Name: High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a realizar ensaios cromogênicos de alta vazão para triagem de enzimas degradadoras de polissacarídeos usando substratos CPH e ICB. Este método permite identificar novas atividades enzimáticas para biotecnologia em menos de uma hora.

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Nós gostaríamos de agradecer ao Prof. J. Paul Knox (University of Leeds, Reino Unido), que permitiu o acesso a seus laboratórios para as filmagens, e Susan E. Marcus pela excelente assistência técnica. JS reconhece o projeto WallTraC (Sétimo Programa-Quadro da Comissão Europeia (acordo de subvenção. No: 263.916) e a biomassa projeto de século 21 (Innovation Foundation Dinamarca; caso no .: 103408) SKK está agradecendo o projeto SET4Future (dinamarquês Strategic Research Council), a Bio-Strategic Value fundada pelo Conselho Dinamarquês para a Investigação Estratégica, o Conselho Dinamarquês de Tecnologia e Inovação (Grant processo nº .: 0603-00522B), e uma abordagem baseada em Biologia para Compreender degradação enzimática de polissacarídeo Sistemas complexos (Grant processo nº .:. 107279) para financiamento Este artigo reflete as opiniões dos autores só a União Europeia não é responsável por qualquer uso que possa ser dado à informação contêm aqui..

1. Cromogênico Ensaio com CPH Substratos num formato de placa de 96 poços <ol><li> A activação do kit de ensaio de placa <ol><li> Activa o filtro de 96 poços (contendo azul CPH-xilano) placa kit de ensaio (Lista de Materiais) por adição de uma solução de 200 ul de activação (obtido com o kit) para cada poço, seguido de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente sem agitação. </li><li> Aplicar vácuo utilizando um colector de vácuo (com o bloco espaçador no interior e qualquer padrão, transparente placa de 96 bem como uma placa de recolha) para remover a solução de activação existente. É também possível usar um centrifugar a 2700 xg durante 10 min para este passo, em vez de o colector de vácuo. </li><li> Lavar os substratos CPH pela adição de 100 ul de água estéril e aplicar vácuo (ou a força centrífuga) para remover o estabilizador. Repita este passo mais duas vezes e as placas estão agora prontos para uso. </li></ol></li><li> reacção enzimática NOTA: Sempre inclua tampãosozinho como um controlo negativo e, se possível, enzimas anteriormente caracterizadas como controlos positivos. Utilize um número estatisticamente apropriado de repetições. Os substratos CPH são estáveis ​​entre pH 3,0-10,0 e o volume total de solução de enzima a extremidade do tampão em cada poço não deve exceder 180 ul. extracto de planta ou caldo de cultura também pode ser usado em vez de solução de enzima purificada. <ol><li> Adicionar 150 ul de 100 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,5 e 5 ul de solução -cellulase endo (para uma concentração final de 1 U / ml) a cada poço da placa de kit de ensaio. </li><li> Coloque a placa produto (uma placa clara-bem compatível com o leitor de microtitulação de placa) por baixo da placa kit de ensaio para recolher qualquer vazamento potencial da placa de reacção durante a agitação. </li><li> Incubar a placa kit de ensaio a 25 ° C durante 30 minutos num agitador horizontal a 150 rpm. NOTA: a reacção de mistura na placa kit de ensaio durante a incubação é crucial para a obtenção de uma consistente e Reproresultado ducible. substratos CPH são estáveis ​​até 90 ° C. O tempo de incubação deve ser aumentada até 24 horas ao testar caldos de cultura contendo concentrações desconhecidas de enzima com os substratos CPH. Note-se que os tempos de incubação apropriados dependem da actividade da enzima (s), mas em geral, se não houver qualquer actividade detectável dentro de 24 horas, é provável que a enzima não degrada o substrato testado. Uma enzima activa é degradar os polissacáridos insolúveis cromogénicos do substrato CPH em oligossacáridos cromogénicos solúveis, que são visíveis na forma de sobrenadante de cor. </li><li> Coloque a placa produto limpo no interior do tubo de vácuo com o bloco espaçador dentro. </li><li> Colocar a placa de kit de ensaio