High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

O objetivo geral deste ensaio cromogênico é rastrear várias enzimas em um formato de alto rendimento contra uma seleção de diferentes substratos cromogênicos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de enzimas, como encontrar novas atividades enzimáticas para a degradação da biomassa. A principal vantagem desta técnica é que os substratos cromogênicos estão disponíveis em quatro cores diferentes, tornando esta técnica de alto rendimento, extremamente confiável e econômica.

Para começar, ative a placa do kit de ensaio de filtro de 96 poços adicionando 200 microlitros de solução de ativação a cada poço. Incube em temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos. Use uma centrífuga e qualquer placa padrão de 96 poços para coleta.

Para reduzir a rotação da solução de ativação existente, adicione 100 microlitros de água estéril ao polímero cromogênico, hidrogel ou substratos CPH e aplique um vácuo ou centrifugação para remover o estabilizador. Repita a lavagem mais duas vezes. Para preparar a reação enzimática, adicione 150 microlitros de tampão acetato de sódio 100 mM, pH 4,5 e 5 microlitros de solução de endocelulase com três concentrações diferentes para cada poço da placa do kit de ensaio.

Coloque a placa do produto embaixo da placa do kit de ensaio para coletar qualquer vazamento potencial da placa de reação durante a agitação. Em seguida, incubar a placa do kit de ensaio à temperatura ambiente num agitador horizontal a 100 rpm durante 30 minutos. Para receber dados confiáveis, é necessário agitar a mistura de reação durante a incubação.

Coloque a placa do kit de ensaio com a placa do produto embaixo dela na centrífuga e gire a 2.700 x g por 10 min. Para transferir o produto da reação para os poços da placa do produto. Após a centrifugação, inspecione visualmente a placa do produto para verificar se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo.

Usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta a 630 nm para os diferentes substratos verdes de CPH. Analise e plote os dados de acordo com o protocolo de texto. Para realizar o ensaio cromogênico com biomassa cromogênica insolúvel vermelha ou palha de trigo ICB, comece adicionando 200 microlitros de solução de ativação em cada poço da placa de ensaio.

Em seguida, incube a placa em temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos. Remova o estabilizador usando 100 microlitros de água estéril para lavar os poços três vezes. Em seguida, adicione 150 microlitros de tampão acetato de sódio 100 mM pH 4,5 e 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de diferentes soluções de endo-xilanase.

Posicione a placa do produto embaixo da placa do substrato para coletar qualquer vazamento potencial da placa do substrato durante a agitação. Incubar a reação à temperatura ambiente a 100 rpm por duas horas. Após a incubação, coloque a placa do kit de ensaio com a placa do produto embaixo dela na centrífuga e desacelere a 2.700 x g por 10 min para transferir o produto da reação nos poços da placa do produto.

Verifique se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo. Em seguida, usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta a 517 nm para palha de trigo ICB vermelha. Realize a análise dos dados de acordo com o protocolo de texto.

Aqui é mostrado um exemplo de uma resposta à dose de CPH-arabinoxilano à xilanase em diferentes concentrações da enzima, onde a diminuição da concentração da enzima pode ser observada visualmente. Uma quantificação espectrofotométrica mais detalhada é usada para traçar a absorbância em relação à concentração da enzima. Com a intensidade do sinal corresponde à atividade enzimática.

Neste exemplo do ensaio usado para triagem enzimática, uma endocelulase foi testada em três concentrações contra diferentes substratos de CPH. Como visto aqui, atividade adicional à celulase foi exibida para CPH-glucano, CPH-xilana, CPH-xiloglucano e baixa atividade foi observada contra CPH-galactomanana Os mesmos substratos de CPH foram digeridos com enzimas comercialmente disponíveis usadas como controles positivos nas mesmas condições.

Os resultados aqui mostram que todos os substratos foram degradados em níveis que aumentaram com o aumento das concentrações enzimáticas. Neste experimento, cinco substratos de ICB foram incluídos com 19 substratos de CPH para analisar as enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium sob três diferentes condições de pH. As enzimas de P. chrysosporium degradaram vários glucanos, amidos e xilanas.

Sinais mais baixos puderam ser detectados para as hemiceluloses arabinan e galactan péctico, bem como para RGI. As enzimas produzidas foram mais ativas em condições ácidas do que em condições neutras ou ligeiramente básicas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de uma hora, se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de misturar a reação durante a incubação. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da triagem de alto rendimento explorarem novas atividades enzimáticas para a biotecnologia. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o kit de triagem.