Name: In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a estudar a permeação de moléculas nanoformuladas através da barreira hematoencefálica usando um modelo in vitro validado com células endoteliais e astrócitos de rato. Este método demonstra a eficiência das nanoformulações.

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Os autores agradecem ao Assessorato alla Sanità, Regione Lombardia e Sacco Hospital (Projeto NanoMeDia) pelo financiamento da pesquisa.

1. Estabelecer o modelo de certificação Nota: Para estabelecer o modelo de certificação, sugerimos o uso RBMECs primários disponíveis comercialmente e RCA. Todos os passos devem ser executados com reagentes estéreis e descartáveis, manipulados numa câmara de fluxo laminar. <ol><li> Cultura de células <ol><li> frascos de cultura de células com revestimento de poli-L-lisina 100 ug / ml (1 h à temperatura ambiente) ou fibronectina 50 ug / ml (1 h a 37 ° C) para promover a ligação de RCA ou RBMECs, respectivamente. Em seguida, descongelar 1 x 10 6 RCA e 5 x 10 5 RBMECs em meio de células endoteliais, suplementado com 5% de soro fetal bovino, suplemento de crescimento celular endotelial 1% e 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCAs de sementes em um frasco T175 em 20 ml SECM e RBMECs em um frasco T75 em 10 ml SECM. Nota: A descongelação e passagens de semeadura de RCA e RBMECs deve ser ajustada, em termos de densidade celular e o tempo em cultura, de acordo com o número de condições experimentais a ser testado com o modelo de certificação. Ao inícioção com um frasco de 1 x 10 6 RCA e um frasco de 5 x 10 5 RBMECs, é possível obter-se a 20 inserções de certificação de rolamento. </li><li> Manter as células a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera húmida durante cerca de 6 dias, até cerca de 80% de confluência de RCA e mais de 90% de confluência para RBMECs. Retire células utilizando uma solução de tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) durante 5 min (1 ml de tripsina para frascos T75 e 2 ml para frascos T175). Pare a actividade da tripsina com SECM (2: 1), suspensões de células, centrifugar a 750 x g durante 5 minutos e voltar a suspender as pelotas em 60 ml SECM. </li><li> Dividir os RBMECs em 3 frascos T175 e cultura em SECM por mais 3 dias antes da semeadura em inserções. Contar o número total de vida RCA, por observação de uma suspensão de células diluída 1: 1 com o azul de tripano ao microscópio óptico numa câmara de Burker. </li></ol></li><li> Semeadura de células em inserções <ol><li> Tratar um lado do tereftalato de polietileno (PET) de membrana de transpa 6 multi-poçosinserções ent com poli-L-lisina 100 ug / ml e do outro lado com fibronectina 50 ug / ml, para permitir a ligação de RCA e BMECs. Lidar com as inserções com uma pinça, a fim de evitar o contacto com a membrana PET. <ol><li> Coloque as inserções em uma placa de 6 poços e adicionar solução de fibronectina (mínimo de 500 ul) para dentro da câmara superior. Após 1 h de incubação a 37 ° C, remover a solução de fibronectina, tomar as pastilhas da placa multi-poços e colocá-los de cabeça para baixo na parte inferior do de 150 cm2 numa caixa de Petri, que é aqui utilizada como um suporte estéril para o já revestido inserções. </li><li> Adicionar cuidadosamente 800 ul de poli-L-lisina sobre o lado inferior do inserto (como mostrado na Figura 1A; referido como sementeira RCA), e manter a solução sobre as pastilhas durante 1 h à TA. </li><li> Aspirar a solução e deixar que as inserções secar à temperatura ambiente durante 15-30 min. As inserções estão agora prontos para a semeadura de células, mas também pode ser armazenada na placa multi-poços para váriasdias a 4 ° C, antes de prosseguir com a construção BBB. Nota: Lembre-se de manter pelo menos 3 inserções revestidas livre de células, para ser usado como controles para validar estabelecimento BBB pela FD40 medições de fluxo. </li></ol></li><li> RCA sementes (35000 / cm 2) sobre o lado inferior das inserções poli-L-lisina-revestidas, deixando cair a 800 ul de suspensão de células para a inserção de cabeça para baixo (Figura 1A). Deixar a suspensão RCA nas pastilhas durante 4 h à TA, a fim de permitir a ligação eficiente das células à membrana. </li><li> Aspirar a solução residual, colocar as inserções em poços contendo 2 ml de SECM e manter a placa de multi-poços, a 37 ° C e 5% de CO2 numa atmosfera humidificada, a alteração do SECM a cada 2 dias. </li><li> Após 3 dias, quando os RCA ter revestido a face inferior da peça inserta, RBMECs semente sobre o lado superior da peça inserta, seguindo estes passos: <ol><li> Retire RBMECs de frascos T175 e contar océlulas vivas totais, conforme relatado nos passos 1.1.2 e 1.1.3. </li><li> RBMECs sementes (60000 / cm 2) sobre a superfície superior do inserto no SECM (1,000 mL) (Figura 1B), deixando 3 inserções com apenas os astrócitos, para ser utilizado como fundo TEER. Colocar a placa de multi-poços em condições de cultura padrão. Manter o sistema para a cultura durante pelo menos 3 dias, mudando o SECM na câmara interior e inferior a cada 2 dias. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Validação BBB <ol><li> Medição TEER <ol><li> No dia 3 rd de co-cultura, verificar o TEER inserindo as inserções de certificação de rolamento para uma câmara apropriada (que tem uma tampa e que ambos câmara e o tampão conter um par de tensão de detecção e eléctrodos de corrente), encheu-se com quatro ml de SECM. Ligue a um epitelial volts de tecido / ohmímetro. </li><li> Juntamente com as medições TEER do BBB-sistemas celulares, registre os valores TEER dos 3 inserções, levando as RCAs them vão ser subtraídos dos valores obtidos com o BBBs. Multiplicar os valores TEER resultantes por a superfície da peça inserta (4,2 cm 2), a fim de expressar os resultados como Ω x 2 cm. </li><li> A partir do 3º dia de co-cultura, medir a TEER todos os dias. Nota: Após um período inicial em que o TEER aumenta, os valores registados devem permanecer estáveis ​​durante pelo menos dois dias consecutivos (normalmente