Name: Incorporação específico de resíduos de não-canônicos Aminoácidos em proteínas modelo Usando um Escherichia coli Sistema de transcrição-tradução livre-Cell (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a incorporar aminoácidos não-canônicos em proteínas modelo usando um sistema de transcrição-tradução livre de células de Escherichia coli. Este método permite análises detalhadas em biologia estrutural e engenharia de proteínas.

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E.G. Worst e A. Ott reconhecem o apoio financeiro da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro do centro de pesquisa colaborativa SFB 1027, bem como da Universidade de Saarland. E.G. Worst, A. Ott e V. Noireaux reconhecem ainda a ajuda financeira da Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). Os autores agradecem a Tobias Baumann e Stefan Oehm (Instituto de Química, Technische Universität Berlin) pela leitura crítica.

Os autores não têm nada a divulgar.

An-fácil de usar sistema de expressão livre de células como uma estratégia viável ao resíduo especificamente incorporar NCAAs em proteínas, é apresentado. Para este fim, o extracto em bruto é suplementado com codificação de ADN do vector para a proteína de interesse, o acumulador de energia e os aminoácidos correspondentes. Note-se que o volume da alíquota de extracto em bruto depende da concentração de proteína extracto em bruto 34. A eficiência de expressão isento de células é optimizado dependendo da concentração construção de ADN vector. Os volumes dos componentes do tampão de energia variam em função da optimizado Mg- e concentrações de K-glutamato a fim de permitir rendimentos elevados da proteína expressa modelo livre de células. Uma avaliação preliminar da experiência de incorporação pode ser obtida através da realização de SDS-PAGE do meio reaccional isento de células não purificado. Para uma análise mais detalhada, espectroscopia de massa HPLC-ESI é proposto como um meio para verificar se há incor completa, específica do resíduoporação da NCAA. Como preparação para o último, sistemas de colunas de spin são utilizados para permitir a purificação His-tag e troca de tampão com os pequenos volumes que usamos neste protocolo. Incluindo espectroscopia de massa de HPLC-ESI, todo o protocolo pode ser realizado no prazo de 2 dias. Ele não inclui quaisquer medidas particularmente críticos. No entanto, optimizações concentração de Mg e K-glutamato, bem como de um vector de ADN são cruciais, de modo a expressar altos rendimentos de proteína modelo. A utilização do vector de expressão altamente eficiente pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 é fortemente recomendado. Eluição de marcadas com His proteínas é geralmente devido à alta concentração de imidazol (&gt; 150 mm) e outros sais, tais como NaH 2 PO 4 (&gt; 300 mm) ou NaCl (&gt; 50 mM) que geram alto ruído de fundo na análise espectroscópica de massa 49 . Intercâmbio desses buffers de eluição com um tampão de armazenamento de proteína adequado estabiliza o modelo protee reduz drasticamente o ruído de fundo durante a análise espectroscópica de massa. Como resultado, é possível substituir Arg na todas as seis posições dentro do modelo de proteína. No sistema de expressão, não há resíduos de Arg pode ser detectada. Isto simplifica a incorporação específica do resíduo de Arg análogos em comparação com outros sistemas de expressão que necessitam de novas estratégias de depleção 29,30. A abordagem livre de células apresentou contorna as limitações inerentes in vivo abordagens que são devido à toxicidade Can, ou a forte dependência da sequência de mRNA em estratégias de produção única de proteínas 24,31. Contrariamente à empregada no sistema in vitro, a clivagem in vivo de Can para homosserina e hydroxyguanidine ocorre 31. No entanto, o sistema isento de células retém uma quantidade suficiente de Lys para competir com análogos tais como Hyl. A análise de espectroscopia de massa de HPLC-ESI mostra que a proteína modelo contém ambos, a Canonical, bem como o análogo não-canônico em diferentes proporções. A incorporação específica do resíduo de Lys é possível em geral, mas por substituição completa, novas estratégias de esgotamento, ou RAA especialmente projetados e ARNt optimizado para o reconhecimento de NCAAs precisa ser desenvolvida. Obtivemos excelentes rendimentos de proteínas expressas, modelo modificados isentos de células por adição do NCAA na mesma concentração que os canónicas. A eficácia de incorporação depende da natureza do NCAA a ser incorporados. Mesmo rendimentos mais elevados ainda pode ser realizável através da optimização da concentração da NCAA. Os resultados apresentados demonstram a aplicabilidade do sistema utilizado para a incorporação específica do resíduo de NCAAs enquanto eles são aceitos pelo sistema translacional endógena canônico. Para a incorporação específica do resíduo de NCAAs específicos, mais um necessidades para verificar se os resíduos da distur CAA análogaB, o sistema de expressão. Sistemas de transcrição-tradução isentos de células podem ser manipuladas de diferentes organismos que respondem a diferentes exigências 54. O toda E. coli mecanismos de transcrição-tradução do sistema isento de células aqui apresentadas permitir a utilização do bacteriófago e E. os promotores de E. coli, e que pode actuar em paralelo ou consecutivamente nas cascatas de 55. A aplicabilidade geral e usabilidade tornar o método uma potente ferramenta para futuras pesquisas em toxicidade de aminoácidos e aplicação terapêutica.

