Name: Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprenda a técnica de transferência de corante fluorescente por carga de bisturi para avaliar a comunicação intercelular por junções comunicantes em células epiteliais hepáticas de rato WB-F344. Este método simples e rápido permite estudar os efeitos de toxicantes na homeostase tecidual.

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O protocolo deste estudo foi aprovado pelo Animal Care e do Comitê Utilização dos Institutos Nacionais de Ciências da Saúde do Japão, que é onde o in vivo experimentos foram feitos, para garantir que os ratos foram tratados com humanidade e com respeito pelo alívio do sofrimento. 1. SL-DT Bioensaio <ol><li> Semente de 3 x 10 5 WB-F344 células epiteliais de fígado de rato Onto 35 mm placas de cultura de diâmetro contendo Eagles modificado médias mais soro bovino fetal a 5%, e cultivar as células em uma incubadora a 37 ° C, 100% de humidade relativa (HR), 5% CO 2. </li><li> Cultivar as células até atingirem 100% de confluência (tipicamente, 2 dias) e realizar o tratamento experimental desejado das células, tal como descrito abaixo. <ol><li> Conduzir experimentos Dose Response <ol><li> Adicionar 10 ul e 20 ul de uma solução-mãe 2 mM de fenantreno, em 100% acetonitrilo e 4 mL, 6 uL e 8 uL de uma solução de estoque 20 mM de phenanthrene em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução de estoque. </li><li> Adicionar 4 mL, 6 uL, 8 uL, 10 uL, e 20 ul de uma solução 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada volume adicionado de solução de acetonitrilo para servir como controlo de veículo. </li><li> Incubar as placas durante 15 min numa incubadora a 37 ° C, 100% de humidade relativa e 5% de CO 2. </li><li> Avance para o passo 1.3. </li></ol></li><li> Experiências de resposta à conduta horárias <ol><li> Adicionar 7 ul de uma solução de estoque 20 mM de fenantreno, em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada ponto de tempo (isto é, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min). </li><li> Adicionar 7 ul de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento para cada ponto de tempo para servir como controlo de veículo. </li><li> Incubar as placas para cada tempo p designadoonto numa incubadora a 37 ° C, 100% de humidade relativa e 5% de CO 2. </li><li> Avance para o passo 1.3. </li></ol></li><li> Conduzir experimentos de tempo de recuperação <ol><li> Adicionar 7 ul de uma solução de estoque 20 mM de fenantreno, em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento durante 15 min. </li><li> Adicionar 7 ul de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento durante 15 min para servir como controlo de veículo. </li><li> Decanta-se o meio contendo o fenantreno ou acetonitrilo e lavar 3x cada uma com 3 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco a cada placa e incubar durante os tempos de recuperação desejado (isto é, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) numa incubadora a 37 ° C, 100 % de HR e 5% de CO 2. </li><li> Avance para o passo 1.3. </li></ol></li><li> Experimentos Mecanismo de Conduta <ol><li> Adicionar o inibidor da transdução de sinal, isto é, </li><li> Adicionar 5 mL de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento durante 15 min para servir como controlo de veículo. </li><li> Adicionar 7 ul de uma solução de estoque 20 mM de fenantreno, em 100% de acetonitrilo para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento mais do D609 para um adicional de 15 min. </li><li> Adicionar 7 ul de acetonitrilo a 100% para três placas de células contendo 2 ml de meio de crescimento mais acetonitrilo a 100% durante mais 15 minutos adicionais para servir como controlo de veículo. </li><li> Avance para o passo 1.3. </li></ol></li></ol></li><li> Descartar o meio de cultura por ambos os suavemente decantar o meio ou por sucção a vácuo. Nota: Descarte meio de cultura contendo resíduos perigosos de forma adequada. </li><li> Enxaguar as células três vezes cada uma com 3 ml de PBS e decantar ou seja aspirado entrn lavagens. </li><li> Pipete 1 mL de 1 mg / ml de corante Amarelo Lúcifer dissolvido em PBS (LY) em cada placa de células. </li><li> Pré-carregar o corante dentro das células por laminagem suavemente uma lâmina de aço cirúrgica # 20, com uma borda arredondada através de uma população de células em três diferentes áreas da placa. <ol><li> Comece colocando o bisturi perpendicular (90 ° de ângulo) e 5 mm da aresta da placa de cultura, e, em seguida, enrolar o bisturi a partir deste ângulo perpendicular a cerca de um ângulo de 15 ° (ver a Figura 1). Nota: Isto é conseguido por beliscar o bisturi entre o dedo indicador eo polegar. Use gravidade para permitir que o bisturi de ir