entre a 5 e a 7 ​​° dia de co-cultura). Nesse ponto, a certificação está pronta para o segundo passo de validação (secção 2.2) e / ou para as experiências de trans-BBB. Nota: O procedimento descrito na secção 2.1, pode ser realizada nas mesmas BBB-sistemas dedicados para as seguintes experiências de permeabilidade (secção 3). Operar sob condições estéreis. </li></ol></li><li> Trans-BBB Flux de FITC-dextrano 40 (FD40) <ol><li> Medir o fluxo FD40 da parte superior para a câmara inferior dos modelos de BBB comparada com a do outro lado 3 inserções vazios(Ver a nota do ponto 1.2.1) de acordo com as seguintes etapas: <ol><li> Adicionar 1 mg / ml FD40 (diluído em SECM) no compartimento superior do BBBs, e após 1, 2 e 3 h retirar 200 ul SECM da câmara inferior e medir a intensidade da fluorescência por espectrof (λ ex 488 nm, λ in 515 nm, fenda 5). </li><li> Obter os valores para SECM fundo fluorescenceby medindo 500 ul de meio virgem utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtrair o fundo de fluorescência SECM de todos os valores de fluorescência FD40. </li><li> Determinar a quantidade de FD40 permeado por comparação dos valores de fluorescência observado com uma curva de calibração produzida com concentrações conhecidas (ie. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 ug / mL) do marcador fluorescente dissolvido em 500 ul de SECM. </li><li> Calcular o coeficiente de permeabilidade aparente (P app) a partir dos valores de fluxo médios de acordo com: P app = J / AC <br/&gt; Em que J é o fluxo da molécula de (moles / seg), A é ​​a área de permeação (2 cm) e C é a concentração da molécula no compartimento superior (moles / cm3). Nota: Três ou mais BBB-sistemas que tenham atingido valores TEER adequados, devem ser exclusivamente dedicados a este procedimento de validação, e não deve ser empregue para as seguintes experiências de permeabilidade (secção 3). A esterilidade não é obrigatória. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Trans-BBB permeação de Ferritinas FITC-carregado (Fnn) Nota: Uma variante recombinante de ferritina humana (FN), produzido em Escherichia coli e montados em nanocages (Fnn) para a encapsulação de diferentes moléculas fluorescentes, estão disponíveis a partir do NanoBioLab do Prof. Prosperi (Universidade de Milão-Bicocca, Itália). FNN são carregados com FITC, de acordo com um protocolo previamente descrito 13 e as concentrações de ambas as moléculas e Fn são carregados com exactidão determinEd. <ol><li> Trans-certificação fluxo de FITC e FITC-FNN <ol><li> Medir o fluxo de FITC-FNN a partir da parte superior para a câmara inferior de modelos de BBB validados (normalmente na 5ª - 7 ° dia de co-cultura), em comparação com a do corante livre depois de 7 e 24 horas de incubação, de acordo com a as etapas a seguir: <ol><li> Adicionar FITC-FNN (50 ug / ml Fnn, 1,1 uM FITC) ou uma quantidade igual de livre FITC para dentro da câmara superior de pelo menos 6 sistemas BBB para cada formulação, a fim de retirar a 2 ml de solução SECM a partir da câmara inferior pelo menos 3 inserções após 7 horas, e da câmara baixa do outros 3 inserções após 24 horas. </li><li> Medir a intensidade de fluorescência de 500 ul das amostras recolhidas por espectrof (λ ex 488 nm, λ in 515 nm, fenda de 5). </li><li> Obter a fluorescência de fundo SECM medindo 500 ul de meio utilizando os mesmos parâmetros analíticos. Subtrair a fluorescência de fundo SECMa partir de todos os valores de fluorescência ou FITC FITC-FNN. </li><li> Determinar a concentração do permeado com FITC ou FITC-FNN pela comparação dos valores de fluorescência obtidos com duas curvas de calibração diferentes, produzidos com concentrações conhecidas (isto é,. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) do corante livre ou nanoformulated dissolvido em 500 ul SECM. </li></ol></li></ol></li><li> FITC-Fnn Localização no RBMECs <ol><li> Remover SECM da câmara superior dos sistemas de BBB, lavar as inserções com PBS e fixar os RBMECs em, pelo menos, duas pastilhas de cada grupo experimental por adição de 500 uL de paraformaldeído (4% em tampão fosfato salino-PBS) no compartimento superior para 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavam-se as pastilhas três vezes com PBS para remover o paraf ormaldeido residual. Nota: Deste ponto em diante, a esterilidade não é necessário. </li><li> Corte pedaços adequados da membrana PET, e prosseguir com a immunodecoration das células de acordo com os seguintes passos: <ol><li> permealize RBMECs com 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 10 minutos. Realizar uma etapa de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente com uma solução contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA), soro de cabra a 2% em PBS. Incubar as amostras com uma Willebrand factor anti-Von (vWF) a diluição de 1:20, durante 2 h à TA. </li><li> Após lavagem três vezes com PBS, expor as células durante 2 horas à temperatura ambiente a uma BSA 2%, solução de soro de cabra a 2% contendo um anticorpo secundário adequado, a uma diluição de 1: 300, a fim de revelar o anti-VWR, e DAPI numa diluição de 1: 1500 para detecção de núcleos. </li></ol></li><li> Monte as peças de inserção em lâminas de microscópio utilizando uma solução de montagem Antifade (uma gota por fragmento de inserção), em seguida, feche a amostra com uma lamela. Analisar por microscopia confocal usando uma lente de imersão em óleo e 40X, 1,5 zoom e resolução de 1.024 x 1.024 pixels. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O método in vitro descrito aqui, representa uma abordagem útil validado para estudar a entrega trans-certificação de moléculas fluorescentes mediante nanoformulation com nanopartículas. Aqui usamos Fnn, o que representa um bom candidato para estudar a translocação de moléculas de carga através da bbb. FNN é considerado o nanovector ouro para a certificação trans-entrega de drogas / agentes uma vez que é especificamente reconhecido pelo receptor TfR1, que é expresso sobre a membrana luminal de BMECs e medeia a c...