no topo e aplicar vácuo (pressão negativa máxima de -60 kPa). É também possível usar um centrifugar a 2700 xg durante 10 min. NOTA: O filtrado contendo os oligossacarideos coloridas como produto de reacção é agora na placa produto para análise posterior 8 </s-se&gt;. </li></ol></li><li> Detecção e quantificação <ol><li> Verificar que o volume de líquido em cada poço da placa de produto é aproximadamente o mesmo através de inspecção visual. </li><li> Ler a absorbância da placa de coleta em 595 nm para o azul CPH-xilano usando um leitor de placas. </li><li> Ao fazer a análise dos dados, subtraia o buffer de somente valores de controlo negativo a partir dos valores dos poços em que foi adicionada uma enzima. Calcular o valor médio e o erro padrão das médias (SEM) das cavidades replicadas 8. </li></ol></li></ol> 2. Cromogênico Ensaio com ICB Substratos em um formato de 96 poços <ol><li> reacção enzimática <ol><li> Adicionar a 100 mM de tampão de acetato de sódio 150 ul, pH 4,5 e 5 ul de 31 U / ml de endo -xylanase solução para cada poço da placa de kit de ensaio contendo palha de trigo ICB-vermelho (concentração final de enzima no poço: 1 U / ml) . NOTA: As placas de kit de ensaio (filtro de 96 poços plates contendo substratos ICB) são fabricados conforme descrito na literatura (veja Lista de Materiais). Os substratos de ICB são estáveis ​​em soluções tampão com uma gama de pH entre pH 3,0 a 10,0. Sempre incluem tampão por si só como controlo negativo, as enzimas comerciais como um controlo positivo e usar um número estatisticamente apropriado de réplicas. <ol><li> Não activar os substratos ICB como a placa de substrato CPH, mas remover o estabilizador por lavagem três vezes com 100 ul de água seguido por filtração a vácuo ou centrifugação. </li></ol></li><li> Coloque a placa produto por baixo da placa de substrato para recolher qualquer vazamento potencial da placa de substrato durante a agitação. </li><li> Incubar a reacção a 25 ° C com agitação a 150 rpm durante 2 h. NOTA: Uma enzima ativa é degradar os polissacarídeos cromogénicos insolúveis no substrato ICB em oligossacarídeos solúveis, que são visíveis na forma de sobrenadante colorido. ICB substratos são estáveis ​​até 90 ° C. A incubação time deve ser aumentada até 24 horas, se enzimas não purificadas tais como caldos de cultura são utilizados. </li><li> Colocar a placa de produto no interior do colector de vácuo com o bloco espaçador no interior. </li><li> Colocar a placa de kit de ensaio no topo e aplicar vácuo (pressão negativa máxima de -60 kPa), ou utilizar uma centrífuga para filtrar o produto a partir do kit de ensaio de placa para o poço da placa de produto. NOTA: O filtrado contendo os oligossacarídeos coloridas como produto de reacção está agora no prato de coleta para análise posterior 8. </li></ol></li><li> Detecção e quantificação <ol><li> Verificar que o volume de líquido em cada poço da placa de recolha é aproximadamente o mesmo através de inspecção visual. </li><li> Ler a absorbância da placa de coleta em 517 nm para a palha de trigo ICB-vermelho usando um leitor de placas. </li><li> Ao fazer a análise de dados - subtrair o tampão - apenas valores de controlo negativo a partir dos valores dos poços, onde uma enzimafoi adicionado. Calcular o valor médio e o erro padrão das médias (SEM) das cavidades replicadas 8. NOTA: Em caso de triagem de enzimas desconhecidos, sugerimos fazer uma série de diluição de modo a obter dados mais detalhados sobre a faixa dinâmica da actividade da enzima. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carbohydrate-active+enzymes+database+%28CAZy%29+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).</li>
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<li>Mackenzie, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polysaccharide+utilization+locus+from+an+uncultured+bacteroidetes+phylotype+suggests+ecological+adaptation+and+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).</li>
</ol>

Há dois pedidos de patente depositados envolvendo o ensaio de substrato placa CPH de 96 poços e o ensaio de 96 poços substrato ICB (WO2015036000 e Dinamarca PA 2015 70311).