suavemente a partir dos 90 ° a 15 ° posição (como a lâmina arredondada simplesmente rola sobre as células). Este movimento vai deixar uma linha de recuo visualmente perceptível. </li></ol></li><li> Incubam-se as células com a solução LY durante 3 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Decantar ou aspirar o LY e lavar três vezes com 3 ml de PBS para remover todas as extracellular corante extracelular para eliminar a fluorescência de fundo. </li><li> Adicionar 0,5 ml de solução de formalina tamponada com fosfato a 10% para fixar as células. Nota: Após a fixação em formol, o ar seco das células e armazenar no escuro por até dois anos com fotobranqueamento mínimo do corante LY. Quando necessário, re-hidratados com uma solução de formalina a 10% para visualizar a frente de corante fluorescente. </li><li> Ver as células fixadas utilizando um microscópio de epifluorescência, equipado com um cubo dicróico para picos de excitação / emissão de 428/536 nm com uma ampliação de 200X. Alinhar todas as placas de modo a que a linha de indentação é paralelo ao campo de visão horizontal. Nota: Um cubo com FITC dicróico funciona bem. <ol><li> Capturar a imagem com uma câmera CCD e software de apoio. <ol><li> Abra o software de suporte para a câmera CCD e usar as configurações de exposição automática. Use o botão "captura" para adquirir digitalmente a imagem. Salve a imagem como arquivos .tif utilizando o botão "Save". </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Adaptação do SL-DT Ensaio para o tecido do fígado <ol><li> Retirar a cerca de 2 x 2 cm, fatia do lóbulo esquerdo do fígado de um 5 semanas de idade, do sexo masculino Fischer 344 ratos usando tesouras de dissecação e coloque-o em um plástico pesam prato coberto com gaze molhada 12. </li><li> Pipetar 0,5 ml de uma solução de PBS contendo 1 mg / mL de cada um de placa amarela lucifer e rodamina-dextrano (RD) sobre a superfície da fatia de fígado no plástico pesar. Nota: O RD é um corante que não pode atravessar os canais de junções de hiato e irá marcar as células que foram carregados. </li><li> Adicione três a cinco incisões aproximadamente 1 cm de comprimento na superfície da fatia de fígado, que possui a solução de corante na placa de pesagem com uma lâmina afiada e, em seguida, adicionar corante adicional suficiente para preencher as incisões. </li><li> Incubar o tecido durante 3 minutos à temperatura ambiente sobre a placa de plástico pesar. </li><li> Lavar três vezes com 5 ml de PBS. </li><li> Fixar o ove tecidornight em 30 ml de formalina a 10% tamponada com fosfato em um tubo de centrífuga de 50 mL cónico, no escuro, à temperatura ambiente. </li><li> No dia seguinte, lave as fatias com água, cortar o tecido ao redor da incisão com dissecando tesoura em 1 x 1 x 0,5 centímetros 3 tiras e, em seguida, usar técnicas padrão para incorporar as fatias em parafina 13. </li><li> Seção as fatias perpendiculares à linha de incisão para espessura de 5 mm e armazenam as amostras no escuro até pronto para ser fotografada usando técnicas de seccionamento padrão com um micrótomo 13. </li><li> Use um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera digital CCD de visualizar e capturar as imagens das frentes de corantes fluorescentes de acordo com a secção 1.10 7. </li></ol> 3. Quantificação GJIC <ol><li> Medir o corante fluorescente propagação usando um pacote de software morfométrica (por exemplo, ImageJ). <ol><li> Clique na guia "Arquivo" e clique em "Abrir" para abrir osalvo imagem. </li><li> Clique em "Ferramenta de Mão Livre" na guia Barra de Ferramentas para traçar o contorno da frente de corante. </li><li> Clique na guia "Analisar" e clique em "Measure". Nota: Isso irá gerar um valor de área em uma planilha, que pode ser copiado para outros programas de planilha, se desejar. </li></ol></li><li> Usando um programa de folha de cálculo, calcular a fracção do controle (FOC) é calculada dividindo a área da propagação corante na placa experimental pela área do corante percorrida na placa de controlo utilizando a seguinte equação: <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg"> Um E = área da propagação de corante em células expostas a uma variável experimental, tais como as células tratadas com um produto químico em uma dose ou tempo específico Um c = área da difusão do corante no controlo, que são as células tratadas com o veículo utilizado para dissolver a substância química de interesse Nota: Para determinar o efeito do veículo,A e seria a área da propagação de corante em células tratadas com o veículo e um c seria a área da propagação de corante em células não tratadas com o veículo. O efeito do veículo deve de preferência ser inferior a 10%. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

