Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

O objetivo geral é fornecer um ensaio simples para medir a comunicação intercelular juncional através de uma população de células de mamíferos que pode atender a uma ampla gama de necessidades farmacológicas e toxicológicas in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da toxicologia, como se um composto afeta o desenvolvimento ou a manutenção de um tecido, desregulando a comunicação intercelular da junção comunicante. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma avaliação simples e rápida da função da junção comunicante em uma grande população de células em resposta a tóxicos e toxinas.

Demonstrando o procedimento estará Ajna Uzuni, assistente de pesquisa de graduação do meu laboratório. Para iniciar o experimento, semeie três vezes 10 elevado ao quinto WB-F344 células epiteliais do fígado de rato em placas de cultura de 35 milímetros de diâmetro contendo meio modificado de Eagle mais 5% de soro fetal-bovino. Cultive as células em uma incubadora até atingirem 100% de confluência e continue com o tratamento experimental das células.

Para continuar com os experimentos de dose-resposta, adicione 10 microlitros e 20 microlitros de uma solução estoque de dois milimolares previamente preparada de fenantreno em 100% de acetonitrila e quatro microlitros, seis microlitros e oito microlitros de uma solução estoque de 20 milimolares de fenantreno em 100% de acetonitrila a três placas de células contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução estoque. Em seguida, adicione quatro microlitros, seis microlitros, oito microlitros, 10 microlitros e 20 microlitros de uma solução a 100% de acetonitrila a três placas de células contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução de acetonitrila para servir como controle do veículo. Depois de adicionar a acetonitrila, incube as placas.

Para realizar experimentos de resposta ao tempo, adicione sete microlitros de uma solução estoque de 20 milimolares de fenantreno em acetonitrila a 100% a três placas de células, contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada ponto de tempo. Em seguida, adicione sete microlitros de acetonitrila a 100% a três placas de células, contendo dois mililitros de meio de crescimento para cada ponto de tempo, para servir como controle do veículo. Incube as placas para cada ponto de tempo designado.

Descarte o meio de cultura despejando suavemente o meio. Enxágue as células com três mililitros de PBS e transvase ou aspire entre os enxágues. Pipete um mililitro de um miligrama por mililitro de corante amarelo de lúcifer dissolvido em PBS em cada placa celular.

Pré-carregue o corante nas células apertando o bisturi entre o dedo indicador e o polegar. Coloque o bisturi perpendicular e a cinco milímetros da borda da placa de cultura e, em seguida, use a gravidade para permitir que o bisturi role suavemente desse ângulo perpendicular para um ângulo de 15 graus. Role a lâmina através de uma população de células em três áreas diferentes da placa total.

Em seguida, incube as células com a solução LY por três minutos em temperatura ambiente. Transvase ou aspire o LY e enxágue as células para remover todo o corante extracelular e eliminar a fluorescência de fundo extracelular. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de uma solução de formalina tamponada com fosfato a 4% para fixar as células.

Visualize as células fixas usando um microscópio de epifluorescência com ampliação de 200x. Alinhe todas as placas de modo que a linha de recuo fique paralela ao campo de visão horizontal. Uma série de imagens SL-DT foi gerada de células epiteliais hepáticas de ratos WB-F344 tratadas com doses crescentes de fenantreno.

A diminuição na migração do corante fluorescente amarelo de lúcifer é causada pelo aumento das doses de fenantreno, demonstrando a crescente inibição induzida por tóxicos da comunicação intercelular da junção comunicativa, ou GJIC. A fração dos valores de controle, ou FOC, obtida a partir das imagens SL-DT foi calculada, analisada estatisticamente e, em seguida, representada graficamente. Após este procedimento, outros métodos, como western blots de proteínas de transdução única, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.

Tipo, esses compostos estão ativando eventos mitogênicos de perfuração celular?