observada, coloração May-Grunwald Giemsa e uma análise das actividades de monocítica e esterases granulocítica foram realizadas utilizando medula óssea. Os resultados mostraram que as células C1498 preservaram a sua morfologia e função mieloblástica e monoblástica, revelando o aparecimento de leucemia mielomonocítica. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Em consideração para as etapas críticas descritas neste protocolo, deve ser dada especial atenção ao pH ao realizar reações citoquímicas e coloração MGG porque erros no pH podem levar a interpretações incorrectas de resultados. Por exemplo, a actividade de esterase butirato α-naftilo é específico para células monocíticas-se apenas com um pH de 6,0 devido granulócitos e linfócitos também pode manchar positivo para este teste a valores de pH mais elevados. A fixação das células não é recomendado antes de executar coloração MGG, e nós mostrou que apenas a fixação CAF apresentou resultados satisfatórios quando se realiza esterases reações citoquímicas usando C1498 células. Para preservar a expressão da molécula de CD115 e sua detecção por citometria de fluxo, todas as amostras de células (por exemplo, sangue, medula óssea e baço) deve ser mantido em gelo durante o procedimento. Se nenhuma coloração é observada em citometria de fluxo e / ou ensaios de imunofluorescência, a referência dos anticorpos, o seu armazenamento recomendas e suas diluições devem ser verificados. As referências especificadas na tabela de materiais / equipamentos foram selecionados para aplicações de citometria de fluxo ou imunofluorescência. Os anticorpos primários / secundários ou os seus conjugados fluoróforos podem ter perdido a sua actividade devido a armazenamento inadequado (por exemplo, a exposição à luz ou calor), diluição incorrecta, extenso de congelamento / descongelamento ou o uso de tampões contaminados. Executar controlos positivos para garantir que eles estão funcionando corretamente. Use de medula óssea de rato ou células derivadas de baço que são conhecidas por expressar as proteínas de interesse. Para evitar o elevado ruído de fundo e a coloração não específica, certifique-se de que as células são lavadas apropriadamente e mantida a elevada humidade (por imunofluorescência) e que os anticorpos são diluídos conforme instruído. Utilizar a mesma concentração e diluição para o anticorpo de controlo de isotipo e o anticorpo primário para determinar com precisão o nível de fundo na amostra. Para as experiências de esterase citoquímica, oOs reagentes podem ser testados usando lâminas de controlo positivas e negativas contendo rato purificada granulocítica esplénica (Ly6G +) e monocítica (+ CD115) células. O procedimento descrito no presente estudo mostrou que muitas das características leucémicas observados em ratinhos após a injecção de células C1498 partilhada características comuns com leucemia mielomonocítica aguda humano 11,12. As células leucémicas invadiram resultou numa redução de maduras e imaturas (progenitores e de precursores de células hematopoiéticas da medula). C1498 células estão presentes em alta frequência (&gt; 20%) no sangue periférico, como são células monocíticas. Hepatomegalia e esplenomegalia foram observadas como resultado da infiltração das células leucémicas, e aumentos significativos nos linfócitos B e células mielóides também foram observados para acompanhar esplenomegalia. Trombocitopenia foi também observada quando os números de plaquetas do sangue foram estimadas usando um analisador de hematologia. Foi show den, utilizando experimentos in vitro, que C1498 células inibir a hematopoiese murino normal, através da secreção de fatores solúveis 13. Em diversos modelos de ratinho de tumor, as células mielóides imaturas (incluindo monocíticas e células granulocíticas) também têm sido mostrados para migrar a partir da medula óssea para o baço, onde eles inibem a activação das células T específicas do tumor e anti-proliferação 14. Assim, a redução nas células hematopoiéticas que foi observada na medula óssea podem ser resultantes de uma deficiência tanto na hematopoiese e / ou da sua emigração. Este último mecanismo pode explicar a presença de monocitose no sangue periférico ou da observação de fracções mielóides no baço alargada. É também concebível que essas células poderiam ter sido derivado da melhoria da hematopoiese esplénica. De fato, sob condições de estado estacionário, foram identificados alguns subconjuntos de células B do baço como precursores de linfócitos B maduros 15. Além disso, em condições inflamatórias, medAs células estaminais e progenitores ullary foram mostrados para mudar para o baço para induzir a produção de monócitos maduros 16. Este protocolo não permite tirar conclusões sobre os mecanismos que estão envolvidos no desenvolvimento de leucemia, e os ensaios funcionais, bem como moleculares adicionais devem ser empregadas para o fazer. No entanto, estes dados incluem informações detalhadas sobre as características clínicas da leucemia mielomonocítica aguda e ajudará os investigadores a avaliar e compreender os efeitos de novos agentes terapêuticos.