O ensaio de SL-DT é uma técnica simples e versátil para medir GJIC, mas existem várias preocupações críticas que deveriam ser contabilizados na concepção de protocolos experimentais apropriados. Para medições consistentes de CIJH utilizando o ensaio de SL-DT deve haver um bom corante propagação da LY através de junções das células. No mínimo, um tempo adequado deve ser seleccionado para assegurar que a tinta se espalha através de oito ou mais linhas de células a partir de células de bisturi carregado em ambas as direcçõ...

O objectivo geral do presente método é o de proporcionar uma técnica simples, relativamente barato e abrangente para avaliar a toxicidade potencial dos compostos. Esta é uma abordagem in vitro que pode ser usado em várias linhas celulares. laboratórios de biologia celular standard equipados com microscópios de epifluorescência pode conduzir pesquisas com este ensaio. Nosso conhecimento básico de funções celulares tem sido altamente dependente de bioensaios in vitro, e tornou-se um componente essencial nas avaliações toxicológicas de produtos farmacêuticos, poluentes ambientais e alimentares nascido contaminantes. Infelizmente, não existe um único sistema in vitro bioensaio que podem exaustivamente atender às demandas de todas as avaliações toxicológicas. Muitos ensaios in vitro foram concebidas e optimizadas para avaliar, assim como um ponto de extremidade avaliar bioquímica ou molecular específico. Estes são muitas vezes combinados em uma alta taxa de transferência configurado de modo a reflectir uma perturbação de umdeterminada via de transdução de sinal, tais como estrogénio-receptor de sinalização 1. Esta estratégia tem sido bastante bem sucedido, mas o número grande de vias de transdução de sinais envolvidos na expressão do gene torna a tarefa de escolha de uma via de sinalização específicas para avaliar bastante complexa. Elevadas protocolos através colocam-estão actualmente a ser desenvolvidos e utilizados para medir simultaneamente numerosas vias de sinalização, o que tem sido uma abordagem para ultrapassar algumas das limitações dos ensaios individuais. No entanto, nem todas as vias de sinalização foram incorporados com sucesso em abordagens mais abrangentes, além de novas vias de sinalização estão constantemente a ser descoberto que torna ainda mais complicado esse processo de avaliação. Utilizando números extensos de abordagens in vitro, particularmente elevada por meio-put sistemas, para avaliações toxicológicas abrangentes também são muito caros e não são conducentes a maioria investigador único liderado projectos de investigação. GJIC é um tig processohtly controlada por mudanças na tensão, concentração de cálcio, pH, equilíbrio redox, reguladas pelas principais vias de transdução de sinal intracelular e interações com proteínas da membrana e do citoesqueleto 2,3. Assim, a inibição da CIJH pode reflectir diferentes tipos de stress celular, disrupção de funções celulares diferentes, ou perturbações de diferentes vias de transdução de sinal. Outra abordagem para superar o uso de bioensaios de transdução de sinal é limitado para tirar partido dos fenómenos biológicos que muitos, se não a maioria, vias de transdução do sinal modulado são ainda por sistemas de sinalização intercelular cooperativas através de canais de junções de hiato 4-8. Embora os sistemas de sinalização intercelular também são numerosos e sob controlo via múltipla, a sinalização intercelular através de canais de junções de hiato é em última análise, uma função dos canais a ser aberta, parcialmente fechado ou completamente fechado. Isto proporciona um ponto de extremidade, que pode ser facilmente medida utilizando váriasem sistemas de bioensaio in vitro 7. Considerando-se que o ponto de regulação homeostático de um tecido requer canais abertos, a determinação do efeito dos compostos sobre junções de hiato comunicação intercelular (CIJH) é uma abordagem mais abrangente na determinação de potenciais efeitos tóxicos de compostos 4,8. Na sua essência, este fenómeno biológico crítico que desempenha um papel central na coordenação de múltiplos eventos de transdução de sinais que controlam a expressão de genes permite uma avaliação global de efeitos tóxicos. Assim, os bioensaios para