A resistência do sistema nervoso central (SNC) de doenças (ou seja. O cancro, epilepsia, depressão, esquizofrenia e desordem neurológica associada ao HIV) para terapias farmacológicas é devido a vários mecanismos diferentes, incluindo permeação do fármaco árdua através da barreira sangue-cérebro (BBB) . O BBB é a fronteira que isola tecidos do cérebro a partir de substâncias que circulam no sangue. Dentro desta barreira, uma camada de células endoteliais microvasculares cerebrais (BMECs), suportados por pericitos e endfeet astrócitos, é responsável pela elevada selectividade da certificação para aquelas drogas hidrossolúveis com um peso molecular superior a 400 Da 1. Outro mecanismo de resistência relacionada com a droga está ligada à presença na BMECs dos transportadores de efluxo de drogas (proteínas glicoproteína-P e resistência a múltiplas drogas), que co-atuam para reduzir a penetração da droga no SNC e facilitar a sua extrusão do cérebro 2. Na última década, Um grande número de abordagens nanotecnologia têm sido desenvolvidos para satisfazer o desafio biológica e clinica de entrega de drogas através da certificação 3-6. Neste contexto, nanoesferas ferritina (Fnn) representam uma solução completamente inovadora e promissora. Fnn são 12 esferas nm de 24 ferritina auto-montagem (Fn) monômeros, que são dispostos em uma estrutura esférica oca, de 8 de diâmetro interno nm. subunidades de ferritina pode ser desmontado em pH ácido e reagrupados numa forma com memória de forma, trazendo o pH até à neutralidade, permitindo que várias moléculas orgânicas a ser encapsulado. Portanto, Fnn representam um modelo interessante para o desenvolvimento de multifuncional entrega da droga sistemas 7,8. Além disso, podem interagir com Fnn BMECs graças ao reconhecimento específico de receptor de transferrina (TfR) 1, que é expresso sobre a membrana luminal destas células 9. Até agora, diferentes em modelos in vitro da BHE foram desenvolvidos na order para elucidar trans-certificação permeabilidade para vários fármacos, a toxicidade para a certificação, ou a interacção de moléculas com transportadores de efluxo. De facto, estes modelos são considerados válidos abordagens in vitro para uma triagem rápida de moléculas activas, antes de prosseguir com os estudos in vivo. Estes modelos consistir de uma única camada endotelial de BMECs ou BMECs astrócitos e co-cultivadas (mais raramente) pericitos, obtido a partir de animais (rato, ratinho, porco e bovino) ou linhas celulares humanas 10,11,12. A resistência eléctrica transendotelial (TEER) e a permeabilidade aparente (P app) de marcadores com um peso molecular definido representam dois parâmetros críticos que são usados ​​para determinar a qualidade do modelo in vitro. Aqui nós descrevemos o emprego de um modelo de certificação in vitro, com base numa co-cultura de rato BMECs (RBMECs) e Rat astrócitos corticais (RCA) para estudar a permeação trans-BBB de nanocages ferritina encapsular isothi fluoresceínaocyanate (FITC).

