Name: Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Aprenda a usar RNA de interferência específico para HSP27 para avaliar o papel da proteína de choque térmico 27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Este método permite estudar funções proteicas em células epiteliais.

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Este estudo foi apoiado pela Research Grant Student (13-14) da Universidade de Ulsan College of Medicine, Seoul, Coreia do Sul e uma subvenção (2014-464) do Instituto Asan para as Ciências da Vida, Seoul, Coreia.

Linha 1. celular <ol><li> Cultura de 10 6 culas imortalizadas-telomerase humana corneanas epiteliais (HCEC) em uma placa de 6 poços (densidade: 1039,9 células / mm 2) numa 37 ° C incubadora com uma atmosfera de CO2 a 5%, utilizando meio de crescimento do epitélio brônquico (BEGM) até atingirem 95% de confluência. </li></ol> 2. Western Blot Analysis após Criando Wounds raspadinhas epiteliais <ol><li> Streak uma ponta estéril 200 ul pipeta através da superfície de um poço de confluentes HCEC cultivadas quatro vezes por placa numa câmara de segurança biológica (Classe II, tipo A2) e incubar HCEC separadamente em um 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2 durante 1, 5, 10, 30, 60, e 120 min. </li><li> Utilize uma placa de 6 poços para seis amostras diferentes de acordo com o tempo de incubação após a lesão do epitélio da córnea. </li><li> Lavar feridos HCEC monocamadas três vezes com PBS 1x e, em seguida, adicionar 2,0 ml BEGM a cada poço. </li><li> Retire HCEC usando 2ml de 0,25% de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por poço durante 5 minutos, centrifugar a 900 xg durante 5 min num tubo de 15 ml, e aspirado de tripsina-EDTA, utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Suspender HCEC com 1 ml de PBS 1x e transferi-los para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Centrífuga HCEC a 10.000 xg durante 15 seg e aspirado de 1x PBS utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Ressuspender HCEC em 100 de tampão de lise arrefecido com gelo ul (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, EDTA 2 mM, NaF 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4, fenilmetanossulfonil fluoreto de 1 mM [FPMS], inibidores de protease [1 uM de pepstatina A, 1 | iM de leupeptina, e 0,1 uM de aprotinina] e 0,5% de Triton X-100 [pH 7]) e misture bem. </li><li> Incubar as células durante 30 min em gelo para induzir lise celular. </li><li> Os lisados ​​Centrifugar a 4 ° C a 10000 xg durante 15 min, e, em seguida, transferir os sobrenadantes para novos tubos de 1,5 ml (90 mL alíquotas) e armazená-las a -80 ° C. </li><li> Determinar as concentrações de proteína total dos lisados ​​celulares utilizando o pr Bradfordensaio otein 9. </li><li> Carregar 30 ug de proteínas de células totais num gel de acrilamida a 10% ou 12% por electroforese em dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE), e depois por electroforese transferência separada bandas de proteínas a filtros de nitrocelulose com uma corrente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C para usar em ensaios de western blot. </li><li> membranas de filtro em bloco de nitrocelulose com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST), durante 1 h, adicionar anticorpos policlonais de coelho primários contra a HSP27 não-fosforilada (diluição 1: 1000) ou anticorpo policlonal primário de coelho contra a HSP27 fosforilado (1 : 1000 de diluição) em 5% de albumina de soro