A leucemia mielóide aguda (LMA) é caracterizada pela proliferação não controlada de células mielóides hematopoiéticas que são bloqueados em diferentes estádios de maturação. Esta desregulação pode afetar a granulocítica, monocítica, eritrocítica ou vias de diferenciação megaryocytic 1. células AML acumulam na medula óssea, levando a hematopoiese prejudicada, o que resulta em trombocitopenia, linfopenia e anemia. As células leucémicas também invadem o sangue e órgãos não linfóides. O mouse modelo C1498 tem sido usado por décadas como um modelo para leucemia aguda vez que as células cancerosas foram isolados de um rato leucêmica 10 meses de idade C57BL / 6 (H-2 b) do sexo feminino em 1941. A literatura descreve a invasão no sangue , órgãos hematopoiéticos (por exemplo, o baço e os gânglios linfáticos) e órgãos não-hematopoiéticas (por exemplo, o fígado, pulmões, ovários, rins) e por células C1498 altamente proliferativas após terem sido injectadas por meio de um emintravenosa, subcutânea ou via intra-peritoneal em ratos suscetíveis 2-4. No entanto, neste modelo de ratinho foi relatado para induzir quer granulocítica 2,5 ou 6 mielomonocítica leucemia. Mais recentemente, um estudo publicado em 2002 descreveu este tipo de câncer como leucemia de células NKT murino 7. Assim, a literatura diverge sobre a natureza desta linha de células C1498 ea leucemia associada induz em ratinhos. Estas discrepâncias devem-se principalmente à falta de detalhadas e atualizadas informações publicadas sobre as células e que a doença leucêmica em geral, porque muitos estudos foram realizados na década de 1950 - 70. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para descrever como a caracterização de células C1498 e analisar a natureza da doença leucémica que é induzida pela sua injecção intravenosa em ratinhos. A primeira seção deste protocolo é dedicado a uma descrição de células C1498 que foram cultivadas in vitro. anti fluorescentecorpos dirigidos contra marcadores de superfície e hematopoiéticas intracelulares foram usadas para determinar o seu fenótipo utilizando citometria de fluxo. A presença de mieloperoxidase foi avaliada utilizando microscopia de imunofluorescência, a sua linhagem hematopoiética e diferenciação fase foram avaliados usando citoquímica para avaliar a actividade de esterase, e coloração May-Grunwald Giemsa foi realizada. As células C1498 foram então injectadas em ratinhos, e a doença de leucemia aguda que foi induzido é descrito na segunda parte deste manuscrito. As mesmas técnicas foram utilizadas para determinar as frequências e os fenótipos de células leucémicas e inerentes na medula óssea, sangue periférico, baço e órgãos não-hematopoiéticas (do fígado e pulmões). Este protocolo é altamente reprodutível, e os dados aqui apresentados ajudará os investigadores a avaliar os efeitos de novas estratégias terapêuticas. Este modelo de leucemia do murganho que já foi usado para testar se aproxima de uma imunoterapiand diferentes fármacos quimioterapêuticos do cancro 8,9. A sua eficácia foi avaliada determinando-se a evolução da carga de tumor e as taxas de sobrevivência. Este protocolo pode ser usado para fornecer informações adicionais sobre a distribuição e de subsistência de populações de células hematopoiéticas leucêmicas e outros durante o tratamento.

