High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio
20 de setembro de 2016
Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.
O objetivo geral deste ensaio cromogênico é rastrear várias enzimas em um formato de alto rendimento contra uma seleção de diferentes substratos cromogênicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de enzimas, como encontrar novas atividades enzimáticas para a degradação da biomassa. A principal vantagem desta técnica é que os substratos cromogênicos estão disponíveis em quatro cores diferentes, tornando esta técnica de alto rendimento, extremamente confiável e econômica.
Para começar, ative a placa do kit de ensaio de filtro de 96 poços adicionando 200 microlitros de solução de ativação a cada poço. Incube em temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos. Use uma centrífuga e qualquer placa padrão de 96 poços para coleta.
Para reduzir a rotação da solução de ativação existente, adicione 100 microlitros de água estéril ao polímero cromogênico, hidrogel ou substratos CPH e aplique um vácuo ou centrifugação para remover o estabilizador. Repita a lavagem mais duas vezes. Para preparar a reação enzimática, adicione 150 microlitros de tampão acetato de sódio 100 mM, pH 4,5 e 5 microlitros de solução de endocelulase com três concentrações diferentes para cada poço da placa do kit de ensaio.
Coloque a placa do produto embaixo da placa do kit de ensaio para coletar qualquer vazamento potencial da placa de reação durante a agitação. Em seguida, incubar a placa do kit de ensaio à temperatura ambiente num agitador horizontal a 100 rpm durante 30 minutos. Para receber dados confiáveis, é necessário agitar a mistura de reação durante a incubação.
Coloque a placa do kit de ensaio com a placa do produto embaixo dela na centrífuga e gire a 2.700 x g por 10 min. Para transferir o produto da reação para os poços da placa do produto. Após a centrifugação, inspecione visualmente a placa do produto para verificar se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo.
Usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta a 630 nm para os diferentes substratos verdes de CPH. Analise e plote os dados de acordo com o protocolo de texto. Para realizar o ensaio cromogênico com biomassa cromogênica insolúvel vermelha ou palha de trigo ICB, comece adicionando 200 microlitros de solução de ativação em cada poço da placa de ensaio.
Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos. Remova o estabilizador usando 100 microlitros de água estéril para lavar os poços três vezes. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão acetato de sódio 100 mM pH 4,5 e 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de diferentes soluções de endo-xilanase.
Posicione a placa do produto embaixo da placa do substrato para coletar qualquer vazamento potencial da placa do substrato durante a agitação. Incubar a reação à temperatura ambiente a 100 rpm por duas horas. Após a incubação, coloque a placa do kit de ensaio com a placa do produto embaixo dela na centrífuga e desacelere a 2.700 x g por 10 min para transferir o produto da reação nos poços da placa do produto.
Verifique se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo. Em seguida, usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta a 517 nm para palha de trigo ICB vermelha. Realize a análise dos dados de acordo com o protocolo de texto.
Aqui é mostrado um exemplo de uma resposta à dose de CPH-arabinoxilano à xilanase em diferentes concentrações da enzima, onde a diminuição da concentração da enzima pode ser observada visualmente. Uma quantificação espectrofotométrica mais detalhada é usada para traçar a absorbância em relação à concentração da enzima. Com a intensidade do sinal corresponde à atividade enzimática.
Neste exemplo do ensaio usado para triagem enzimática, uma endocelulase foi testada em três concentrações contra diferentes substratos de CPH. Como visto aqui, atividade adicional à celulase foi exibida para CPH-glucano, CPH-xilana, CPH-xiloglucano e baixa atividade foi observada contra CPH-galactomanana Os mesmos substratos de CPH foram digeridos com enzimas comercialmente disponíveis usadas como controles positivos nas mesmas condições.