bovino (BSA), e incuba-se as membranas durante a noite a 4 ° C num agitador. </li><li> Detectar bandas imunorreactivas com anticorpos anti-coelho com peroxidase de rábano de cabra conjugado com (1: 10.000 de diluição) em BSA a 5% após a lavagem durante 10 minutos 3 vezes com TBST. </li><li> Incubar a membrana nos reagentes de luminol de Western blotting (6-7 ml por 10 cm × membrana 5 cm) durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover a membrana da solução reagente, remover o excesso de líquido com uma toalha absorvente e coloque em um protetor de folha de plástico. </li><li> Trabalhando em um quarto escuro com uma luz segura, coloque membrana coberta com uma cassete de filme com o lado proteína voltado para cima. </li><li> Coloque um filme de raios-X em cima da membrana e expor durante 1 min. </li></ol> 3. Transfection siRNA Assay 10 <ol><li> HCEC cultura a 5 x 10 5 células / poço numa placa de 6 cavidades em uma incubadora de 37 ° C com uma atmosfera de CO2 a 5%, utilizando BEGM até atingirem 95% de confluência. </li><li> Dilui-se o reagente de transfecção (2,5 ou 7,5 ul) com 100 ul reduzidas meio de soro para a transfecção (o factor de diluição foi de 41 ou 14,3) e dissolve-se o específico do HSP27 e mexidos ARNsi de controlo em 100 ul de meio de soro reduzido para criar 10 ou 50 nM de -HSP27 específico e mexidos siRNA controle. </li><li> Misturar 100 μ; L com solução de siRNA 100 ul de reagente de transfecção diluída (1: 1) e incuba-se a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar os complexos de siRNA-lípido às células. Em seguida, após 4 h mudanças de meios para completar BEGM e incubar as células durante 2 dias a 37 ° C. </li><li> Analise as células transfectadas por transferência de Western, como descrito a partir de secções de 4,1 a 4,7. </li></ol> 4. Ensaio de Western Blot para células transfectadas com ARNsi 11 <ol><li> Extrair específicos de HSP27 e mexidos controlo HCEC transfectadas com ARNsi numa câmara de segurança biológica usando 100 ul de tampão de lise gelado (Tris 10 mM, NaCl 10 mM, ácido etilenodiaminotetracético 2 mM (EDTA), NaF 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4, 1 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF), inibidores de protease, e 0,5% de Triton X-100, pH 7). </li><li> Incubar as células durante 30 min em gelo para induzir lise celular. </li><li> Os lisados ​​pelete a 10000 xg durante 15 min e depois transferir os sobrenadantes para banheira de 1,5 ml frescoes (90 ul Alíquotas) e armazená-los a -80 ° C. </li><li> Determinar as concentrações de proteínas dos lisados celulares utilizando o ensaio de proteína de Bradford 9. </li><li> amostras de carga com quantidades iguais de proteínas celulares totais sobre um gel de acrilamida a 10% ou 12%, submeter o gel de SDS-PAGE e electrof transferir as bandas de proteínas separadas para filtros de nitrocelulose com uma corrente de 200 mA durante 1 hora a 4 ° C a utilização em ensaios de western blot. </li><li> Bloco de membranas de filtro de nitrocelulose com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST), durante 1 h, adicionar anticorpos primários contra fosforilada e não fosforilada HSP27 (diluição 1: 1000), Akt fosforilada (diluição 1: 1000), não fosforilada Akt (diluição de 1: 1000, utilizado como um marcador de sobrevivência celular), Bcl-2 associada proteína X (diluição de 1: 1000, usado como uma proteína pro-apoptótica), e gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 1 : 200 de