avaliar a CIJH é um excelente ponto de partida para avaliar o potencial tóxico de compostos. As técnicas mais extensas utilizados para avaliar a CIJH são baseados em pré-carregamento de células com uma sonda fluorescente e, em seguida, o controlo da migração do corante a partir da célula ou células carregado para células adjacentes. Técnicas para pré-carregar o corante ter envolvido microinjeção 9, raspar de carga 10 e metil ésteres das sondas 11 </sup&gt;. A bisturi de carga-fluorescente de transferência de corante (SL-DT) é uma modificação do método de carga de raspagem - tingir ensaio de transferência desenvolvida pela El Fouly 10. Em vez de a raspagem mais invasivo, o método bisturi carregamento deste relatório envolve um rolo suave de um bisturi com uma lâmina redonda através de uma monocamada de células que minimizam os danos invasiva (figura 1). As vantagens desta técnica são a avaliação toxicológica de uma população de células, em vez de células individuais do ensaio de micro-injecção. Além disso, a simplicidade desta ensaio permite a detecção rápida de várias placas num curto período de tempo enquanto que os métodos que utilizam técnicas e técnicas que usam os ésteres metílicos de sondas fluorescentes microinjecção são significativamente mais demorado e requer consideravelmente mais elevado nível de habilidade. Embora não haja nenhum método único para atender a todas as necessidades de estudar GJIC; o ensaio de SL-DT é um ensaio simples, relativamente barato e versátil que podesatisfazer muitas das necessidades de avaliações iniciais de toxicidade de diversos compostos. As principais vantagens incluem: simplicidade, não há necessidade especial para o equipamento ou capacidades que são necessários para outros métodos, tais como micro-injecção, recuperação de fluorescência após a fotodegradação de ensaio (FRAP) e activação de locais de ensaios com sondas fluorescentes moleculares, uma avaliação rápida e simultânea da CIJH em um grande número de células, conducente a uma alta taxa de set-up com imagens de fluorescência e análise automatizada microscopia, bem como a sua adaptabilidade para estudos in vivo.

<table><tbody><tr><td>Células epiteliais do fígado de rato WB-F344</td><td>Dos Drs. J. W. Grisham e M. S. Tsao da Universidade da Carolina do Norte (Chapel Hill, NC)</td><td>nenhuma</td><td>Fornecido pelos Drs. J. W. Grisham e M. S. Tsao Universidade da Carolina do Norte-Chapel Hill-NC</td></tr><tr><td>Placas de cultura de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>frascos de cultura de 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, um meio modificado Eagles&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>Fórmula No. 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>tampão fosfato salina</td><td>caseiro</td><td>veja abaixo para o ingrediente cat#'s</td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>KCl JT</td><td>Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, sal de lítio</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>rodamina-dextrano</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-metilantraceno</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>phenanthrene</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>resveratrol</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>Tocris Biociência&nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>acetonitril</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>37% solução formaldeído</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 lâmina cirúrgica</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos estéreis de 50 ml</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>microscópio de epifluorescência Nikon&nbsp;</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FITC cubo dicróico</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>câmera CCD</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon Cool Snap EZ CCD</td><td></td></tr><tr><td>sistema de imagem</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon NIS-Elements F2.2 sistema de imagem.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Instituto Nacional de Saúde</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e benefícios para a saúde de produtos naturais