Os resultados aqui mostram que todos os substratos foram degradados em níveis que aumentaram com o aumento das concentrações enzimáticas. Neste experimento, cinco substratos de ICB foram incluídos com 19 substratos de CPH para analisar as enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium sob três diferentes condições de pH. As enzimas de P. chrysosporium degradaram vários glucanos, amidos e xilanas.
Sinais mais baixos puderam ser detectados para as hemiceluloses arabinan e galactan péctico, bem como para RGI. As enzimas produzidas foram mais ativas em condições ácidas do que em condições neutras ou ligeiramente básicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora, se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de misturar a reação durante a incubação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da triagem de alto rendimento explorarem novas atividades enzimáticas para a biotecnologia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o kit de triagem.
Visão Geral
Este artigo descreve um ensaio cromogênico de alto rendimento para triagem de enzimas utilizando substratos multiplexados. O kit de ensaio inclui substratos de Hidrogel Polimérico Cromogênico (CPH) e Biomassa Cromogênica Insolúvel (ICB) para testar endoenzimas degradadoras de polissacarídeos e proteases.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Triagem enzimática
- Biotecnologia
- Ensaios de alto rendimento
Antecedentes
- A descoberta de enzimas é crucial para diversas aplicações, incluindo a degradação de biomassa.
- Substratos cromogênicos permitem o rastreamento visual da atividade enzimática.
- O ensaio foi projetado para ser confiável e economicamente viável.
- Diferentes substratos fornecem uma variedade de cores para uma análise aprimorada.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para triagem de enzimas contra diversos substratos.
- Identificar novas atividades enzimáticas para degradação de biomassa.
- Facilitar a triagem em alto rendimento na pesquisa de enzimas.
Métodos Utilizados
- Ativação de uma placa de kit de ensaio com filtro de 96 poços com uma solução ativadora.
- Incubação das reações enzimáticas em condições controladas.
- Uso de uma centrífuga para coleta do produto.
- Medição da absorbância em comprimentos de onda específicos para análise de dados.
Resultados Principais
- Foram observadas atividades enzimáticas para diversos substratos de CPH e ICB.
- Concentrações mais altas de enzima levaram a um aumento na degradação do substrato.
- Diferentes substratos exibiram níveis variados de atividade enzimática.
- Condições ácidas aumentaram a atividade enzimática em comparação com condições neutras ou básicas.
Conclusões
- Este ensaio fornece uma plataforma robusta para triagem de enzimas.
- Permite aos pesquisadores explorar atividades enzimáticas novas de forma eficiente.
- O domínio da técnica permite sua execução rápida em menos de uma hora.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A triagem de alta produtividade de enzimas enfrenta gargalos na disponibilidade de substratos e na escalabilidade de ensaios, limitando a caracterização funcional rápida de enzimas ativas sobre carboidratos (CAZymes), essenciais para aplicações industriais em biocombustíveis, têxteis e alimentos. Este ensaio cromogênico preenche essa lacuna tecnológica ao permitir testes multiplexados de substratos com codificação por cores em formato de placa de 96 poços, melhorando a confiança preditiva no estágio inicial da descoberta de enzimas e apoiando decisões de avançar ou interromper no desenvolvimento de enzimas. O método aumenta a continuidade translacional desde a identificação de alvos até a validação semelhante à pré-clínica, fornecendo leituras quantitativas e reprodutíveis de atividade em diversos substratos polissacarídicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de CAZymes putativas ao associar candidatos genéticos à atividade bioquímica em substratos de polissacarídeos definidos.
- Valor Operacional: Apoia testes de hipóteses rápidos por meio de substratos CPH multiplexados por cor, aumentando a produtividade do screening sem comprometer a confiabilidade dos dados.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos mecanicistas mediante a quantificação da atividade enzimática dependente da dose, auxiliando na priorização de alvos para o desenvolvimento de enzimas industriais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece substratos cromogênicos insolúveis padronizados (CPH e ICB) que imitam a biomassa complexa, permitindo avaliações de atividade fisiologicamente relevantes.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade do ensaio por meio de etapas padronizadas de ativação, lavagem e centrifugação, reduzindo a variabilidade em fluxos de trabalho de alto rendimento.