diluição, utilizados como um controlo de carga) em 5% de albumina de soro bovino (BSA), eincubar as membranas durante a noite a 4 ° C num agitador. </li><li> Detectar bandas imunorreactivas com anticorpos anti-coelho com peroxidase de rábano de cabra conjugado com (1: 10.000 de diluição) em BSA a 5% após a lavagem 3 vezes com TBST, 10 minutos cada lavagem. </li><li> Incubar a membrana nos reagentes de luminol de Western blotting (6-7 ml por 10 cm x 5 centímetros de membrana) durante 1 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover a membrana da solução reagente, remover o excesso de líquido com uma toalha absorvente e coloque em um protetor de folha de plástico. </li><li> Trabalhando em um quarto escuro com uma luz segura, coloque a membrana coberta com uma cassete de filme com o lado da proteína voltado para cima. </li><li> Coloque um filme de raios-X em cima da membrana e expor durante 1 min. </li></ol> 5. direcional ferindo Ensaio de Avaliação da migração celular 12 induzida por risco <ol><li> Numa câmara de segurança biológica, fazer uma ferida, arrastando uma ponta de pipeta estéril através da superfície de um poço de culturas confluentes deespecíficos do HSP27 transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi HCEC transfectadas mexidos. </li><li> Imediatamente após o ferimento, lavar as células duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) e mantê-las em culturas BEGM numa incubadora a 37 ° C com uma atmosfera de 5% de CO 2 durante 24 horas após o ferimento. </li><li> Fotografar imagens HCEC usando um microscópio vertical em 100X 24 horas após o ferimento e executar fundo achatamento usando o Filtro comando no software de análise de imagem. </li><li> Usando o comando Selecionar Medidas, definir a área de interesse (AOI) com a mesma forma poligonal tamanho que pode cobrir perpendicularmente a partir de uma extremidade à outra da ferida inicial, e determinar três AOI diferente na área ferida de cada amostra. </li><li> contar automaticamente o número de células em cada campo usando as opções do menu Medida Contagem / Tamanho. </li></ol> 6. Fluxo de Análise de Citometria de apoptose <ol><li> Cultura transfectadas com siRNA e específicos de HSP27 controle sHCEC contendo cada 10 nM de ARNsi iARN-transfectado numa concentração de 5 x 10 5 células / poço em placas de 6 poços até as células atingirem 95% de confluência em uma temperatura de 37 ° C incubadora com uma atmosfera de CO2 a 5% em BEGM. </li><li> Retire HCEC utilizando 2 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por poço durante 5 minutos, centrifugar a 900 xg durante 5 min num tubo de 15 ml, e aspirado de tripsina-EDTA, utilizando uma pipeta de 1 ml. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS frio e, em seguida, voltar a suspender as células em 1x tampão (HEPES 0,1 M / NaOH, [pH 7,4], NaCl a 1,4 M, e CaCl 2 25 mM) de ligação a uma concentração de 10 6 células / ml. </li><li> Transferir 100 ul de suspensão de células (1 x 10 5 células) num tubo de cultura de 5 mL. </li><li> Adicionam-se 5 ul de fluoresceína conjugado com isotiocianato de Anexina V e iodeto de propídio 5 ul. </li><li> Suavemente Agitar as células e incubar durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Adicionar 200 ul de 1x tampão de ligação a cada tubo e analisar as células por um fluxo cytometer dentro de 1 hora. </li></ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros ou de propriedade em quaisquer materiais ou métodos mencionados neste estudo.