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Este protocolo descreve uma técnica (SL-DT) bisturi carregamento-corante fluorescente transferência que mede a comunicação intercelular através de canais de junções de hiato, que é um importante processo intercelular através da qual a homeostase do tecido é mantida. A interrupção da comunicação intercelular por junções de hiato (CIJH) por agentes tóxicos, toxinas, fármacos, etc. tem sido associada a numerosos efeitos prejudiciais à saúde. Muitas doenças humanas genéticas à base de ter sido associada a mutações nos genes de junções de hiato. A técnica de SL-DT é um ensaio funcional simples para a avaliação simultânea de CIJH em uma grande população de células. O ensaio envolve as células de pré-carregamento com um corante fluorescente através da perturbação da membrana celular brevemente com uma lâmina de bisturi através de uma população de células. O corante fluorescente é então deixada a atravessar através de canais de junções de hiato às células vizinhas por um tempo designado. O ensaio é então terminada através da adição de formalina para as células. A propagação do fluodye rescent através de uma população de células é avaliada com um microscópio de epifluorescência e as imagens são analisadas com qualquer número de pacotes de software morfométricas que estão disponíveis, incluindo pacotes de software livres encontrados no domínio público. Este ensaio também foi adaptado para estudos in vivo utilizando fatias de tecido de vários órgãos de animais tratados. No geral, o ensaio de SL-DT pode servir uma ampla gama de necessidades farmacológicos e toxicológicos in vitro, e pode ser potencialmente adaptado para sistemas set-up alto rendimento com imagens de microscopia de fluorescência automatizada e análise para elucidar mais amostras em menos tempo.

Interrupção da GJIC tem sido amplamente utilizada como um biomarcador para identificar compostos tóxicos ao nível genotóxica, epigenética de controle do gene que induz efeitos adversos à saúde 14. Por exemplo, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são contaminantes ubíquos do meio ambiente, mas variam em suas toxicidades epigenéticas em função das suas estruturas moleculares 15. Os PAHs de baixo peso molecular são normalmente encontrados em concentrações re...

Este protocolo descreve uma técnica de transferência de bisturi de carga e corante fluorescente que mede comunicação intercelular através dos canais de junções de hiato. Gap comunicação intercelular juncional é um importante processo celular pelo qual a homeostase do tecido é mantido e ruptura dessa sinalização celular tem efeitos adversos para a saúde.

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

O objetivo geral é fornecer um ensaio simples para medir a comunicação intercelular juncional através de uma população de células de mamíferos que pode atender a uma ampla gama de necessidades farmacológicas e toxicológicas in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da toxicologia, como se um composto afeta o desenvolvimento ou a manutenção de um tecido, desregulando a comunicação intercelular da junção comunicante. A principal vantagem dessa técnica é que ela oferece uma avaliação simples e rápida da função da junção comunicante em uma grande população de células em resposta a tóxicos e toxinas.Demonstrando o procedimento estará Ajna Uzuni, assistente de pesquisa de graduação do meu laboratório. Para iniciar o experimento, semeie três vezes 10 elevado ao quinto WB-F344 células epiteliais do fígado de rato em placas de cultura de 35 milímetros de diâmetro contendo meio modificado de Eagle mais 5% de soro fetal-bovino. Cultive as células em uma incubadora até atingirem 100% de confluência e continue com o tratamento experimental das células.Para continuar com os experimentos de dose-resposta, adicione 10 microlitros e 20 microlitros de uma solução estoqu

gap-junctional-intercellular-communication-functional-biomarker-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um ensaio de freqüência de adesão para medir cinética de interação receptor-ligante, quando ambas as moléculas estão ancoradas nas superfícies das células que interagem é descrito. Este ensaio mecanicamente baseado é exemplificado usando uma micropipeta pressurizado glóbulo vermelho humano como sensor de adesão e integrinas αLβ2 e molécula-1 de adesão intercelular como interagindo receptores e ligantes.