<table><tbody><tr><td>Linha celular C1498</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Aminoácidos Não Essenciais, Gibco&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio (Gibco, Suplemento GlutaMAX)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes de coloração de citometria de fluxo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>clone RA3-6B2, diluição final 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato B220 biotina (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>clone RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anti-rato CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>clone 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>clone 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>clone GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anti-rato CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>clone GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-rato CD8 biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>clone 53-6.7, 1/500</td></tr><tr><td>anti-rato CD11a biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0111</td><td>clone M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>clone M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD16/32 biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>clone 93, 1/400</td></tr><tr><td>purificado anti-mouse CD16/32 (bloqueio de FcR)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>clone 2.4G2</td></tr><tr><td>anti-rato CD18 biotina (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>clone M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>clone M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anti-rato CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>clone 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anti-rato CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>clone 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anti-rato CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>clone 390, 1/100</td></tr><tr><td>anti-rato CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>clone RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anti-rato CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td>553134</td><td>clone IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anti-rato CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>clone 104, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD49b/Pan NK PE&</td><td>nbsp; BD biosciences</td><td>553858</td><td>clone DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse CD80</td><td>biotina ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>clone 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD86 biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>clone GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>clone M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anti-mouse CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>clone AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>clone 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>clone A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>clone 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anti-mouse CD274 (PD-L1) biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>clone MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>clone D7, 1/100</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>clone HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6G&nbsp; (Gr-1) biotina (1)</td> <td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>clone RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anti-mouse Ly-6G FITC (2)</td> <td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>clone 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse MHC classe I (H-2Db) biotina</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>clone 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anti-mouse MHC classe II (IA/IE) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>clone M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anti-mouse NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>clone PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anti-camundongo TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>clone H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>estreptavidina PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/200</td></tr><tr>Reagentes <td></td><td></td><td></td><td>de coloração de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Anti-mieloperoxidase de camundongo (anticorpo de cadeia pesada)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 &micro; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp; anti-cabra IgG (anticorpo acoplado Texas Red)</td> <td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Soro normal de burro</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Solução Hoechst</td><td>BD Biosciences BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Meio de montagem 1 (Fluoromount)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Esterase reagentes de coloração citoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naphtol AS-D solução de cloroacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>Solução de nitrito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Solução de citrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Solução de formaldeído, solução de 37%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-butirato de naftil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido de nitrito de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>Solução de pararosanilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de metileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>meio de montagem 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; reagentes de coloração nwald Giemsa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; solução nwald</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R solution&nbsp;</td><td>Diagnóstico RAL</td><td>320310</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/20</td></tr><tr><td>solução tampão de pH 6,8</td><td>RAL Diagnostics</td><td>330368</td><td></td></tr><tr><td>Outros materiais, reagentes e equipamentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 1000 (100 mg/ml)</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovin albumina serum (BSA) pó</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>Solução PBS (1x concentrado)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saponina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Solução EDTA ultrapura 0,5 M, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Solução de separação (Pancoll Mouse)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise (Tampão de lise de glóbulos vermelhos) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Solução de azul de tripano (0,4%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>tubo de 50 ml (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro de Célula (Falcon)&nbsp;</td><td>Corning Ciências da Vida</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Câmara & cartão de filtro (EZ Cytofunnel Shandon)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>A78710003</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Cover Glasses, 24 x 24mm</td><td>Knittel Glass</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Slides (Starfrost - bordas retificadas 90)</td> <td>Knittel Glass</td><td>VS1137 # 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipeta 150 mm (tubo capilar)</td> <td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de 26 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; seringa e agulha de insulina 29 G</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>agulha 30 G&nbsp;</td><td>Becton & Tubos de</td> citometria de fluxo Dickinson <td>304000</td><td></td></tr><tr><td>(azul)</td> <td>Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr><tr><td>Caneta repelente à água (Dakopen)</td> <td>Tesoura</td> estéril <td>afiada Dako S200230</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinça estéril</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de células Thoma</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (Fisherbrand Plastic)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Limitador cilíndrico 15 - 30 gm</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Esponjas de gaze estéreis</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina c1498 e seu modelo associated leucemia mouse

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

A injecção intravenosa de células C1498 em ratinhos singénicos ou congénicos foi realizada desde 1941. Estas injecções resultar no desenvolvimento de leucemia aguda. No entanto, a natureza da doença não tem sido bem documentada na literatura. Aqui, nós fornecemos um protocolo técnica para a caracterização de células C1498 in vitro e para determinar a natureza da leucemia induzida in vivo. A primeira parte deste procedimento é focada em determinar a linhagem hematopoiética eo estágio de diferenciação de células C1498 cultivadas. Para alcançar este objectivo, de multi-paramétrico de coloração de citometria de fluxo é utilizada para detectar marcadores de células hematopoiéticas. Microscopia de imunofluorescência, e citoquímica uma coloração May-Grunwald Giemsa são então realizados para avaliar a expressão de mieloperoxidase, a actividade de esterases e morfologia celular, respectivamente. A segunda parte deste protocolo é dedicada a descrever a doença leucemia que é induzido emvivo. Este último pode ser alcançado pela determinação das frequências de células leucémicas e inerentes no sangue, órgãos hematopoiéticos (por exemplo, medula óssea e baço) e tecidos não linfóides (por exemplo, o fígado e os pulmões) utilizando coloração específica e citometria de fluxo análises. A natureza da leucemia é então confirmada utilizando a coloração de May-Grunwald Giemsa e coloração por esterases específicos na medula óssea. Aqui, apresentamos os resultados que foram obtidos utilizando este protocolo em camundongos C1498- e PBS-injetados com a mesma idade.