No presente estudo, avaliamos o papel potencial da HSP27 no ferimento epitelial da córnea usando abordagens in vitro . As etapas críticas envolveram a transfecção de siRNA para o knock-down de HSP27 para observar a função de HSP27 em células submetidas a estresse. Notavelmente, um papel para HSP27 foi revelado por esses experimentos na migração de células epiteliais e apoptose durante a cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Ao contrário de estudos anteriores10 que usaram siRNA específico de HS...

Células epiteliais da córnea (PEC) são eliminados continuamente em filme lacrimal, enquanto eles são simultaneamente substituído por células do limbo e camadas basais do epitélio da córnea. 1 Vários factores de stress extrínsecos pode induzir a apoptose e descamação do PEC. 2 As proteínas de choque térmico (HSPs) são altamente conservados e podem ser divididos em duas famílias de acordo com o tamanho molecular. 3 a maior família HSP inclui HSP90, HSP70 e HSP60, e a família menor inclui HSP27. 4 a fosforilação de HSP27 é conhecida por desempenhar um papel importante na sobrevivência celular e é necessária para a migração de células devido ao papel desta proteína na remodelação da actina. 07/05 Portanto, uma tentativa para testar o potencial papel da fosforilação em HSP27 migração CEC e a apoptose em um modelo in vitro de reparação epitelial. RNA de interferência (RNAi) utilizando quer ARN interferentes pequenos ou curtos (siARN) tem GEinteresse nerated tanto em biologia básica e aplicada, uma vez que potencialmente permite a expressão de qualquer gene de interesse a ser knocked-down. 8 Aqui, usamos siRNA específico do HSP27 para avaliar a contribuição de HSP27 para a cicatrização de feridas CEC e apoptose. ARNi métodos tradicionais para o gene knock-down em células utilizam duplexes de ARN sintéticos, incluindo dois oligonucleótidos 21-meros não modificados que podem ser montadas para criar ARNsi. O RNAi siRNA que usamos no presente estudo é um método simples e altamente eficiente para transfectar células, e este reagente trabalha com várias linhas de células imortalizadas. No presente estudo, demonstramos os métodos utilizados para esta análise, incluindo um ensaio de induzida por zero ferida direcional, western blot, ensaio de transfecção siRNA, imunofluorescência e citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Armário de segurança biológica</td><td>CHC LAB Co.Ltd,&nbsp; Daejeon, República da Coreia&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Classe II, Tipo A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; siRNA de controle embaralhado e siRNA específico para HSP27</td></tr><tr><td>BEGMTM</td><td>Lonza, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Meio de crescimento do epitélio brônquico&nbsp;</td></tr><tr><td>Inibidor de protease&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340, P7626</td><td>1 &#956; M Pestatina A, 1 &#956; M Leupeptina, 0,1 &#956; Ensaio de proteína M Aprotinin</td></tr><tr><td>Bradford&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001 Ensaio de</td><td>proteína Bradford&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtros de nitrocelulose</td><td>Amersham, Little Chalfont, Reino Unido</td><td>RPN3032D</td><td>Membrana de Blotting</td></tr><tr><td>Western HSP27 não fosforilada&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>diluição 1:1.000 (HSP27 total)</td></tr><tr><td>HSP27 fosforilado (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>diluição 1:1.000 HSP27 foi fosforilada em Ser85</td></tr><tr><td>Lipofectamine&reg; RNAiMAX reagente&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>Akt fosforilada (Ser473)</td><td>Tecnologia de sinalização celular, Danvers, MA</td><td>No. 4060</td><td>Diluição 1:1.000 Akt foi fosforilada em Ser473 (marcador de sobrevivência celular)</td></tr><tr><td>Akt não fosforilada;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA</td><td>No. 4061</td><td>Diluição 1:1,000 (Total Akt)</td></tr><tr><td>Bcl-2-proteína X associada</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular, Danvers, MA</td><td>No. 4062</td><td>1:1.000 (marcador de proteína antiapoptótica)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>No. 4063</td><td>marcador de controle de carga 1:1.000 (gene de manutenção doméstica)</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de rábano</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>diluição 1:10.000</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>meio de soro reduzido para transfecção</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Olympus, Inc., Tóquio, Japão</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Alemanha</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de seis poços</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>35,00 mm de diâmetro / poço</td></tr><tr><td>Prato de cultura de 24 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>N-Bioteck, Inc., Seul, Coréia do Sul</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Santa Cruz Biotecnologia, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filme de Citometria de Fluxo para Raios-X</td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>de Raio-X Médico com Tela Verde 400&nbsp;</td></tr><tr><td>reagente de luminol western blotting</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detecção de apoptose FITC Annexin V I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

investigação baseado no rna de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

O RNA interferente pequeno (siRNA) está entre os métodos de interferência de RNA mais amplamente utilizados para o silenciamento de curto prazo de genes codificadores de proteínas. siRNA é um duplex de RNA sintético criado para direcionar especificamente um transcrito de mRNA para induzir sua degradação e tem sido usado para identificar novas vias em vários processos celulares. Existem poucos relatos sobre o papel da proteína de choque térmico fosforilada 27 (HSP27) na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Aqui, as células epiteliais da córnea humana cultivadas foram divididas em um grupo transfectado por siRNA de controle embaralhado e um grupo transfectado por siRNA específico para HSP27. Ensaios de ferimento direcional induzido por arranhões, western blotting e citometria de fluxo foram então realizados. Concluímos que o HSP27 tem papéis na cicatrização de feridas epiteliais da córnea que podem envolver apoptose e migração de células epiteliais. Aqui, são fornecidas descrições passo a passo da preparação da amostra e do protocolo do estudo.