Estamos a utilizar uma nova geração de substratos CPH e ICB multi-coloridas, que são baseados em corantes clorotriazina (lista completa dos substratos na Tabela 1), dispostos num estojo de ensaio comercial projetados. Digestão com enzimas dos substratos produz pequenos, solúveis, produtos tingidos que são detectáveis ​​na solução de ensaio e pode ser quantificada utilizando um leitor de placas de 9. Este ensaio é concebido para a avaliação de enzimas endo e actuando a sensibilidade do ensaio é semelhante a um utilizando azurina com ligações cruzadas (AZCL) substratos 10, enquanto que outros métodos estão disponíveis para a exo actuando enzimas 11,12. A limitação deste kit de ensaio encontra-se na detecção da actividade de endo -enzyme, como CPH, bem como os substratos de ICB não degradáveis ​​por exo -enzimas provavelmente devido a impedimento estérico resultantes do corante e agente reticulante moléculas 8. O ensaio é realizado em um 96-WELl formato e as reações individuais ocorrem nos poços. A reacção tem que ser misturado na placa para receber dados reprodutíveis. Os sobrenadantes resultantes são filtrados para uma placa de produto em que a absorvência de cada cavidade pode ser quantificada usando espectrometria de absorvância. Os princípios básicos e o layout do ensaio são mostrados na Figura 1. O ensaio consiste de uma placa de ensaio (uma placa de filtro de 96 poços) com os substratos e, após incubação com enzimas, o sobrenadante é filtrado através de numa placa de clara e as absorvâncias são lidas proporcionando uma medição semi-quantitativa da especificidade e actividade de enzimas. Demonstrou-se, que este ensaio de rastreio utilizando substratos CPH pode também ser utilizado num formato de placa de agar, onde os produtos de reacção solúveis em criar um halo de cor após incubação durante a noite. 8 Os estojos de ensaio podem ser utilizados para rastrear enzimas purificadas e as suas potenciais actividades-secundários como demonstrado emFigura 2. Colaterais actividades podem surgir a partir de uma única enzima e a sua especificidade promíscuo, mas também a partir de um fato de que a amostra analisada é uma mistura de diferentes enzimas e o seu efeito sinérgico necessita de ser estudado. Além disso, como foi demonstrado em estudos anteriores, que os cocktails de enzimas, da flora intestinal e 13 de cultura a partir de caldos de fungos 8, assim como enzima de planta endógeno e bactérias (dados não publicados) pode ser usado como uma fonte de enzima. substratos ICB resolver misturas complexas de componentes da parede celular, muitas vezes encontradas em processos industriais de repartição de biomassa. Estes substratos são projetados para avaliar a disponibilidade de polissacarídeo e fornecer informações sobre como otimizar efetivamente cocktails de degradação para a saída de degradação mais eficiente. Tal como ilustrado na Figura 3 e substratos CPH ICB pode ser utilizado em rastreio enzima lado a lado - revelando uma variedade de informações sobre uma especificidade enzimaactividade d, tanto no contexto do substrato preferido (CPH) e um complexo mais natural contendo outros componentes em adição ao substrato preferido que imita mais de perto uma montagem macromolecular encontrada na natureza (ICB). O uso de várias cores permite a detecção simultânea de diferentes actividades enzimáticas contra vários substratos, o que aumenta o rendimento e alta-multiplexidade do ensaio. Espectros de diferentes corantes podem ser resolvidos por meio de regressão linear simples e, na maioria dos casos, a actividade de multi-substrato podem ser observadas por inspecção visual sozinho. Um exemplo de uma experiência simulada tais e os seus resultados são representados na Figura 4. Esta caixa de ferramentas de ensaio e a versatilidade da sua aplicação são muito bem adaptado para o rastreio de primeiro nível de enzimas e caldos de cultura com atividades desconhecidas. Os aspectos mais importantes deste ensaio é a sua natureza de elevado rendimento, personalização, facilidade de uso e flexibilidade. Com isso em mente, we acreditam que este novo conjunto de ferramentas irá melhorar e acelerar os processos enzimáticos triagem em industrial, bem como aplicações acadêmicas.