<table><tbody><tr><td>Células Endoteliais Microvasculares do Cérebro de Rato&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10308</td><td>isolado de tecido cerebral de rato Sprague Dawley, criopreservado na passagem um e entregue</td></tr><tr><td>astrócitos corticais congelados&nbsp;</td><td>Innoprot</td><td>P10202</td><td>isolado de tecido cerebral de rato de 2 dias, criopreservado na passagem um e entregue congelado.</td></tr><tr><td>Kit Meio de Células Endoteliais</td><td>Innoprot</td><td>P60104</td><td>ECM (500 ml) e soro fetal bovino (25 ml), suplemento de crescimento de células endoteliais (5 ml) e penicilina/estreptomicina (5 ml). Quente em 37 > C banho-maria antes de usar e proteger da luz</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA sem Fenol Vermelho</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920D</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Isotiocianato-dextrano de fluoresceína 40.000</td><td>Sigma</td><td>FD40S</td><td>protege da luz</td></tr><tr><td>paraformaldeído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>diluição em tampão</td></tr><tr><td>fosfato químico Dulbecco solução salina sem Ca e Mg</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; Albumina de soro bovino X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>soro de cabra</td><td>EuroClone</td><td>ECS0200D</td><td></td></tr><tr><td>camundongo monoclonal anti-Von Willebrand Fator</td><td>Dako</td><td>M0616</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 546-conjugado anticorpo contra IgGs de camundongo</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11003</td><td>proteger da luz</td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol)&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>protege da luz</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina Hydrobromide</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>a mesma solução pode ser usada várias vezes</td></tr><tr><td>fibronectina de plasma bovino;</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td>a mesma solução pode ser usada várias vezes</td></tr><tr><td>Inserções de tereftalato de polietileno (PET)</td><td>Falcon</td><td>F3090</td><td>Membranas transparentes de tereftalato de polietileno (PET); área de superfície: 4,2 cm2; tamanho do poro 0,4 &micro; m/área de superfície</td></tr><tr><td>T75 Primo TC frasco</td><td>EuroClone</td><td>ET7076</td><td></td></tr><tr><td>T175 Primo TC</td><td>frasco EuroClone</td><td>ET7181</td><td></td></tr><tr><td>EVOM2 Tecido Epitelial Volt/Ohmímetro&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>World Precision Instruments Germany</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Endohm- copo 24SNAP World</td><td>Precision Instruments Germany</td><td>ENDOHM-24SNAP</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz/fluorescência com câmera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM IL LED Fluo/ ICC50 W Módulo de Câmera</td><td>&nbsp; microscópio invertido para células vivas com câmera&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SPE</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofluorímetro</td><td>Jasco</td><td>FP-8000</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro permeação de ferritinas fitc-carregados através de um rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a entrega de nanoformulated moléculas