A expressão de HSP27 fosforilada aumentou significativamente a 5, 10, e 30 min após a lesão, em comparação com zero HCEC intacta 13. A análise por Western blot revelou que a expressão de HSP27 fosforilada e fosforilada de Akt foram ambas significativamente reduzida, enquanto que a expressão do Bax foi significativamente aumentada em HCEC transfectadas com ARNsi específico-Hsp27 (Figura 1A-E). A expressão de HSP27 fosforilado foi reduzido em 30% e 40% em 10 nM ...

Aqui, apresentamos um protocolo para usar o RNA de interferência pequena específico da proteína de choque térmico 27 (HSP27) para avaliar a função da HSP27 durante a cicatrização de feridas epiteliais da córnea. A interferência de RNA é o melhor método para efetivamente derrubar a expressão gênica para investigar a função da proteína em vários tipos de células.

Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

O objetivo geral deste ensaio de transfeção de RNA é utilizar RNA de interferência específico para HSP27 para avaliar o papel potencial da HSP27 na cicatrização de feridas do epitélio corneano. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a função da Proteína de Choque Térmico 27 durante o processo de cicatrização de feridas epiteliais. A principal vantagem desta técnica é que o RNA de interferência é um RNA sensível à ribonuclease, projetado especificamente para direcionar um transcrito de RNA mensageiro e induzir sua degradação.Tem sido utilizado para identificar novos espaços de pragas em diversos processos celulares. Embora esta técnica possa fornecer uma visão sobre a cicatrização de feridas no epitélio corneano, ela também pode ser aplicada a outro sistema, como a pele e a mucosa. O procedimento será demonstrado por Soon-Suk Kang, um técnico do meu laboratório.Para iniciar este procedimento, cultive células epiteliais corneanas humanas em uma placa de seis poços com meio de crescimento de epitélio brônquico a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono até atingirem 95 por cento de confluência. Em seguida, dilua 2,5 microlitros ou 7,5 microlitros do reagente de transfeção com 100 microlitros de meio com soro reduzido para transfeção. Então, dissolva siRNA específico para HSP27 e siRNA controle aleatório em 100 microlitros de meio com soro reduzido para criar 10 nanomolares de siRNA específico para HSP27 e 15 nanomolares de siRNA controle aleatório, respectivamente.Em seguida, misture 100 microlitros da solução de siRNA com 100 microlitros do reagente de transfeção diluído e incube a mistura por 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, adicione os complexos lipídicos de siRNA às células. Após uma incubação de quatro horas, troque o meio para o meio completo de crescimento de epitélio brônquico e incube as células por dois dias a 37 graus Celsius antes da análise por western blot.Nesta etapa, extraia HCECs transfectados com siRNA específico para HSP27 e siRNA controle scramble em uma cabine de segurança biológica usando 100 microlitros de tampão de lise gelado. Em seguida, incube as células por 30 minutos em gelo para induzir a lise celular. A seguir, centrifugue os lisados a 10.000 × g por 15 minutos.Posteriormente, transfira os sobrenadantes para tubos novos de 1,5 mililitro e armazene-os a menos 80 graus Celsius. Em seguida, determine as concentrações de proteína dos lisados celulares utilizando o ensaio de proteína de Bradford. Então, carregue as amostras com quantidades iguais de proteínas celulares totais em um gel de acrilamida a 10 por cento ou 12 por cento.Sujeite o gel à eletroforese em SDS-PAGE e transfira eletroforeticamente as faixas proteicas separadas para os filtros de nitrocelulose com corrente de 200 miliampères durante uma hora e a 4 °C. Em seguida, bloqueie as membranas de nitrocelulose com leite desnatado a cinco por cento em TBST durante uma hora. Depois, adicione os anticorpos primários e incube as membranas durante a noite a 4 °C em agitador.No dia seguinte, lave as membranas três vezes com TBST, permitindo dez minutos para cada lavagem. Em seguida, detecte as bandas imunorreativas utilizando anticorpos de cabra anti-coelho conjugados à peroxidase do rábano-picante em BSA a cinco por cento. Posteriormente, incube as membranas nos reagentes luminol para blotagem ocidental durante um minuto à temperatura ambiente.Remova a membrana da solução de reagente. Em seguida, remova o líquido em excesso com um papel absorvente e coloque-a em um protetor de folha plástico. Depois, coloque a membrana coberta em uma cassete para filme com o lado das proteínas voltado para cima.Coloque um filme de raios X sobre as membranas e exponha por