Técnicas de mineração de genomas e metagenomas se desenvolveram rapidamente nos últimos anos, assim como estratégias de médio e alto rendimento para clonagem e expressão de enzimas recombinantes. Além disso, os recursos de bioinformática e depósitos associados, como o (CAZy)1,2, expandiram-se muito. No entanto, existem desafios consideráveis inerentes à exploração da diversidade enzimática microbiana para fins industriais e a determinação empírica das atividades enzimáticas tornou-se um sério gargalo. Por exemplo, estima-se que, usando os métodos atuais, podemos prever com segurança as atividades de não mais do que 4% das proteínas dentro do banco de dados CAZy. Embora existam vários métodos disponíveis para monitorar as atividades enzimáticas, todos eles têm algumas limitações. Técnicas bem estabelecidas baseadas em cromatografia combinada com espectrometria de massas estão disponíveis para avaliar as atividades dos fragmentos oligoméricos da glicosil hidrolase (GH)3,4. No entanto, essas abordagens são trabalhosas e geralmente de baixo rendimento. Métodos baseados na medição de açúcares redutores, como os ensaios de ácido dinitrosalicílico5 e Nelson-Somogyi6, são amplamente utilizados para avaliar as atividades do GH. No entanto, esses ensaios têm rendimento limitado e podem ser propensos a reações colaterais. Substratos polissacarídeos cromogênicos individuais, como a reticulação da azurina (AZCL), são amplamente utilizados para determinação das atividades enzimáticas, mas a compra de todos os substratos separadamente e a distribuição manual dos pós do substrato dentro da placa de ensaio pode ser complicado e caro7.
Desenvolvemos uma nova geração de substratos de hidrogel de polímero cromogênico (CPH) baseados em corantes de clorotriazina que, quando usados em conjunto com uma placa de filtro de 96 poços, formam um sistema de ensaio de alto rendimento. Foram desenvolvidos substratos adicionais de Biomassa Cromogênica Insolúvel (ICB) que fornecem informações sobre a disponibilidade de substrato em misturas poliméricas complexas, como as existentes na biomassa lignocelulósica. Cada substrato pode ser produzido em uma das quatro cores, e substratos de cores diferentes podem ser combinados em um único poço. Neste protocolo é mostrado que esta metodologia pode ser aplicada a uma ampla variedade de polissacarídeos e proteínas e o potencial para triagem de GHs, polissacarídeos líticos monooxigenases (LPMOs) e proteases. Protocolos específicos são fornecidos para o uso de placas de 96 poços e resultados representativos ilustram a alta eficiência dos kits de substrato CPH e ICB como ferramentas para triagem enzimática.
Uma vantagem significativa dos kits de ensaio descritos, independentemente do substrato, é que os kits estão prontos para uso em 15 minutos, após a etapa de ativação. Isso elimina a necessidade de montagem demorada do ensaio a partir de materiais de substrato brutos, como é o caso de alguns outros métodos7. Os substratos CPH e ICB têm excelente armazenamento (pelo menos um ano à temperatura ambiente), pH e estabilidade de temperatura 8 e não requerem equipamento especializado ou treinamento. Os ensaios CPH ou ICB são baseados em uma placa filtrante de 96 poços dentro da qual a reação com a enzima é conduzida. Se a enzima estiver ativa com um determinado substrato, oligômeros corados solúveis são gerados, produzindo um sobrenadante colorido que pode então ser filtrado em uma placa regular de 96 poços transparentes usando um coletor de vácuo ou uma centrífuga 8. 