Ensaio de aderência de freqüência para In Situ Análise Cinética de Cross-juncional interações moleculares na interface célula-célula

Descrevemos aqui como executar uma microinjeção de uma única célula de Lucifer Yellow visualizar comunicação celular via gap-junções em células vivas, e fornecer algumas dicas úteis. Esperamos que este trabalho irá ajudar a todos para avaliar o grau de acoplamento celular devido à junções comunicantes funcionais. Tudo o descrito aqui pode ser, em princípio, adaptado para outros corantes fluorescentes com peso molecular inferior a 1.000 Daltons.

Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Esta apresentação demonstra um método pelo qual a eletroporação de células aderentes e cultivadas é usada para o estudo da comunicação intercelular e juncional, enquanto as células crescem em uma lâmina revestida com óxido de índio-estanho condutor e transparente.

Um ensaio funcional para juncional Exame; Eletroporação de aderentes em células no Índio-Tin Oxide

Ensaios aprimorados de neurotoxicidade in vitro ajudariam na identificação de novos compostos neuroprotetores. A utilidade de um analisador celular baseado em impedância em tempo real para determinar a citotoxicidade e citoproteção em linhagens celulares neuronais e delinear o envolvimento das vias do segundo mensageiro, obtendo assim informações sobre o mecanismo de neuroproteção é apresentada.

Analyzer celular baseado em impedância Real-Time como uma ferramenta para delinear vias moleculares envolvidas na neurotoxicidade e neuroproteção em uma linha de células neuronais

Os protocolos descrevem dois sistemas in vitro de testes de toxicidade de desenvolvimento (UKK e UKN1) com base em células estaminais embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Os sistemas de teste prever risco de toxicidade para o desenvolvimento humano, e pode contribuir para reduzir os estudos em animais, dos custos e do tempo necessário para os testes de segurança química.

Human células estaminais pluripotentes Baseado Developmental Toxicity Ensaios para Química Triagem e Safety Systems Biology Data Generation

A investigação da migração precoce de células endoteliais (EEC) é importante para entender a fisiopatologia de certas doenças e potencialmente identificar novas estratégias para intervenção terapêutica. O protocolo a seguir descreve técnicas para avaliar a migração celular que foram adaptadas para a investigação da EEC.

Avaliação da migração de células endoteliais após a exposição a produtos químicos tóxicos

Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio de comunicação intercelular junção romance lacuna projetado para o rastreio da elevado-produção de químicos de junção-modulando de lacuna para descoberta de drogas e avaliação toxicológica.

Um ensaio de comunicação intercelular junção iodeto-amarelo fluorescente proteína-Gap

Este protocolo apresenta uma técnica automatizada de alto rendimento baseada em imagem para identificar compostos que modulam a morte de células de câncer de mama mediadas por células natural killer na presença de um anticorpo terapêutico anti-HER-2.

Ensaio de Triagem de Alto Conteúdo para Identificação de Compostos Modificadores de Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpos

A técnica de dissecção para a remoção do giro dentado de camundongos adultos sob um estereomicroscópio foi demonstrado neste protocolo de vídeo-gravadas.

Dissecção do giro denteado do hipocampo de rato adulto

Não fixadas amostras de tecidos congelados embebidos em meio óptimo de temperatura de corte (OCT) podem ser usados ​​para estudar a distribuição natural e glicosilação de muco secretado. Neste processamento de tecidos abordagem é mínima e a apresentação natural de glicolípidos, mucinas e glicano-epítopos é preservada. As secções de tecido podem ser analisados ​​por imuno-histoquímica utilizando detecção por fluorescência ou cromogénico.

Usando unfixed, tecidos congelados para estudar a distribuição de mucina Natural

Aprenda a técnica de transferência de corante fluorescente por carga de bisturi para avaliar a comunicação intercelular por junções comunicantes em células epiteliais hepáticas de rato WB-F344. Este método simples e rápido permite estudar os efeitos de toxicantes na homeostase tecidual.

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais (Vídeo) | JoVE Journal

Gap juncional intercelular comunicação: um biomarcador funcional para avaliar os efeitos adversos de tóxicos e toxinas, e Benefícios para a saúde de produtos naturais

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