Para caracterizar o modelo de rato C1498, procedeu com duas etapas principais. Em primeiro lugar, as células C1498 foram caracterizados para determinar a sua linhagem hematopoiética e estado de maturação in vitro (Figura 1). Estas células foram então injectadas em ratinhos congénicos, e a natureza da doença leucémica induzidos foi avaliada para determinar características diferentes: a infiltração de células leucémicas, o seu fenótipo, a quantificação das células hematopoiéticas (maduros e progenitoras / precursoras) na medula óssea, as frequências de células C1498 e células hematopoiéticas maduras no sangue e uma avaliação do inchaço órgão (no baço, fígado e pulmões) e composição celular. Para caracterizar os fenótipos de células C1498 in vitro, as células foram marcadas com anticorpos dirigidos contra moléculas que são expressas pelos precursores hematopoiéticos e células maduras (tabela 1), e os resultados foram analisados por meio de fluxo cytometry. As células C1498 foram positivas para a expressão na superfície celular de Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (&gt; 25%), e eles exibiram expressão intracelular de CD3ε, receptores das células T cadeias (TCR) Vp e MAC -3 (Figuras 2A e B). As células foram negativos para os marcadores de superfície celular Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, e pan-NK moléculas e para a expressão intracelular de CD4 e CD8 (dados não apresentados) . Eles foram, em seguida, examinadas para os marcadores de células estaminais hematopoiéticas e progenitoras (Tabela 1). Eles também foram negativos para a expressão na superfície celular de CD117, CD34, Sca-1, CD150 e CD16 / 32 (dados não mostrados). Estas células leucémicas foram então testadas para determinar a expressão da adesão, a apresentação de antigénios e moléculas co-estimuladoras. As células expressaram os marcadores de superfície de LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), e H-2D e B foram negativas para MHC de classe II, CD80, CD86 e CD274 (dados não mostrados). células C1498 tor conseguinte expresso tanto mielóide (Mac-1, Mac-3) e marcadores linfóides (B220, CD3, TCR). Para melhor caracterizar sua linhagem hematopoiética, expressão mieloperoxidase foi avaliado usando microscopia de imunofluorescência. Todas as células foram positivas para a mieloperoxidase, a qual verificada a sua origem mielóide (Figura 3A). A maioria das células coradas também positivas para esterases α-naftil butirato (Figura 3B, painel da esquerda), e alguns deles corado para os naftol AS-D cloroacetato esterase (setas pretas) (Figura 3B, painel da direita). Os resultados indicam que as células continham misturas de células monocíticas e granulocítica. Após a coloração May-Grunwald Giemsa foi realizada, as células C1498 foram observados para exibir uma morfologia de explosão do tipo com uma proporção nucleo-citoplasmático alta, 3 a 5 nucléolos no núcleo, halo perinuclear, numerosos vacúolos e citoplasma basofílico (Figura 3C ). ºnós, a linha de células C1498 é composto por monoblastos e mieloblastos. As células C1498 (CD45.2 +) foram então injectados intravenosamente em ratinhos CD45.1 +. Os ratinhos sucumbiu 17 a 19 dias depois, as células foram injectadas. Estes ratos foram sacrificados de modo a que o seu tipo de leucemia pode ser analisada antes de morrer da doença. Os ratinhos de controlo, que foram injectados com PBS, foram analisados ​​no mesmo intervalo de tempo para comparação. Os ratinhos injectados com células C1498 exibida infiltração massiva de células C1498 em sua medula óssea, como demonstrado pelo aparecimento de explosão do tipo das células depois de May-Grunwald Giemsa coloração foi realizada (Figura 4A). Eles também conservaram a sua monocítica e fenótipos granulocíticas (Figura 4B e C), demonstrando uma acumulação de células monoblástica mieloblásticas e que é característica de leucemia mielomonocítica aguda. para determine se medulares números de células hematopoiéticas foram menores após células leucêmicas invasão, C1498 células CD45.2 +, B linfocítica, monocítica e populações granulócitos (incluindo progenitores, precursores e células maduras), foram quantificados utilizando coloração de imunofluorescência e fluxo de multi-paramétricos citometria análise. As células leucêmicas representava 16 a 36% das células hematopoiéticas (dados não mostrados). Os outros tipos de células estavam presentes em números significativamente mais baixos nos ratos C1498 injectados do que nos murganhos injectados com PBS (por 5 vezes, em média, para as subpopulações de células B, 4 vezes em média para células granulocíticas e 3 vezes em média