- Valor de Escalabilidade: Compatível com leitores de placas padrão de 96 poços e sistemas de manipulação de líquidos, permitindo a integração em plataformas de triagem existentes para avaliação de coquetéis enzimáticos ou caldos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças por meio da análise da atividade enzimática sob diferentes condições de pH, refletindo ambientes de processos industriais.
- Valor Operacional: Permite decisões de avanço com ajuste de risco ao correlacionar a concentração da enzima com a degradação do substrato em diversos tipos de biomassa (por exemplo, palha de trigo, glucanos, xilanos).
- Valor Preditivo: Aprimora o alinhamento translacional de biomarcadores ao identificar padrões de atividade dependentes de pH, essenciais para a estabilidade de formulações em aplicações de detergentes ou biocombustíveis.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se na continuidade entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, apoiando a verificação de hipóteses, a clarificação de vias metabólicas e a redução de riscos biológicos para enzimas degradadoras de carboidratos antes do investimento em engenharia proteica ou ampliação da fermentação.
- Biologia da Descoberta: Permite a elucidação de vias por meio da triagem da atividade enzimática frente a substratos polissacarídicos específicos (por exemplo, CPH-glucano, CPH-xilano) para inferir especificidade do substrato e função biológica.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios e resultados quantitativos por meio de medições de absorbância em 630 nm (CPH) e 517 nm (ICB), permitindo comparação confiável de variantes enzimáticos ou condições.
- Análises: Fornece dados de resposta dose-dependente que apoiam análise estatística e seleção de hits, ajudando as equipes a classificar candidatos enzimáticos por atividade e especificidade.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao avaliar o desempenho enzimático em condições relevantes para a indústria (por exemplo, pH ácido, substratos de biomassa complexos).
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma plataforma reutilizável para triagem de bibliotecas enzimáticas, caldos ou coquetéis em múltiplos projetos nas indústrias baseadas em biotecnologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir falsos positivos por meio da medição direta da atividade em substratos insolúveis e semelhantes ao estado nativo.
- Valor Operacional: Oferece padronização e reprodutibilidade por meio de volumes definidos de reagentes, tempos de incubação e parâmetros de centrifugação, minimizando a variabilidade dependente do usuário.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a triagem rápida de centenas de candidatos a enzimas, reduzindo o tempo e o custo associados a ensaios bioquímicos de baixo rendimento.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco ao gerar dados quantitativos de atividade que orientam decisões de avançar ou não avançar em campanhas de engenharia de enzimas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cinética enzimática e otimização de ensaios cromogênicos para garantir a preparação precisa do substrato e o monitoramento da reação.
- Depende do acesso a um leitor de placas capaz de medições de absorbância em 630 nm e 517 nm, e de uma centrífuga compatível com placas de 96 poços para a transferência do produto.
- Necessita padronização entre equipes das condições de tampão (por exemplo, acetato de sódio pH 4,5) e dos parâmetros de incubação (por exemplo, agitação a 100 rpm) para assegurar reprodutibilidade entre diferentes locais.
- Envolve considerações de adaptação ao testar substratos não polissacarídicos, já que o ensaio é otimizado para enzimas ativas sobre carboidratos e pode exigir modificações no tampão ou no substrato para outras classes de enzimas.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de evitar agitação durante as etapas de ativação e estabilização, e de confirmar visualmente volumes iguais de produto após a centrifugação para uma interpretação confiável dos dados.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Chromogenic Assay with CPH Substrates, Detection, and Quantification
2:41
Chromogenic Assay with Insoluble Chromogenic Biomass Substrates, Detection, and Quantification
4:15
Results: Enzymatic Degradation of Chromogenic Polymer Hydrogel Substrates
6:02
Conclusion