Os substratos são tingidos com corantes de clorotriazina que absorvem na faixa do espectro visível (VIS) e cores individuais (vermelho, azul, amarelo e verde) podem ser resolvidas usando regressão linear se diferentes substratos CPH de cores diferentes forem misturados em um único poço, e a enzima atua em mais de um substrato. A placa resultante com os sobrenadantes pode ser medida usando um leitor de placa de microtitulação padrão capaz de medir a absorbância na faixa VIS. A mistura de diferentes substratos com cores diferentes em um poço aumenta o rendimento do sistema de ensaio, para um total de 384 experimentos em uma placa de 96 poços (4 substratos diferentes de cores diferentes por poço).
CPH fornecem uma ferramenta valiosa para avaliar a atividade específica de uma enzima, enquanto os substratos ICB são usados para avaliar a capacidade de uma enzima de digerir um componente no contexto de misturas complexas de substratos que as enzimas geralmente encontram na biomassa. Embora os substratos ICB não forneçam informações sobre as especificidades enzimáticas individuais, eles são, no entanto, ferramentas úteis para avaliar o desempenho comercial de enzimas, coquetéis ou caldos.

<table><tbody><tr><td>placas de kit de ensaio</td><td>Glycospot</td><td></td> solução de ativação de <td>placas de kit de ensaio personalizado</td></tr><tr><td></td><td>Glycospot</td><td></td><td>para ativação de substratos CPH</td></tr><tr><td>Bloco espaçador de placa receptora de 350 ml para coletor de vácuo</td><td>Bloco espaçador</td><td>Pall Corporation</td><td>5015</td></tr><tr><td>Placa filtrante HV MultiScreen de 96 poços, 0,45 &micro; m, transparente, não estéril</td><td>Placa de ensaio</td><td>de MSHVN4510</td><td>Millipore</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 poços, polipropileno</td> Placa de recolha <td>de 651201</td><td>Greiner Bio-One</td><td>após a lavagem dos</td></tr><tr><td>substratos Microplacas Nunc MicroWell de 96 poços Placa de</td><td>produto</td><td>Thermo Scientific</td><td>269620</td></tr><tr><td>Bomba de diafragma MZ 2 NT</td><td>Vacuubrand</td><td>732000</td><td>bomba de vácuo utilizada com o coletor</td></tr> <tr>de vácuo<td>Infors HT Ecotron</td><td>Infors HT</td><td>4950132 (Buch & Agitador</td> <td>horizontal</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td>10067-750 (VWR)</td><td>Leitor de absorbância de placas de 96 poços</td></tr><tr><td>Coletor de vácuo</td><td>Pall Corporation</td><td>5017</td><td>coletor de vácuo</td></tr><tr><td>endo-celulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)</td><td>Megazyme</td><td>E-CELTR</td><td>celulase [cel]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-mananase (Cellvibrio japonicus)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-BMACJ</td><td>mananase [man]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-LAMSE</td><td>&beta;-glucanase [glu]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-EGALN</td><td>galactanase [gal]</td></tr><tr><td>endo-&beta;-1,4-xilanase M4 (Aspergillus niger)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-XYAN4</td><td>xilanase [xyl]</td></tr><tr><td>endo-xiloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)&nbsp;</td><td>Megazyme</td><td>E-XEGP</td><td>xiloglucanase [xg]</td></tr><tr><td>&alfa;-amilase (Bacillus licheniformis)&nbsp;</td><td>Amilase Megazyme</td><td>E-BLAAM</td><td>[amy]</td></tr></tbody></table>

high-throughput screening de enzimas carboidratos-degradantes usando novel insolúvel substrato cromogénico kits de ensaio

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