para subconjuntos monocíticas) (Figura 5A a C). Uma investigação das frequências de células mononucleares em amostras de sangue leucêmicas e mouse controle mostrou que eles continham uma percentagem comparável de linfócitos (Figura 6A), mas uma maior freqüência de monocíticae células leucémicas. Estas características são representativas de leucemia mielomonocítica aguda 11 (Figura 6B). Entre as outras características de leucemia mielomonocítica aguda 12, os ratinhos injectados com C1498 apresentados com fígados inchados (hepatomegalia), pulmões e baço (esplenomegalia) (Figura 7A). Várias frequências de células CD45.2 + C1498 foram detectados nestes órgãos utilizando coloração de imunofluorescência e a citometria de fluxo de análise (Figura 7B). Como esplenomegalia pode resultar de um elevado número de monócitos infiltrados, que também estimou as proporções de populações esplênicas. Os números de células B no linfocítica, monocítica e fracções de células granulocíticas foram significativamente maiores, por uma média de 2 vezes, 2,5 vezes e 3-vezes, respectivamente, em baços leucémicas que em baços de controlo (Figura 7C). thin-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> Figura 1. Representação esquemática do protocolo descrito acima para a caracterização in vitro linhas de células cultivadas em Descrições C1498 e in vivo de leucemia aguda. A linhagem hematopoiética e a fase de diferenciação das células C1498 em cultura de tecido foram determinados pela primeira vez. Células C1498 foram então injectadas em ratinhos congénicos para induzir o desenvolvimento de leucemia aguda. O isolamento da medula óssea, sangue periférico, baço, fígado e tecidos pulmonares foi realizada para determinar as frequências, fenótipos e alterações morfológicas após a infiltração de células C1498. IV: MGG intravenosa:. May-Grunwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> ad / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Análise fenotípica de C1498 células após cultura in vitro. Citometria de fluxo representativas gráficos de pontos e os histogramas de superfície celular (A) e intracelular (B) C1498-expressa moléculas que foram associados com a diferenciação de células hematopoiéticas maduras são mostrados. Células C1498 foram colhidas a partir de culturas, lavadas e marcadas utilizando anticorpos fluorescentes que eram específicos para a superfície celular CD11b, CD18 e B220 marcadores ou os respectivos controlos de isotipo. Para a coloração intracelular, as células foram fixadas, permeabilizadas e marcadas utilizando anticorpos dirigidos contra a Mac-3, CD3ε, e um epitopo comum do TCR (T-Cell Receptor) cadeia Vp ou seus controlos de isotipo. As análises foram realizadas usando gating com células vivas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> ntent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Figura 3. funcionais e morfológicas Caracterização de células cultivadas C1498. Células C1498 foram colhidas a partir de culturas e centrifugou-se em lâminas de microscopia. (A) Coloração para a expressão da mieloperoxidase foi realizada utilizando imunofluorescência. (B) reacções citoquímicos foram utilizados para analisar a esterase α-naftil butirato (NBE) e naftol AS-D cloroacetato esterase (CAE) atividades em células C1498. As células foram considerados positivos para cada rótulo quando, grandes grânulos citoplasmáticos marrom e vermelho-púrpura, respectivamente, foram observados. (C) May-Grunwald Giemsa (MGG) coloração de C1498 células. Para cada experimento a coloração, a ampliação microscopia objectivo é indicado. Cada imagem é representativa de três experiências separadas.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Figura 4. Os ratinhos de Medula Óssea Morfologias em PBS e injectou-C1498. Células da medula óssea foram isoladas a partir de PBS e ratinhos injectados com células C1498 e centrifugadas em lâminas para microscopia. (A) May-Grunwald Giemsa (MGG) coloração. (B ) esterase α-naftil butirato (NBE) e naftol (C) AS-D cloroacetato esterase (CAE) funções foram avaliados utilizando citoquímica. No painel A, a banda (imaturo) ou neutrófilos segmentados (maduros) são menos visíveis na medula óssea dos ratinhos injectados C1498 do que os ratinhos injectados com PBS. O painel B e C indicam que houve uma acumulação de células monocíticas e granulócitos na medula óssea leucémicas em comparação com os números observados na medula óssea de controlo. Todosanálises microscópicas foram realizadas usando uma objetiva de ampliação 100X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Figura 5. Os ratinhos Análise Quantitativa de medulares