um minuto. Em uma cabine de segurança biológica, faça uma ferida arrastando uma ponteira estéril através das culturas confluentes de HCECs transfectadas com siRNA específico para HSP27 ou controle scramble. Imediatamente após a lesão, lave as células duas vezes com PBS 1X e mantenha-as em meio de crescimento de epitélio brônquico a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por 24 horas.24 horas após a lesão, capture a imagem das HCECs usando um microscópio invertido em 100x e realize o nivelamento do fundo com o comando de filtro no software de análise de imagem. Usando o comando selecionar medições, defina a área de interesse com uma forma poligonal do mesmo tamanho que possa cobrir perpendicularmente a lesão inicial de ponta a ponta. Em seguida, determine três áreas de interesse diferentes na região lesionada de cada amostra.Conte automaticamente o número de células em cada campo utilizando a opção de menu medir tamanho da contagem. A análise por Western blot mostrada aqui revelou que a expressão de HSP27 fosforilada e Akt fosforilada foi significativamente reduzida. Enquanto isso, a expressão de backs foi significativamente aumentada em HCECs transfectadas com siRNA específico para HSP27.A expressão de HSP27 fosforilada foi reduzida em 30 por cento e 40 por cento em células transfectadas com siRNA específico para HSP27 de 10 nanomolar e 15 nanomolar, respectivamente, em comparação com células transfectadas com siRNA controle. Além disso, a expressão de HSP27 não fosforilada foi reduzida em 20 por cento e 30 por cento em células transfectadas com siRNA específico para HSP27 de dez nanomolar e 15 nanomolar, respectivamente. O ensaio de ferida direcional induzida por arranhão indicou que, 24 horas após a lesão, as células transfectadas com siRNA específico para HSP27 em 10 e 15 nanomolar exibiram migração reduzida.Além disso, as HCEC transfectadas com siRNA específico para HSP27 sofreram maior morte celular apoptótica e necrótica em comparação com as células transfectadas com siRNA controle scramble, conforme demonstrado por citometria de fluxo. Uma vez dominada, a técnica de transfeção de RNA pode ser realizada em 24 horas, se executada corretamente. Após seguir estes procedimentos, um episódio como a condição de boca travada pode ser gerado com o objetivo de responder perguntas adicionais, como a função inicial da Proteína de Choque Térmico 27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como usar o RNA de interferência específico para a Proteína de Choque Térmico 27 para avaliar o papel potencial da Proteína de Choque Térmico 27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Não se esqueça de que trabalhar com RNA de interferência e reagentes pode ser perigoso, e equipamentos de proteção, como uma cabine de segurança biológica e máscara protetora, devem ser sempre utilizados ao realizar esses procedimentos.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

A triagem de RNA inibitória pequena de alta taxa de transferência é uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e validação de modelos de exposição e métodos para o rastreio de alto rendimento de fluoreto de hidrogênio e cloropicrina-induzido por lesão epitelial de córnea.

High Throughput Screening de SiRNA para lesão de células epiteliais de cloropicrina e córnea induzida pelo fluoreto do hidrogênio

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto das doenças.

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.

Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários

Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

Cura da ferida corneal de zebrafish: da abrasão à análise de imagem de fechamento da ferida

O presente trabalho descreve um novo protocolo experimental que utiliza um suporte impresso em 3D para permitir imagens de células vivas de alta resolução de globos enucleados. Através deste protocolo, a atividade de sinalização celular de cálcio no epitélio corneano ferido de globos ex vivo pode ser observada em tempo real.

Imagem de células vivas de globos ex vivo intactos usando um novo suporte impresso em 3D

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

Aprenda a usar RNA de interferência específico para HSP27 para avaliar o papel da proteína de choque térmico 27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Este método permite estudar funções proteicas em células epiteliais.

Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial (Vídeo) | JoVE Journal

Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

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Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial