Investigação baseado no RNA de interferência da função da proteína de choque térmico 27 ​​durante a cicatrização de feridas da córnea epitelial

O objetivo geral deste ensaio de transfecção de RNA é usar o pequeno RNA interferente específico de HSP27 para avaliar o papel potencial de HSP27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a função da Proteína de Choque Térmico 27 durante o processo de cicatrização de feridas epiteliais. A principal vantagem desta técnica é que o pequeno RNA interferente é uma sacarose de RNA sensível criada para atingir especificamente um transcrito de RNA mensageiro para induzir sua degradação.

Tem sido usado para identificar novos processos celulares no espaço de pragas. Embora essa técnica possa fornecer informações sobre a cicatrização de feridas epiteliais da córnea, ela também pode se aplicar a outro sistema, como pele e mucosa. Demonstrando o procedimento estará Soon-Suk Kang, um técnico do meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, cultive células epiteliais da córnea humana em uma placa de seis poços com meio de crescimento do epitélio brônquico a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono até que 95 por cento de confluência. Em seguida, dilua 2,5 micro litros ou 7,5 micro litros do reagente de transfecção com 100 micro litros de soro reduzido para transfecção. Em seguida, dissolva o siRNA específico de HSP27 e o siRNA controlado mexido em 100 microlitros ou meio de soro reduzido para criar 10 nanomolares de siRNA específico de HSP27 e 15 nanomolares de siRNA de controle mexido, respectivamente.

Em seguida, misture 100 microlitros de solução de siRNA com 100 microlitros de reagente de transfecção diluído e incube a mistura por 15 minutos em temperatura ambiente. Posteriormente, adicione complexos lipídicos de siRNA às células. Após uma incubação de quatro horas, mude o meio para o meio de crescimento do epitélio brônquico completo e incube as células dois dias a 37 graus Celsius antes da análise de western blot.

Nesta etapa, extraia HCECs transfectados com siRNA de controle específico e embaralhado HSP27 em um gabinete de segurança biológica usando 100 microlitros de tampão de lise gelado. Em seguida, incube as células por 30 minutos no gelo para induzir a lise celular. Em seguida, centrifugar os lisados a 10 000 vezes G durante 15 minutos.

Em seguida, transfira os sobrenadantes para tubos frescos de 1,5 mililitro e armazene-os a 80 graus Celsius negativos. Depois disso, determine as concentrações de proteína dos litatos celulares usando o ensaio de proteína de Bradford. Em seguida, carregue as amostras com quantidades iguais de proteínas celulares totais em um gel de acrilamida a 10% ou 12%.

Submeta o gel à página SDS e transfira eletroforeticamente as bandas de proteínas separadas para os filtros de nitrocelulose com 200 miliamperes de corrente por uma hora e quatro graus Celsius. Em seguida, bloqueie as membranas do filtro de nitrocelulose com cinco por cento de leite desnatado em TBST por uma hora. Em seguida, adicione anticorpos primários e incube as membranas durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador.

No dia seguinte, lave as membranas três vezes com TBST, permitindo dez minutos para cada lavagem. Em seguida, detecte as bandas imunolreativas usando anticorpos anti-coelho de cabra conjugados com peroxidase de rábano em cinco por cento de BSA. Em seguida, incubar as membranas nos reagentes de luminol de western blotting durante um minuto à temperatura ambiente.

Remova a membrana da solução reagente. Em seguida, retire o excesso de líquido com uma toalha absorvente e coloque-os em um protetor de folha de plástico. Em seguida, coloque a membrana coberta em um de filme com o lado da proteína voltado para cima.

Coloque um filme de raio-x em cima das membranas e exponha-o por um minuto. Em um gabinete de segurança biológica, faça uma ferida arrastando uma ponta de pipeta estéril pelas culturas confluentes de HCECs transfectados com siRNA de controle específicos ou mexidos com HSP27. Imediatamente após a ferida, lave as células duas vezes com 1XPBS e mantenha-as em meio de crescimento de epitélio brônquico a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por 24 horas.

24 horas após a ferida, tire a imagem dos HCECs usando um microscópio vertical a 100x e execute o achatamento do fundo usando o comando de filtro no software de análise de imagem. Usando o comando select measures, defina a área de interesse com a forma poligonal do mesmo tamanho que pode cobrir a ferida inicial perpendicularmente de ponta a ponta. Em seguida, determine três áreas de interesse diferentes na área ferida de cada amostra.

Conte automaticamente o número da célula em cada campo usando a opção de menu de medição de tamanho de contagem. A análise de Western blot mostrada aqui revelou que a expressão de HSP27 fosforilada e Akt fosforilada foi significativamente reduzida. Enquanto a expressão de backs foi significativamente aumentada em HCECs transfectados com siRNA específicos para HSP27.

A expressão fosforilada de HSP27 foi reduzida em 30% e 40% em 10 nanomolares e 15 nanomolares de células transfectadas de siRNA específicas para HSP27, respectivamente, em comparação com células transfectadas de siRNA de controle. Além disso, a expressão de HSP27 não fosforilada foi reduzida em 20 por cento e 30 por cento em dez nanomolares e 15 nanomolares de células transfectadas de siRNA específicas de HSP27, respectivamente. O ensaio de ferida direcional induzida por arranhão indicou que 24 horas após a ferida, células transfectadas de siRNA específicas para HSP27 em 10 e 15 nanomolares exibiram migração reduzida.

Além disso, os HCECs transfectados com siRNA específicos para HSP27 sofreram mais morte celular apoptótica e necrótica em comparação com as células transfectadas de siRNA de controle embaralhadas mostradas por citometria de fluxo. Uma vez dominada, a técnica de transfecção de RNA pode ser feita em 24 horas se for realizada corretamente. Após esses procedimentos, um episódio como a boca bloqueada pode ser gerado para responder a perguntas adicionais, como a função inicial da Proteína de Choque Térmico 27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o pequeno RNA interferente específico da Proteína de Choque Térmico 27 para avaliar o papel potencial da Proteína de Choque Térmico 27 na cicatrização de feridas epiteliais da córnea. Não se esqueça de que trabalhar com pequenos RNAs e reagentes interferentes pode ser perigoso e precursores como uma cabine de segurança biológica e máscara protetora devem sempre ser usados durante a execução desses procedimentos.