O código genético é universal para a biosfera. Ele codifica para um conjunto de 20 aminoácidos canónicos, que às vezes é prorrogado por selenocisteína 1 ou 2 pyrrolysine. É o que se traduz ribossoma do código genético, com a ajuda de ARNt em cadeias de aminoácidos que se dobram em proteínas. Os grupos funcionais dos aminoácidos canónicos, em combinação com modificações pós-tradução, contribuem para uma gama excepcionalmente ampla de 3,4 a função da proteína. Em princípio, as limitações funcionais devido ao conjunto limitado de aminoácidos canónicos pode ser superado mediante a incorporação de mais, aminoácidos não-canónicos (NCAAs) que permitem novos produtos químicos e novas funcionalidades 3,4. Existem duas abordagens complementares para a incorporação de: a NCAAs site- ou a incorporação específica do resíduo. O primeiro método implica dificuldades técnicas consideráveis, uma vez que o conjunto de canônica de aminoacil-tRNA-synthetases (RAA) e tRNAs deve ser expandido por um par RAA-ARNt ortogonal que não deve interagir com o endógena máquinas de tradução. Com base em engenharia cuidadosa, esta abordagem incorpora os NCAAs como mutações pontuais nos locais de proteína desejada. Incorporação específica do local de NCAAs é geneticamente codificado por um codão que não é atribuído a um ácido amino canónica (CAA), normalmente um codão de terminação a 5-9. Este método implica alterações na função em um determinado site, em vez de ao longo de toda a proteína 10-13. Em contraste, a incorporação específica do resíduo baseia-se no reconhecimento erróneo do aminoácido não-canônico pela maquinaria de tradução canónica. A incorporação ocorre devido à falta de especificidade para o substrato das RAA. A incorporação específica do resíduo de NCAAs, construída sobre o trabalho de Cohen e colegas de trabalho de 14, levou a aplicações importantes 3,10, entre eles rotulagem bio-ortogonal 15-17 de proteínasou elucidação da estrutura de proteínas em cristalografia de raios X 18. Como RAA naturais geralmente preferem sua aminoácido cognato mais de uma NCAA isoestrutural, eficientes na incorporação específica do resíduo vivo geralmente requer um hospedeiro de expressão auxotrï¿½ica não é capaz de sintetizar o analógico canônica da NCAA. As células hospedeiras são cultivadas em meio de crescimento, que proporciona apenas uma baixa concentração do análogo CAA. Seu esgotamento em combinação com a suplementação consecutivo, com a NCAA força o hospedeiro de expressão para incorporar o NCAA na proteína modelo em vários locais, canonicamente prescritos. Em contraste com a abordagem de local específico, este geralmente tem um profundo impacto sobre toda a estrutura da proteína, conduzindo a modificado consideravelmente as propriedades físicas e químicas de proteínas 19,20. No entanto, a maior parte do NCAAs são inibidores do crescimento para o hospedeiro de expressão a 3, em que são incorporados em muitos outros Proteins, além daqueles de interesse durante a expressão do gene recombinante. Isto limita claramente a abordagem in vivo. A incorporação in vivo de aminoácidos que são tóxicos ou têm uma forte influência sobre a estrutura da proteína permanece um desafio especial. No entanto, estas moléculas estão entre os mais promissores para a engenharia de proteínas com funções extraordinárias. Um exemplo é o tóxico, não-canônico, que ocorrem naturalmente L-canavanina (CAN), um análogo da L-arginina (Arg). Ela afeta e blocos Arg caminhos de reação de regulação e catalíticos associados, e sua presença na célula viva pode levar a morte imediata 3,21-23. A sua incorporação em proteínas nas posições de arginina pode reduzir a estabilidade da proteína 21-23. Devido à toxicidade resultante, a expressão de proteínas contendo canavanina em Escherichia coli (E. coli) e outros hospedeiros de expressão comum continua a ser um desafio. Por estas razões, completo in vivo, incorporation de Can em todas as posições Arg foi adequadamente confirmada apenas uma vez 24, utilizando um sistema de produção de single-proteína elaborado. No entanto, pode tem sido proposta como um agente anti-cancro 25-27, e como um estimulador de doenças autoimunes em seres humanos 28. Além disso, é objecto de vários estudos sobre a sua actividade anti-metabólica, antibacteriano, antifúngico e as propriedades antivirais 25. Estas propriedades levantar uma demanda por eficiente e fácil de executar métodos para expressar Pode contendo proteínas para farmácias e estudos funcionais. Apesar de muitos problemas que estão ligados à produção in vivo pode ser contornado usando sistemas de expressão livre de células, nas abordagens específicas de resíduos in vitro só foram pouco explorados. A incorporação específica do resíduo isento de células de um análogo de L-triptofano e 29 múltiplos NCAAs 30 têm sido relatados. Estes métodos baseiam-se no altamente effictário polimerase de ARN de T7. A polimerase de ARN T7 de bacteriófago implica a transcrição semelhante, reduzindo assim a funcionalidade genético em comparação com a transcrição endógena. A incorporação específica do resíduo completo de lata em um modelo de proteína em todas as posições Arg Recentemente, foi relatado 31, utilizando um sistema de expressão isento de células 32. Uma ligeira modificação do mesmo sistema permitiu a incorporação específica do local de diferentes análogos de pirrolisina em um modelo de proteína através de codão de terminação de supressão de 33. O sistema livre de células empregadas 31-33 é baseado em um todo E. coli sistema de transcrição-tradução. No entanto, permite a expressão da proteína de forma tão eficiente como nos sistemas actuais de bacteriófagos (0,5 - 1 mg / ml de proteína recombinante) 32, enquanto retém a maior parte do original modularidade de transcrição-tradução. Neste trabalho, um protocolo detalhada é fornecida sobre a forma como o residincorporação de UE específicos de NCAAs pode ser realizado, utilizando tudo isto E. sistema livre de células coli 32. Além disso, são propostas novas medidas para preparar as proteínas expressas para avaliação adequada via espectroscopia de massa HPLC-ESI. Para expandir as propriedades deste sistema isento de células, este trabalho não se refere apenas à incorporação publicada de Can 31, mas também apresenta novos dados relacionados com a não-canônico L-lisina analógico L-hidroxi-lisina. O protocolo seguinte para a incorporação específica do resíduo de NCAAs é uma adaptação de um protocolo recentemente publicado em 34 JoVE. O último protocolo descreve como realizar a expressão isento de células altamente eficiente com aminoácidos padrão. Além disso, apresenta-se a preparação do extracto em bruto livre de células, a solução de amino ácido, a solução de reserva de energia e o tampão de energia utilizada nesta abordagem. O protocolo seguinte concentra-se em passos modificados em comparação com o anterior Protocolo, a fim de permitir a incorporação específica do resíduo de NCAAs. pipetas calibradas, dicas de ligação baixas pipetas e tubos de micro-centrífuga são recomendados para a preparação. No que se segue, as abreviaturas IUPAC para os aminoácidos são utilizados.