Populações em PBS e injectou-C1498. Células da medula óssea foram isoladas a partir de PBS e ratinhos injectados com células C1498 e estimado após a contagem das células foi realizada. As frequências dos diferentes populações de células foram determinadas após imunocoloração e fluxo de célula fechada ao vivo citometria de análise. (A) Os subconjuntos de células B incluído células CD19 + B220 + em fases de células pró-B para amadurecer linfócitos B (B) células granulócitos no CD3 - CD11b + e + Ly6G linhagens, que incluiu um precursores. nd granulócitos imaturos e maduros (c) Os subconjuntos monócitos foram definidos como CD3 - CD115 + e as células do progenitor incluída a amadurecer estágios de monócitos. n = 7 ratinhos / grupo, e os dados são apresentados como histogramas mostrando as médias ± SEM. *** P &lt;0,0001 e ** p &lt;0,01, teste t de Student não pareado comparando PBS e ratos C1498-injetados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> Figura Análise 6. Sangue de subpopulações de células mononucleares em PBS e ratos C1498-injetado. Fluxo representativas citometria de gráficos de pontos de percentagens de linfócitos T (A) e B respectivamente, que foram definidas como as células CD3 + e B220 + em PBS e injectou-C1498 célula. ratinhos (B) As frequências de células monocíticas em leucémicas C1498 e controlo (PBS) murganhos foram determinados através da análise de CD115 + Ly6C - CD115 + e Ly6C células elevados. A análise foi realizada por gating células vivas. Para comparar ratos leucêmicas e controle, CD45.2 + foram excluídos C1498 células. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Figura 7. Estimativa do baço Populações em leucêmicas e Controle de Ratos. (A) Fotografias representativas de fígado, pulmão e baço inchaço em murganhos leucémicos em comparação com ratinhos de controlo. Os baços foram recolhidos e pesados, e os esplenócitos foram contadas seguinte ruptura de tecido. (B) histograma que representa as frequências de células leucémicas em DIFFórgãos erent após imunocoloração foi realizada para células CD45.2 + e os resultados foram analisados por citometria de fluxo. (C) As estimativas de baço B, o número de células granulócitos e monócitos após imunocoloração e citometria de fluxo gating análises foram realizadas para identificar vivo CD19 + B220 + , CD3 - CD11b + Ly6G +, CD3 - CD11b + Ly6C - e CD3 - CD11b + de células de alta Ly6C. As barras de escala mostradas para os pulmões, fígados e baços indicar 1 cm. .. n = 5-8 ratinhos / grupo, e os dados são representados em histogramas como médias ± SEM * p &lt;0,05; **, p = 0,0033 ratinhos, teste t de Student desemparelhado comparando PBS e injectados C1498 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> Tipo celular </td><td> Membrana ou intracelulares Moléculas </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Precursores e células maduras </td><td></td></tr><tr><td> células NK </td><td> NK1.1 +, pan-NK + </td></tr><tr><td> células NKT </td><td> NK1.1 +, pan-NK +, TCR vbeta + (8,2), CD3 + </td></tr><tr><td> linfócitos T </td><td> VBeta TCR +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> células B e os linfócitos B precursores </td><td> B220 +, CD19 +, CD21 / 35 + </td></tr><tr><td> precursores de granulócitos e de granulócitos </td><td> Ly6G +, Mac-1 +, CD11b + </td></tr><tr><td> precursores monócitos / macrófagos e monócitos </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> progenitores </td><td></td></tr><tr><td> progenitores multipotentes </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin CD150-) </td></tr><tr><td> progenitores multipotentes preparado linfóides </td><td> CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin) </td></tr><tr><td> progenitores linfóides comuns </td><td> CD117lo Sca-1lo CD127 + (Lin) </td></tr><tr><td> progenitores mielóides comuns </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin Sca-1) </td></tr><tr><td> progenitores de granulócitos-macrófagos </td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin Sca-1) </td></tr><tr><td> progenitores de megacariócitos-eritróide </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin Sca-1) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Células-tronco hematopoéticas </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin- CD34-) </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Os marcadores de linhagens de células hematopoiéticas e diferenciação. CD: cluster de diferenciação; Lin: marcadores de células maduras; lo:baixa expressão; oi: alta expressão; int: expressão intermediária; NK: células assassinas naturais; TCR: receptor de células T.

Este manuscrito fornece um processo técnico que pode ser utilizado para caracterizar culturas de células C1498 in vitro e a leucemia aguda induzida em ratos após a sua injecção. análises fenotípicas e funcionais são realizadas utilizando citometria de fluxo, microscopia de imunofluorescência, citoquímica e coloração May-Grünwald Giemsa.

Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar as células murinas C1498 e a leucemia aguda que elas induzem após injeção intravenosa em camundongos. A principal vantagem deste procedimento é que a leucemia mielomonocítica murina induzida após injeção de células C1498 apresenta muitas características da doença humana. Este modelo animal pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da Hematologia, como quais são os mecanismos que levam ao desenvolvimento da leucemia e à imunodeficiência.A implicação desse modelo animal estende-se ao tratamento da leucemia, pois facilita a testagem de novos agentes quimioterápicos e imunoterapêuticos. Comece transferindo um camundongo fêmea congênico C57 black 6 com cinco a seis semanas de idade para uma capela de fluxo laminar estéril. Em seguida, coloque o animal em um dispositivo de contenção.Em seguida, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 29 graus com 100 microlitros de células. Segure a cauda na extremidade distal e desinfete a pele da cauda com uma gaze embebida em etanol 70%. Prossiga com a injeção lenta de uma vez 10 à sexta potência de células em uma veia lateral da cauda.Quando todas as células tiverem sido administradas, remova a agulha e aplique pressão suave no local da injeção com gaze estéril. Em seguida, devolva o animal à sua gaiola com monitoramento cuidadoso nas próximas semanas. Dezoito a vinte dias depois, insira um tubo capilar no canto medial do olho do animal leucêmico anestesiado.De 100 a 200 microlitros de sangue serão coletados do seio orbital para o tubo capilar. Remova o tubo e controle o sangramento com a aplicação suave de uma gaze estéril sobre o olho. Em seguida, transfira o sangue para um tubo com EDTA e mantenha o tubo sobre gelo até o isolamento das células mononucleares.Para isolar as células mononucleares do sangue, adicione primeiro PBS suplementado com um milimolar de EDTA até um volume final de 500 microlitros. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de microcentrífuga. Depois, use uma seringa de um mililitro equipada com agulha de 30 graus para aplicar cuidadosamente 500 microlitros de solução separadora sob o sangue, tomando cuidado para não misturar as camadas.Se pare as células por centrifugação e use uma pipeta para transferir a camada branca opaca de células mononucleares para um novo tubo de microcentrifugação. Em seguida, lave as células imunes em um mililitro de PBS. Centrifugue-as e re-suspenda o pellet em 600 microlitros de tampão FACS para coloração e análise por citometria de fluxo.Para isolar a medula óssea, coloque o camundongo de costas sobre uma placa de plástico e fixe as patas do animal. Desinfete o animal com etanol 70%. Em seguida, corte cada pata na parte superior do fêmur acima da articulação e puxe suavemente as tíbias para separá-las dos fêmures.Use pin&ccedil;as e tesoura para remover a pele e os m&uacute;sculos dos ossos e transfira os ossos para uma placa de Petri sobre gelo. Use a tesoura para remover as extremidades. Em seguida, insira uma agulha de calibre 26 acoplada a uma seringa de 10 mililitros contendo cinco mililitros de PBS frio na extremidade de um osso por vez e lave as medulas &oacute;sseas para dentro da placa.Passe a suspensão celular através da ponta da agulha várias vezes para romper as células da medula óssea. Em seguida, filtre as células através de um novo filtro de 70 microns para um tubo cônico de 50 mililitros para obter uma suspensão de células simples. Centrifugue as células e re-suspenda o pellet em dois mililitros de tampão de lise.Encha imediatamente o tubo com até 50 mililitros de PBS frio e centrifugue as células. Em seguida, re-suspenda o pellet de medula óssea a uma concentração de um vezes 10 à sexta potência de células por mililitro em tampão FACS frio. Para preparar as células da medula óssea para coloração, primeiro coloque lâminas em câmaras descartáveis com cartões-filtro pré-anexados e posicione as câmaras em uma citocentrifuga.Adicione 100 microlitros de tampão FACS a cada câmara do cartão com filtro e centrifugue brevemente as lâminas. Ao final da centrifugação, adicione 100 microlitros de células a cada câmara e centrifugue as células. Em seguida, remova cuidadosamente as lâminas das câmaras para secagem ao ar.Para corar as células da medula óssea, mergulhe as lâminas em um frasco Coplin contendo solução de May-Grunwald por cinco minutos. Em seguida, transfira as lâminas para um frasco com solução tampão de pH 6,8 por um minuto. Depois, transfira as lâminas para a solução de Giemsa R por 10 minutos.Em seguida, realize uma lavagem de 10 segundos com água neutra em pH. Após a lavagem, deixe as lâminas secarem ao ar e adicione uma gota de meio de montagem a cada amostra. Então, posicione uma borda de uma lamínula sobre a lâmina e abaixe cuidadosamente a lamínula sobre as células, pressionando suavemente para remover quaisquer bolhas de ar.Em comparação com os animais controle, os animais injetados com células C1498 exibem uma infiltração maciça de células C1498 na medula óssea, observada pela aparência de blastos dessas células. As células C1498 que infiltram a medula óssea demonstram fenótipos monocíticos e granulocíticos, indicativos de células monoblásticas e mieloblásticas, respectivamente, características da leucemia mielomonocítica aguda. A análise citométrica de fluxo das frequências de células mononucleares em amostras de sangue de camundongos injetados com C1498 indica que aproximadamente um quarto da população total de leucócitos é composto por células leucêmicas.As frequências de linfócitos T e B são semelhantes entre animais controle e os injetados com C1498. As frequências de monócitos, no entanto, são observadas em níveis mais elevados em camundongos injetados com C1498, uma característica da leucemia mielomonocítica aguda. Ao realizar os procedimentos de citocromia e de May-Grunwald Giemsa, é importante lembrar-se de manter os valores de pH, temperaturas e tempos de incubação apropriados.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como caracterizar a leucemia mielomonocítica aguda. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de Hematologia explorarem a natureza das leucemias agudas espontâneas e induzidas em outros modelos animais.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