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

As células endoteliais microvasculares cerebrais, sustentadas por pericitos e astrócitos endfeet, são responsáveis pela baixa permeação de grandes fármacos hidrossolúveis através da barreira hematoencefálica (BHE), causando dificuldades para terapias farmacológicas eficazes. Nos últimos anos, diferentes estratégias para promover o direcionamento do cérebro tiveram como objetivo melhorar a entrega e a atividade de medicamentos neste local, incluindo nanossistemas inovadores para entrega de medicamentos em todo o BBB. Nesse contexto, uma abordagem in vitro baseada em um modelo celular simplificado da BBB fornece uma ferramenta útil para investigar o efeito de nanoformulações na permeação trans-BBB de moléculas. Este estudo descreve o desenvolvimento de uma BHE de camada dupla, consistindo em células endoteliais microvasculares primárias do cérebro de rato co-cultivadas comercialmente disponíveis e astrócitos. Uma abordagem multiparamétrica para a validação do modelo, baseada na medição da resistência elétrica transendotelial e na permeabilidade aparente de uma dextrana de alto peso molecular, também é descrita. Como prova de conceito para o emprego deste modelo BBB para estudar o efeito de diferentes nanoformulações na translocação de moléculas fluorescentes através da barreira, descrevemos o uso de isotiocianato de fluoresceína (FITC), carregado em nanopartículas de ferritina. A capacidade das ferritinas de melhorar a permeação trans-BBB do FITC foi demonstrada por medições de fluxo e análises de microscopia confocal. Os resultados sugerem que este é um sistema útil para validar nanossistemas para entrega de medicamentos em toda a BHE.

Durante o estabelecimento do modelo de certificação, a fixação de células e crescimento das inserções pode ser monitorizada utilizando um microscópio de luz graças à natureza transparente das membranas de PET. RCA, semeadas a uma densidade de 35.000 células / cm2, prender de forma eficiente para o lado inferior do inserto após 4 h de incubação à temperatura ambiente (Figura 2A) e crescem-se a cobrir a superfície da membrana em 3 dias, tendo uma morfologia fusi...

Um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica baseado em uma co-cultura de células endoteliais microvasculares cerebrais de rato e astrócitos é descrito e validado. Este sistema mostrou-se uma ferramenta válida para estudar o efeito da nanoformulação na permeação transbarreira de moléculas fluorescentes.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

O objetivo geral deste procedimento é descrever uma abordagem validada para estudar a entrega através da barreira hematoencefálica de moléculas fluorescentes nanoformuladas utilizando nanoestruturas de ferritina carregadas com FITC como prova de conceito. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da resistência de doenças do sistema nervoso central às terapias farmacológicas, devido à baixa permeação de fármacos através da barreira hematoencefálica. A principal vantagem desta técnica é a possibilidade de demonstrar a capacidade da nanoformulação de melhorar a permeação transbarreira de moléculas encapsuladas, utilizando uma abordagem em um único modelo de BBB.As implicações desta técnica estendem-se à terapia de distúrbios com efeitos neurológicos, pois tende a superar a alta seletividade da barreira hematoencefálica à maioria das drogas. Este método pode fornecer informações sobre a eficiência das nanoestruturas de ferritina como sistema de entrega de fármacos através da BHE. Ele tem sido aplicado com FITC, mas também pode ser explorado com outras moléculas de carragenina ou com diferentes tipos de nanopartículas orgânicas ou inorgânicas.Inicie revestindo