<table><tbody><tr><td>Óculos de proteção</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z758841</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo (tamanho S)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z768960</td><td>Números de catálogo outros tamanhos: Z768979 para M, Z768987 para L e Z768995 para XL</td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean)</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>30123.328</td><td></td></tr><tr><td>Microbalance Discovery DV114CM</td><td>Ohaus, Greifensee, Suíça</td><td>80104140</td><td></td></tr><tr><td>Microespátula (L 6 5/8 pol., aço inoxidável, diâmetro da haste 0,09 pol.)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z243213</td><td></td></tr><tr><td>L-Canavanine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>C9758</td><td>Toxicidade aguda: use protetores oculares, máscara contra poeira, luvas de proteção</td></tr><tr><td>Hidroxilisina (mistura racêmica)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>H0377</td><td></td></tr><tr><td>Luvas criogênicas (tamanho S, resistente à água)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z183490</td><td>Números de catálogo outros tamanhos: Z183512 para M, Z183520 para L e Z183539 para XL</td></tr><tr><td>RTS Amostrador de Aminoácidos</td><td>Biotechrabbit, Hennigsdorf, Alemanha</td><td>BR1401801</td><td>Para preparação caseira de soluções estoque de aminoácidos, siga este protocolo35 e use o kit de aminoácidos sólidos LAA21-1KT, L-prolina (81709-25G), L-cisteína (30089-25G), L-histidina (53319-25G) e L-lisina (L5501-5G)&nbsp; (todos da Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Affymetrix, Santa Clara, USA</td><td>23160</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (de E. coli, tamanho da embalagem 100 mg)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>10109541001</td><td>O número de catálogo para embalagem de 500 mg é 10109550001</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>NAD (de levedura)</td> <td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>A9501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500</td><td>Addgene, Cambridge, EUA</td><td>Plasmídeo #40019</td><td></td></tr><tr><td>4-20% de géis pré-moldados de Tris-Glicina (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 pratos)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemanha</td><td>TG 81610</td><td></td></tr><tr><td>SDS running buffer (10 x concentrado, 5.000 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemanha</td><td>TG 50001</td><td></td></tr><tr><td>SDS loading buffer (2 x concentrado, 50 ml)</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemanha</td><td>TG 05002</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de proteína não corado, ampla gama (2-212 kDa)</td><td>New England Biolabs, Ipswich, EUA</td><td>P7702S</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>1060091011</td><td>Tóxico por inalação, em contacto com a pele e em caso de ingestão: use luvas de proteção e trabalhe sob a hotte</td></tr><tr><td>Ácido acético (99,8%)</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>20104.447</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250 (10 g)</td><td>Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Alemanha</td><td>902120</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep de proteína His-Spin</td><td>Zymo Research Europe, Freiburg, Alemanha</td><td>P2002</td><td>Produto também distribuído pela Zymo Research Corporation, Irvine, EUA&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, 99%</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>24397.296DB</td><td></td></tr><tr><td>CentriPure Z25 mini colunas giratórias</td><td>Genaxxon bioscience, Ulm, Alemanha</td><td>CP-0205-Z100</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Concentrator 5301</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5301 000.210</td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals, Santa Ana, USA</td><td>113012032</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de batimento de contas (microvials de polipropileno)</td> <td>Biospec, Bartlesville, USA</td><td>522S</td><td></td></tr><tr><td>Beads, 0.1&nbsp; mm de diâmetro.</td><td>Biospec, Bartlesville, EUA</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli cepa</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de proteína Bradford BSA</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Alemanha</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes, 1.5&nbsp; ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Colunas de Cromatografia</td><td>Bio-Rad, M&uuml; nchen, Alemanha</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>Placas inferiores ópticas Nunc de 384 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>Fita de vedação Nunc</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega, Madison, EUA</td><td>V3011</td><td></td></tr><tr><td>Solução dibásica de fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>Solução monobásica de fosfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>de diálise Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; L garrafa de centrífuga</td><td>Beckman-Coulter, Brea, USA</td><td>A98813</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; L Erlenmeyer</td><td>Kimble Chase, Vineland (NJ), EUA</td><td>26500-4000</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26XP centrífuga</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EUA</td><td>393127</td><td>Ou centrífuga equivalente capaz de centrifugar garrafas de 1 L.</td></tr><tr><td>Agitador orbital Forma 480</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>480</td><td>Ou agitador equivalente capaz de agitar o tamanho do peito 6 x 4 L .</td></tr><tr><td>Rotor JLA-8.1000</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EUA</td><td>363688</td><td>Ou rotor equivalente a 5.000 x g para a centrífuga acima, capaz de centrifugar garrafas de 1 L.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>Biospec, Bartlesville, EUA</td> Microcentrífuga refrigerada <td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R</td><td>Beckman-Coulter, Brea, EUA</td><td>368831</td><td>Ou centrífuga equivalente capaz de centrifugar tubos de reação de 2 ml.</td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento HLC HBT 130</td><td>Labexchange, Burladingen, Alemanha</td><td>24465</td><td>Ou bloco de aquecimento equivalente capaz de aquecer amostras em tubos de reação até 100 °C.</td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf MiniSpin</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Alemanha</td><td>5452000018</td><td>Ou centrífuga equivalente capaz de centrifugar tubos de reação de 2 ml.</td></tr><tr><td>IKA Vortex 3 (diâmetro do agitador orbital de 4 mm, 0 - 2.500 rpm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z654760</td><td>Ou vórtice equivalente.</td></tr><tr><td>Máquina de flocos de gelo Scotsman AF103</td><td>K&auml; lte-Berlin, Berlim, Alemanha</td><td>AF103</td><td>Ou máquina de flocos de gelo equivalente.</td></tr><tr><td>Mini incubadora digital MyTemp</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z763314</td><td>Ou incubadora equivalente capaz de aquecer amostras a 29 °C.</td></tr><tr><td>Célula / câmara de eletroforese EcoCell</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemanha</td><td>AN12005</td><td>Ou câmara de eletroforese equivalente capaz de realizar eletroforese em gel vertical com os géis pré-moldados acima ou outros géis usados.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação Power-phor para célula / câmara de eletroforese</td><td>Anamed Elektrophorese, Gro&szlig;-Bieberau / Rodau, Alemanha</td><td>AN12001</td><td>Ou fonte de alimentação equivalente capaz de fornecer célula / câmara de eletroforese usada acima com energia</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>613-5278</td><td>Ou micropipetas equivalentes que permitem pipetar volumes semelhantes com a mesma precisão</td></tr><tr><td>VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>613-5279</td><td>Ou micropipetas equivalentes que permitem pipetar volumes semelhantes com a mesma precisão</td></tr><tr><td>Pipetman Tips Diamond D10ST (0,1 - 10 &micro; l)</td> <td>Gilson, Middleton, EUA</td><td></td><td>F171101 Ou pontas de pipeta equivalentes de baixa ligação que permitem pipetar volumes semelhantes com a mesma precisão</td></tr><tr><td>Pontas Pipetman Diamond D200ST (2 - 200 &micro; l)</td> <td>Gilson, Middleton, EUA</td><td></td><td>F171301 Ou ponteiras de pipeta equivalentes de baixa ligação que permitem pipetar volumes semelhantes com a mesma precisão</td></tr><tr><td>Ponteiras Pipetman Diamond D1000ST (100 - 1.000&nbsp; &micro; l)</td><td>Gilson, Middleton, EUA</td><td>F171501</td><td>Ou ponteiras de pipeta equivalentes de baixa ligação que permitem pipetar volumes semelhantes com a mesma precisão</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 ml com tampas de rosca (estéreis)</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>50-0156</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml com tampas de rosca (estéreis)</td><td>VWR International, Darmstadt, Alemanha</td><td>525-0150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de 14 ml (fundo redondo, tampa de ventilação de duas posições, estéril)</td><td>Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha</td><td>187262</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de HPLC Discovery BIO Wide Pore C5 (3 &micro; m tamanho de partícula, L x I.D. 10 cm x 2,1 mm)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>567227-U</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC machine Agilent</td><td>Technologies, Santa Clara, EUA</td><td>G1312B</td><td></td></tr><tr><td>Série 6500 Tempo de voo quadrupolo de massa precisa (Q-TOF) LC/MS</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, EUA</td><td>G6530BA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>270717</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech, Ortenberg, Alemanha</td><td>415-101</td><td>Ou leitor de microplacas equivalente capaz de medir a fluorescência do medidor de pH Hanna Checker da proteína modelo expressa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>Z351091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aditivo de eluente de ácido fórmico para LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA</td><td>56302</td><td></td></tr></tbody></table>

incorporação específico de resíduos de não-canônicos aminoácidos em proteínas modelo usando um<em&gt; escherichia coli</em&gt; sistema de transcrição-tradução livre-cell

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

O conjunto canónico de aminoácidos leva a uma excepcionalmente ampla gama de funcionalidades proteína. No entanto, o conjunto de resíduos ainda impõe limitações sobre os pedidos de proteínas potenciais. A incorporação de aminoácidos noncanonical pode ampliar este âmbito. Existem duas abordagens complementares para a incorporação de aminoácidos não-canónicos. Para a incorporação específica do local, para além dos mecanismos endógenos de translação canónicos, um par aminoacil-ARNt-sintetase-ARNt ortogonal deve ser desde que não interage com os canónicas. Por conseguinte, um codão que não é atribuído a um aminoácido canónica, geralmente um codão de terminação, também é necessário. Esta expansão código genético permite a incorporação de um aminoácido não-canônico a uma única, dado local no interior da proteína. O trabalho aqui apresentado descreve a incorporação específica do resíduo onde o código genético é transferido dentro do sistema translacional endógeno. A maquinaria de tradução umccepts o aminoácido não-canônico como um substituto para incorporá-lo em locais canonicamente prescrita, ou seja, todas as ocorrências de um aminoácido na proteína canónica são substituídos por um não-canônico. A incorporação de aminoácidos noncanonical pode alterar a estrutura da proteína, fazendo com que as propriedades físicas e químicas consideravelmente modificadas. Análogos de aminoácidos noncanonical muitas vezes actuam como inibidores de crescimento de células de hospedeiros de expressão, uma vez que modificar proteínas endógenas, o que limita na produção de proteínas in vivo. In vivo, a incorporação de aminoácidos em proteínas tóxicas noncanonical permanece um desafio especial. Aqui, é apresentada uma abordagem isenta de células para uma completa substituição de L-arginina por o aminoácido L-canavanina não-canônico. Isso evita as dificuldades inerentes de expressão in vivo. Além disso, um protocolo para a preparação de proteínas alvo para a análise de espectro de massa está incluído. Mostra-se que a L-lisina pode ser substituída por L-hidroxi-lisina,embora com menor eficiência. Em princípio, qualquer análogo de aminoácido não-canônico podem ser incorporados utilizando o método apresentado enquanto o endógena in vitro sistema de tradução que reconhece.

Este protocolo orienta através da incorporação específica do resíduo livre de células de NCAAs em proteínas modelo. Propõe SDS-PAGE para uma avaliação preliminar do experimento constituição e novas medidas para preparar as proteínas modelo para uma análise espectroscópica de massa HPLC-ESI adequada. Aqui, os resultados representativos da incorporação específica do resíduo isento de células do análogo Arg Can, bem como o análogo de L-Lys hidroxi-lisina (Hyl) são apresentados. As soluções de aminoácidos diferentes, o acumulador de energia, o ADN que codifica para o vector de proteína modelo e reacções livres de células são preparados como descrito acima. A reacção isento de células de referência é fornecida com a solução de amino ácidos consistindo de 20 CAA. Para cada experiência, uma reacção isento de células de controlo negativo é fornecido com a solução de aminoácido que não possui o análogo canónica do NCAA em questão. Para cada aproxoach, uma reacção isento de células exprime a proteína modelo na presença da solução de aminoácidos, em que a CAA é substituído por o análogo não-canônico. His-marcador de purificação, a troca de tampão e a análise por espectrometria de massa de HPLC-ESI são executadas de acordo com o protocolo descrito acima. A proteína é o modelo do terminal C marcada com His deGFP 32, uma versão truncada da EGFP 53. A sua carta uma sequência de aminoácidos podem ser encontradas em (material suplementar 2). Esta proteína contém 6 ​​modelo Arg e Lys 18 posições, respectivamente. O vector de expressão é pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. No caso de incorporação completa da NCAA, pode-se supor que a reacção de controlo negativo não expressa deGFP, uma vez que um dos 20 CaaS está faltando. Contrariamente, deve ser deGFP detectável nas outras duas reacções: a uma nativa na referência de reacção isento de células e a proteína modificada na reacção isento de células que é fornecido com o NCAA. A Figura 1A mostra a avaliação preliminar de SDS-PAGE da experiência de incorporação pode. A reacção isento de células de referência tem o nível de expressão mais elevado deGFP. Na reacção isento de células que é fornecido com Can, deGFP é expresso na concentração ligeiramente inferior. Nenhuma expressão deGFP pode ser detectado no controlo negativo. Este resultado SDS-PAGE é uma boa indicação para uma incorporação bem sucedida de Can no deGFP proteína alvo. Para provar a incorporação completa hipótese de lata em deGFP, ambas as proteínas purificadas modelo, visualizados na Figura 1B, são analisadas através de espectroscopia de massa HPLC-ESI. Figura 1C mostra o espectro de massa deconvoluídos das moléculas deGFP purificados. A massa deconvoluídos de degF<html> P, que é expresso na reacção isento de células de referência é 26,192.8 Da. Para deGFP expresso na lata contendo reacção livre de células de uma massa de 26202,5 ​​Da aparece. As massas esperado para o deGFP6Arg nativo eo deGFP6Can modificado com Arg ser totalmente substituída por Can são 26.193 Da e 26204 Da, respectivamente. A diferença de massa de 1,5 Da para deGFP6Can está dentro do erro de desconvolução espectro. Assim, a incorporação plena da lata em deGFP em todas as posições 6 Arg é confirmada. Os dois picos de intensidade reduzida correspondem ao deGFP6Arg nativa e deGFP6Can modificadas que não atingiram os seus fluoróforo maduro. O fluoróforo é autocataliticamente gerado por eliminação de uma molécula de H2O, seguido de oxidação. Isto leva a uma massa aumentada por 20 Da Se este processo não prossiga. pg &quot;/&gt; Figura 1. A avaliação de SDS-PAGE da experiência é possível a incorporação e espectroscopia de massa de HPLC-ESI das moléculas deGFP expressos e purificados isentos de células. (A) Avaliação Preliminar do experimento pode incorporação utilizando SDS-PAGE. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, reação livre de células de referência, de controlo negativo e reação livre de células fornecer pode, em vez de Arg. (B) SDS-PAGE após His-tag purificação e troca de tampão das moléculas deGFP expressas. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, deGFP purificada a partir da reação de referência, purificado deGFP a partir da reação Can contendo. (C) A confirmação da plena incorporação de Can por espectroscopia de massa HPLC-ESI. As massas esperados do deGFP nativo eo deGFP modificado com Arg totalmente substituída por Can são 26.193 Da e 26204 Da, respectivamente. Cada espectro é normalizado para a sua maior intensidade (contagem). as posições dos picos são indicadasem Da. Para efeitos de visualização, as pistas de gel são extraídos a partir das imagens do gel, unidas entre si, são convertidos em formato de escala cinzenta, tamanho é optimizada e de contraste, assim como brilho são reforçadas. Pistas de gel originais são apresentados no material suplementar 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> A Figura 2A mostra a avaliação preliminar de SDS-PAGE da experiência incorporação Hyl. Na reacção isento de células que é fornecido com Hyl, deGFP é expresso. Contrariamente ao primeiro experimento, uma banda deGFP fraco pode ser observado na reacção de controlo negativo. Isto pode ser devido à presença de resíduos Lys nas reacções isentos de células. Isso permite que uma expressão deGFP fraco na reacção de controlo negativo, onde nem Lys nem Hyl são adicionados. para H<html> Espectroscopia de massa-ESI PLC, as moléculas deGFP da reacção isento de células fornecidos com Hyl são purificadas e o tampão é trocado (Figura 2B). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig2.jpg" /> Figura avaliação 2. SDS-PAGE do experimento incorporação Hyl (A) Da esquerda para a direita:. Reacção livre de células de controlo negativo, a reação livre de células contendo Hyl e padrão de proteína. (B) SDS-PAGE após His-tag purificação e troca de tampão das moléculas deGFP expressas. Da esquerda para a direita: Purified deGFP do Hyl contendo reação e padrão de proteína. Para efeitos de visualização, as pistas de gel são extraídos a partir das imagens do gel, unidas entre si, são convertidos em formato de escala cinzenta, tamanho é optimizada e de contraste, assim como brilho são reforçadas. pistas de gel originais são apresentados no material suplementar 3.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. A Figura 3 mostra o espectro de massa de moléculas deconvoluídos deGFP purificadas. A Figura 3A confirma a hipótese de os resíduos de Lys já presentes nas reacções isentos de células. O pico predominante do espectro corresponde ao nativo (massa esperada: 26,193 Da) deGFP. Mais uma vez, as moléculas de um deGFP Da maior massa 20 que não desenvolvem a sua fluoróforo pode ser detectada. Os resíduos Lys são preferencialmente carregadas no ARNt Lys pela lisil-ARNt-sintetase que conduz a um nível de expressão elevado dos deGFP18Lys nativas. A diferença de massa entre Hyl e Lys é de 16 Da. Devido à presença de Hyl que está em competição com os resíduos de Lys todas as espécies deGFP possíveis são gerados (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl 2Lys +) (Figura 3B). É certo que, o pico de deGFP1Hyl + 17Lys sobrepõe-se com o pico do deGFP nativo que não produzem a sua fluoróforo (Figura 3A) e a massa de alguns picos difere mais do que 2 Da da massa esperada. Estas diferenças de massa pode ser atribuída à alta ruído devido aos baixos valores da espécie deGFP. No entanto, Hyl é geralmente incorporado por o sistema isento de células. Outras melhorias têm de ser feitas para abolir resíduos Lys nas reações livre de células. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273fig3.jpg" /> . Figura 3. A HPLC-ESI espectroscopia de massa das moléculas deGFP purificadas da reacção isento de células contendo Hyl (A) Os deGFP18Lys nativas é detectada predominantemente (massas esperadas com fluoróforo: 26193 Da, sem fluoróforo madura 26213 Da). (B)Ampliação revela a existência de todas as espécies deGFP possíveis (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Suas massas são esperados 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). O espectro é normalizado para a sua maior intensidade (contagem). As posições dos picos são indicadas em Da. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig1.jpg" /> Material Suplementar 1. modelo de cálculo. Na seção 2, a preparação da mistura principal tampão de energia é exemplificado utilizando alíquotas de extrato bruto de 30 ul e óptima MG- e concentrações K-glutamato de, respectivamente, 3 mm e 30 mm. Este exemplo conduz a um volume de mistura principal que produz 3 aliquotas acumulador de energia. no secção 3, a preparação da reacção livre de células é exemplificado usando uma solução de 90 estoque DNA nM levando a uma concentração de DNA vector ideal de 10 nM na reacção livre de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/cell-free_calculations_JoVE_11.03.2016_final.xlsx" target="_blank">Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.</a> Para obter uma rastreabilidade adequado, a utilização do modelo de cálculo é exemplificado por inserção destes valores típicos que diferem do exemplo acima: em bruto de volume de extracto: 28? L, óptima de Mg-glutamato: 2 mm, óptima K-glutamato: 40 mm, Número de alíquotas de amortecimento desejadas: 100, concentração ideal do vetor em reação livre de células: 8 nM, DNA solução de stock vector: 150 nM. Primeiro entre 28 ul como o volume de extrato bruto no campo de laranja da primeira seção do modelo. Em seguida, entrar na segunda seção do modelo 2 mM umd 40 mM como ideal Mg e concentrações de K-glutamato nos campos de laranja. Tendo em conta o óptimo Mg e K-as concentrações, a composição de um acumulador de energia 15 ul, bem como um correspondente, ampliados alíquota de 16 uL é calculado. A seguir, em conformidade entrar 100 como número desejado de alíquotas de acumulador de energia (16 ul). O molde adapta-se os volumes dos diferentes componentes do tampão para a mistura principal de 1700 uL como se segue: 204 uL de solução de estoque de 100 mM de Mg-glutamato, 136 ul de solução de reserva 3 M K-glutamato, 728.73 ul de solução de energia 14x, 510 ul de 40% de PEG-8000 e 121.27 ul estéril DDH 2 O. Finalmente, na terceira secção de molde, entre 8 nM e 150 nM de concentração óptima no vector de reacção isento de células e, respectivamente, o ADN do vector de concentração da solução. O molde adapta-se os volumes dos diferentes componentes que devem ser adicionados aos 28 ul de extracto bruto para finalizar a preparao de um 90 ulreacção isento de células como se segue: 15 uL de tampão de energia, 15 ul de uma das 3 soluções de aminoácidos compostas de maneira diferente, 4,80 ml ​​de solução de ADN do vector (150 nM), e 27.20 ul de ddH 2 O. estéril <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig2.jpg" /> Material suplementar 2. Uma carta sequência de aminoácidos da proteína modelo deGFP. Esta proteína modelo contém 6 ​​Arg e 18 posições de Lys. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273supfig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54273/54273supfig3.jpg" /> Material suplementar 3. comprimento e pistas de gel não modificados que correspondem às imagens gel apresentou completa Figura 1 e 2. As pistas de gel apresentados em cada s individuais<html> ubfigure são extraídos a partir do mesmo gel de poliacrilamida SDS. Na Figura 1 e 2 estas pistas foram unidas para fins de apresentação. Os pesos moleculares das bandas de proteínas padrão está indicado ao lado das figuras. (A.1) pistas de gel não cortadas da figura 1A. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, reação livre de células de referência, de controlo negativo e reação livre de células fornecer pode, em vez de Arg. (A.2) pistas de gel não cortadas da Figura 1B. Da esquerda para a direita: padrão de proteína, deGFP purificada a partir da reação de referência, purificado deGFP a partir da reação Can contendo. (B.1) pistas de gel não cortadas da Figura 2A. Da esquerda para a direita: reacção livre de células de controlo negativo, a reação livre de células contendo Hyl e padrão de proteína. (B.2) pistas de gel não cortadas da figura 2B. Da esquerda para a direita: Purified deGFP do Hyl contendo reação e padrão de proteína.d 54273 / 54273supfig3large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um protocolo de expressão livre de células fácil de usar para a incorporação específica de resíduos de análogos de aminoácidos não canônicos em proteínas, incluindo análise a jusante, é apresentado para estudos médicos, farmacêuticos, estruturais e funcionais.

Incorporação específico de resíduos de não-canônicos Aminoácidos em proteínas modelo Usando um<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcrição-tradução livre-Cell

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

O objetivo geral deste procedimento é incorporar analógos de aminoácidos não canônicos de forma específica por resíduo em proteínas modelo utilizando um sistema de expressão livre de células e fornecer uma análise subsequente. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas farmacêutica médica e de biologia estrutural, como o papel dos aminoácidos não canônicos na estrutura proteica. A principal vantagem desta técnica é que, na ausência de qualquer hospedeiro vivo, aminoácidos tóxicos podem ser incorporados em proteínas modelo. Para iniciar o experimento, prepare soluções estoque completas dos 20 aminoácidos canônicos, ou CAAs, e da solução estoque previamente preparada do aminoácido não canônico, ou ncAA, em temperatura ambiente. Uma vez que as soluções tenham descongelado, vortexe-as frequentemente para redissolver aminoácidos precipitados e coloque os aminoácidos no gelo. Em seguida, transfira 1,4 mililitro de água estéril duplamente destilada para um tubo cônico de 15 mililitros e coloque-o no gelo. Adicione 175 microlitros de cada solução estoque de aminoácido, um após o outro, e vortexe bem o tubo após cada adição, colocando-o novamente no gelo. Após a adição de todos os aminoácidos, vortexe bem o tubo. Incube o tubo até que a solução fique tão clara quanto possível. Divida a solução-mãe de aminoácidos em três volumes iguais de 1,35 mililitro em tubos de reação de 1,5 ml e mantenha-os no gelo. Adicione 50 microlitros da solução estoque de 168 milimolar do CAA que é análogo ao ncAA ao primeiro volume dividido, para criar a solução de aminoácidos que contém os 20 CAAs completos. Vortexe bem a solução e depois coloque o tubo de volta no gelo. Aliquote a solução em tubos de reação e rotule-os como mais CAA. Congele rapidamente os alíquotas em nitrogênio líquido e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Em seguida, adicione 50 microlitros de água estéril duplamente destilada ao segundo volume dividido da mistura-mãe de aminoácidos para preparar uma mistura de aminoácidos que contenha 19 CAAs, vortexe bem a solução e coloque-a no gelo. Aliquote a solução e rotule os tubos como menos CAA. Finalmente, adicione 50 microlitros da solução estoque de 168 milimolar do ncAA ao último volume de 1,35 mililitro para preparar uma mistura de aminoácidos que contenha 19 CAAs e o ncAA. Vortexe bem a mistura e coloque-a de volta no gelo. Aliquote, rotule e congele os tubos. No gelo, descongele três alíquotas de 30 microlitros de extrato bruto, uma alíquota mais CAA, uma alíquota menos CAA e uma alíquota ncAA, três alíquotas de tampão energético e a solução de DNA do vetor. Coloque água estéril duplamente destilada no gelo. Em seguida, adicione 15 microlitros de tampão energético e pipete para cima e para baixo, e vortexe suavemente a solução para homogeneizá-la. Adicione 15 microlitros da alíquota da solução de aminoácidos mais CAA, 10 microlitros da solução de DNA do vetor de 90 nanomolar e 20 microlitros de água estéril duplamente destilada aos 30 microlitros de extrato bruto. Monte o controle negativo adicionando 15 microlitros de tampão energético, 15 microlitros de menos CAA, 10 microlitros da solução de DNA do vetor de 90 nanomolar e 20 microlitros de água estéril duplamente destilada aos 30 microlitros de extrato bruto. Prossiga com a reação ncAA combinando 15 microlitros de tampão energético, 15 microlitros de mais ncAA, 10 microlitros da solução de DNA do vetor de 90 nanomolar e 20 microlitros de água estéril duplamente destilada aos 30 microlitros de extrato bruto. Em seguida, incube todos os tubos. Dez minutos antes da corrida de SDS-PAGE, dilua um microlitro de cada uma das reações viscosas livres de células em quatro microlitros de água estéril duplamente destilada em tubos de reação. Vortexe bem e centrifugue brevemente os líquidos com uma mini centrífuga. Adicione cinco microlitros de tampão de carregamento 2X aos cinco microlitros da reação livre de células diluída. Vortexe bem e centrifugue os líquidos com uma mini centrífuga. Coloque os tubos de reação em um bloco de aquecimento e certifique-se de que as tampas estejam bem fechadas. Enquanto isso, transfira o tampão de corrida para a câmara de eletroforese em gel. Após o aquecimento, centrifugue os líquidos com uma mini centrífuga. Após a centrifugação, vortexe brevemente os tubos e repita a centrifugação. Transfira 15 microlitros do padrão proteico e 10 microlitros de cada amostra para os poços e inicie a eletroforese. Retire cuidadosamente o gel da cassete e fixe o gel por 30 minutos. Em seguida, transfira o gel para a solução de coloração por 60 minutos. Após a coloração, transfira o gel para a solução de descoloração por 60 a 120 minutos. Misture volumes iguais de tampão de ligação his e a reação livre de células e pipete a mistura para cima e para baixo. Em seguida, vortexe suavemente o tubo. Monte o sistema de coluna. Vortexe bem a solução estoque do gel de afinidade his até que a resina do gel esteja completamente dissolvida. Usando uma ponteira de pipeta de um mililitro, transfira 250 microlitros de resina de gel para a coluna. Centrifugue a coluna por cinco a 10 segundos a 13 a 15.000 vezes G. Certifique-se de que a resina do gel esteja completamente drenada e, em seguida, transfira 150 a 300 microlitros da mistura de reação livre de células com tampão de ligação his para a coluna. Centrifugue a coluna. Descarte o fluxo passante e coloque a coluna de volta no tubo de coleta. Adicione 250 microlitros de tampão de lavagem his, agite e vortexe suavemente a coluna para ressuspender a resina do gel. Centrifugue o tubo da coluna. Descarte o tubo de coleta e coloque a coluna em um novo tubo de reação padrão de 1,5 mililitro. Adicione 150 microlitros de tampão de eluição e ressuspender a resina do gel com batidas leves e vortexação suave. Em seguida, centrifugue a coluna para diluir a proteína purificada no tampão de eluição. Primeiro, remova a tampa inferior da coluna de filtração em gel e depois retire a tampa superior. Coloque a coluna em um tubo de lavagem de dois mililitros e centrifugue a coluna para remover o tampão de armazenamento do gel. Descarte o fluxo passante, depois adicione até 400 microlitros do tampão de armazenamento de proteína e centrifugue a coluna. Repita este passo uma vez para garantir que todo o tampão de armazenamento de proteína seja carregado no gel. Coloque a coluna em um tubo de coleta novo e adicione cuidadosamente até 100 microlitros da solução da proteína modelo purificada diretamente no centro do leito de gel. Centrifugue a coluna. Após a troca de tampão, coloque os 100 microlitros completos da solução de proteína modelo em um tubo aberto no concentrador de vácuo rotativo. Feche a tampa do concentrador e inicie a rotação a 30 graus Celsius. Este SDS-PAGE mostra a incorporação bem-sucedida da L-canavanina, ou Can, na proteína alvo deGFP, sendo que a reação livre de células de referência apresenta o nível mais alto de expressão de deGFP. A reação livre de células com Can produz uma concentração ligeiramente menor de deGFP, enquanto nenhuma expressão de deGFP é detectada no controle negativo. Um SDS-PAGE foi realizado após a purificação com etiqueta his e troca de tampão das moléculas de deGFP expressas. HPLC

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Research

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Biology

Biologia

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