As células tumorais circulantes (CTCs) são prognóstico em vários tipos de câncer metastático. Este manuscrito descreve o sistema padrão ouro CellSearch (CSS) CTC plataforma enumeração e destaca os erros comuns erros de classificação. Além disso, dois protocolos adaptados são descritos para o marcador caracterização definida pelo usuário de CTCs e CTC enumeração em modelos de ratos pré-clínicos de metástase que utilizam esta tecnologia.

Adaptação do Semi-Automática de circulação Tumor de Células (CTC) Ensaios para aplicações clínicas e pré-clínica de Pesquisa

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Este manuscrito fornece uma descrição da metodologia usada para estabelecer modelos de camundongos de transdução-transplante. Um relato detalhado é dado de erros técnicos a serem evitados ao realizar transplantes de medula óssea. Deve-se obter uma compreensão clara da importância do alto título viral, transfecção/transdução e irradiação.

Transdução-Transplante Rato Modelo de neoplasia mieloproliferativa

Aqui, descrevemos os protocolos de validação genética e química de c-Fos e Dusp1 como um destino de droga em leucemia utilizando modelos in vitro e in vivo do mouse genética e humanizado. Esse método pode ser aplicado para qualquer destino para validação genética e desenvolvimento terapêutico.

Métodos para avaliar o papel de c-Fos e Dusp1 em dependência do Oncogene

Nós descrevemos um método para usar a citometria do fluxo do multiparâmetro para detectar a espécie reactiva mitochondrial do oxigênio (ROS) em pilhas hematopoietic saudáveis murino da haste e do progenitor (hspcs) e nas pilhas da leucemia de um modelo do rato da leucemia Myeloid aguda (AML) conduzida por MLL-AF9.

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

Este protocolo descreve o isolamento de timócitos duplo-negativos do timo de camundongo seguido de transdução retroviral e co-cultura no sistema de co-cultura de linhagem celular estromal de medula óssea delta-like 4 (OP9-DL4) para análise funcional adicional.

Co-cultura e transdução de timócitos murinos em células estromais delta-like 4 expressando para estudo de oncogenes em leucemia de células T

Aqui, a injeção intraperitoneal de células leucêmicas é utilizada para estabelecer e propagar a leucemia mieloide aguda (LMA) em camundongos. Este novo método é eficaz no transplante seriado de células da LMA e pode servir como uma alternativa para aqueles que podem experimentar dificuldades e inconsistências com a injeção intravenosa em camundongos.

Transplante Intra-Peritoneal na Geração de Leucemia Mielóide Aguda em Camundongos

Este é apresentado um protocolo detalhado para isolar e caracterizar populações microambientais da medula óssea de modelos murinos de síndromes mielodisplásicas e leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica alterações no nicho da medula óssea não hematopoiética, incluindo as células endoteliais e estromais mesenquimais, com a progressão da doença.

Identificação de Populações Microambientais de Medula Óssea na Síndrome Mielodisplásica e Leucemia Mielóide Aguda

O protocolo tem como objetivo descrever um modelo de camundongo para gerar recidivas de leucemia linfoblástica aguda, com base na dinâmica da resposta à quimioterapia de indução.

Modelo Murino de Leucemia Recaída para Quimioterapia de Indução para Leucemia Linfoblástica Aguda

Aprenda a caracterizar células C1498 murinas e a leucemia mielomonocítica aguda induzida em camundongos usando citometria de fluxo e coloração de May-Grünwald Giemsa. Este modelo animal facilita o estudo de mecanismos da doença.

Um protocolo detalhado para caracterizar a linhagem celular murina C1498 e seu Modelo Associated leucemia mouse

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