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Este vídeo descreve um ensaio de permeabilidade para avaliar a permeabilidade da barreira hematoencefálica in vitro usando moléculas de fluoresceína de sódio.

Ensaio de permeabilidade mimetizada da barreira hematoencefálica: um ensaio in vitro para avaliar a permeabilidade do BBB Mimic a moléculas traçadoras

Este vídeo demonstra um método para estudar a permeação através de um modelo de barreira hematoencefálica (BBB) in vitro usando astrócitos e células endoteliais em uma inserção de membrana, com ferritina carregada com FITC e FITC livre. A ferritina FITC se ligou aos receptores nas células endoteliais e atravessou a barreira da membrana para a câmara inferior, enquanto o FITC livre mostrou permeação restrita e permaneceu na câmara superior.

Estudando a permeação de FITC e FITC-ferritina através de um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

O objetivo do presente estudo foi validar a reprodutibilidade de um modelo in vitro BBB envolvendo um singênico rato co-cultura de células endoteliais e astrócitos. A monocamada de células endoteliais apresentaram alta TEER e baixa permeabilidade LY. Expressão de proteínas TJ específicos, foram avaliadas as respostas funcionais a inflamação e a funcionalidade de transportadores e receptores.

Criação de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rato barreira hemato-encefálica (BBB): A Focus on BBB impermeabilidade e Transportes Receptor mediada

O objectivo do protocolo é apresentar um processo otimizado para o estabelecimento de um modelo barreira hemato - encefálica (BBB) em vitro baseado em células endoteliais cerebrais primários de suínos (pBECs). O modelo mostra grande reprodutibilidade, alta tensão e é apropriado para estudos de transporte e o tráfico intracelular de fármacos.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

Neste estudo, apresentamos um procedimento fácil e eficiente para avaliar o rompimento da barreira hemato - encefálica em condições neurodegenerativas. Para alcançar nosso objetivo, nós infundida de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína rotulado (FITC)-albumina na jugular do mouse veia e avaliada a sua fuga para o parênquima cerebral por microscopia de fluorescência.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Direcionamento de drogas para tumores do sistema nervoso central é um grande desafio. Aqui descrevemos um protocolo para produzir um mímico in-vitro do tumor-barreira sangue-cérebro usando células murino e/ou humanas e discutir sua relevância para a previsibilidade do sistema nervoso central tumor direcionamento em vivo.

Prever em cargas entrega Vivo usando uma Tumor-barreira sangue-cérebro em um prato

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

No presente estudo, o dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC) é administrado a camundongos via gavagem oral para avaliar a permeabilidade intestinal tanto in vivo quanto em amostras plasmáticas e fecais. Como a função de barreira intestinal é afetada em muitos processos de doenças, este ensaio direto e quantitativo pode ser usado em diversas áreas de pesquisa.

Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato

"E-DNA" sensores, reagentless, biossensores eletroquímicos que um bom desempenho, mesmo quando desafiados diretamente no sangue e outras matrizes complexas, foram adaptados para a detecção de uma ampla gama de ácido nucléico, proteínas e moléculas pequenas analitos. Aqui apresentamos um procedimento geral para a fabricação e uso de tais sensores.

Fabricação de Eletroquímica-DNA Biossensores para Detecção Reagentless de ácidos nucléicos, proteínas e pequenas moléculas

Aprenda a estudar a permeação de moléculas nanoformuladas através da barreira hematoencefálica usando um modelo in vitro validado com células endoteliais e astrócitos de rato. Este método demonstra a eficiência das nanoformulações.

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas (Vídeo) | JoVE Journal

In Vitro permeação de Ferritinas FITC-carregados através de um Rat barreira sangue-cérebro: um modelo para estudar a Entrega de Nanoformulated Moléculas

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