COs carboidratos activeenzimas (CAZymes) têm múltiplos papéis in vivo e são amplamente utilizados para processamento industrial nas indústrias de biocombustíveis, têxteis, detergentes, papel e alimentos. Uma compreensão mais profunda do CAZymes é importante tanto do ponto de vista da biologia fundamental quanto da indústria. Um grande número de CAZymes existe na natureza (especialmente em microrganismos) e centenas de milhares foram catalogados e descritos no banco de dados de carboidratos (CAZy). No entanto, a taxa de descoberta de enzimas putativas superou nossa capacidade de caracterizar bioquimicamente suas atividades. Uma razão para isso é que os avanços no sequenciamento do genoma e do transcriptoma, juntamente com as ferramentas de bioinformática associadas, permitem a identificação rápida de CAZymes candidatos, mas a tecnologia para determinar as características bioquímicas de uma enzima avançou mais lentamente. Para resolver essa lacuna tecnológica, um novo kit de ensaio de alto rendimento baseado em substratos cromogênicos insolúveis é descrito aqui. Dois tipos distintos de substratos foram produzidos: substratos Cromogênicos de Polymer Hydrogel (CPH) (feitos de polissacarídeos e proteínas purificados) e substratos deI nosolúvel Chromogenic Biomass (ICB) (feitos de materiais complexos de biomassa). Os substratos CPH e ICB são fornecidos em um sistema de ensaio de alto rendimento de 96 poços. Os substratos CPH podem ser feitos em quatro cores diferentes, permitindo que sejam misturados e, assim, aumentando o rendimento do ensaio. O protocolo descreve um ensaio de placa de 96 poços e ilustra como esse ensaio pode ser usado para rastrear as atividades de enzimas, coquetéis enzimáticos e caldos.

O alto rendimento e capacidade de multiplexagem deste ensaio é baseado no polímero insolúvel cromogénico (ou proteína) de hidrogel (CPH) substratos dispostos em placas de filtro de 96 poços. Enzimas, bem como controlos negativos são adicionados à placa de kit de ensaio (Figura 1A) e as enzimas degradam o substrato correspondente produzir um sobrenadante de cor (Figura 1B). Depois da reacção estar concluída, o sobrenadante é transferido para uma placa de produto clara cavidades e a absorvância pode ser medido directamente utilizando um espectrofotómetro adequado para placas de 96 poços (Figura 1C). Um exemplo de uma resposta de dose de CPH-arabinoxilano de xilanase em diferentes concentrações de enzima (0,00-0,75 U / ml) é mostrado na Figura 1D, onde a concentração de enzima diminuição pode ser observada visualmente. A quant espectrofotometria mais detalhadaificação pode ser usada para representar graficamente a absorvância em função da concentração de enzima (Figura 1E). A intensidade de sinal corresponde à actividade da enzima. A reprodutibilidade do ensaio é mostrado pelas barras de erro (erro padrão da média, SEM, de três réplicas). Experimentos mais detalhados sobre a reprodutibilidade deste ensaio são publicados em outros lugares 8. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig1.jpg" /> Figura 1. tratamento com xilanase de CPH-arabinoxilano. A) Um esquema da placa de ensaio com o kit de substrato de CPH (por exemplo, CPH-arabinoxilano) carregado em poços da placa de filtro de 96 cavidades pouco antes da adição de enzimas 1 e 2 e o tampão controle -apenas (enzima 1 tiveram atividade -xylanase endo); B) Degradação de CPH-arabinoxilano pela enzima 1 produziu um sobrenadante colorida; C) Após filtrat vácuo-assistidaião dos sobrenadantes em placa para o produto, a absorvância é medida espectrofotometricamente; D) placa produto contendo os produtos da reacção após o tratamento de CPH-arabinoxilano em 4 cores diferentes, com diferentes concentrações de endo-1,4--β xilanase em 100 mM tampão acetato de sódio, pH 4,5 durante 60 minutos à temperatura ambiente;. E) a quantificação dos produtos da reacção de D usando espectrofotometria <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig1large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Existem diferentes opções para usar este ensaio na triagem enzima. Uma opção é usar uma placa de 96 cavidades contendo diferentes polissacáridos para o rastreio, por exemplo, um pequeno número de (purificada) endo -enzimas com actividade desconhecida. Neste caso, o resultado será que mostram polissacarídeos são DEGRADcapaz pela enzima alvo. Para demonstrar este princípio, um -cellulase endo foi testado contra diferentes substratos CPH a 25 ° C. Três concentrações diferentes de enzima (0,5 U / ml, 1,0 U / ml e 5 U / ml) foram incubadas durante 30 min. O resultado é claramente visível na placa produto (Figura 2A). A folha de produto para esta endo -cellulase fornecidas pelo fornecedor especifica lado de actividade xiloglucano (tamarindo), cevada β-glucana, glucomannan, xilano de bétula e baixa lado de actividade galactomanano. Coerente com isso, a atividade adicional para celulase foi encontrado contra-CPH-β glucana (cevada), CPH-xiloglucano (tamarindo), CPH-xilano (madeira de faia) e baixa atividade contra CPH-galactomanano (Figura 2B). Glucomannan não foi testado. Os mesmos substratos CPH foram digeridos com enzimas comerciais disponíveis (três diferentes concentrações de enzima: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml e 1,0 U / ml) foram utilizados como controlos positivos nas mesmas condições do que o anteriorexperimentar. Todos os substratos foram degradadas pela enzima de controlo positivo e o aumento da intensidade de sinal correspondente a uma maior concentração de enzima (Figura 2C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig2.jpg" /> Figura 2. Oito diferentes substratos CPH foram incubadas sob agitação a 25 ° C durante 30 min. A) A placa produto de diferentes substratos CPH digeridos com uma endo -cellulase, em diferentes concentrações. B) Quantificação da actividade actividade e vários lado de endo -cellulase. As barras de erro representam o erro padrão da média de três réplicas C) Actividade de diferentes enzimas comerciais para o substrato correspondente CPH (endo-celulase e 2-HE-celulose;. E-LAMSE e CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucana (cevada); e-XYAN4 e CPH-xilano, e-XEGP e CPH-xiloglucano, E-BLAAM e CPH-amilose, E-BMACJ e CPH-galactomanano; todas as enzimas de Megazyme). As barras de erro representam o erro padrão da média de duas réplicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Os substratos insolúveis biomassa cromogénico (ICB) são uma adição útil ao repertório substrato cromogénico, porque eles mantêm, em parte, a disposição natural de polissacarídeos nas paredes celulares das plantas que são o principal constituinte da biomassa. Substratos CPH e CPI são usados ​​no nosso exemplo, para analisar as enzimas segregadas de Phanerochaete chrysosporium, quando cultivada em meio líquido. A configuração da placa da placa de kit de ensaio é mostrado na Figura 3A, com 19 CPH substratos e 5 substratos ICB (4 poços para cada substrato, Figura 3B). P. chrysosporium foi cultivated durante três dias e, em seguida, o sobrenadante de cultura analisado. Portanto, 125 ul de tampão 200 mM foi transferido para cada poço de cultura sobrenadante e 25 ul adicionados. Três condições de pH diferentes foram testados utilizando tampão de acetato de sódio pH 4,0, tampão de fosfato de sódio a pH 6,0 ou pH 8,0 (Figura 3C). A placa foi incubada com agitação (150 rpm) a 25 ° C durante 2 h. Os produtos da reacção foram transferidos para a placa do produto (Figura 3D) e analisadas. P. chrysosporium enzimas para a degradação de vários glucanos e xilanos, amido (Figura 3E) produzido. sinais de baixa poderia ser detectada para o arabinano hemiceluloses (beterraba sacarina) e galactano péctico, bem como para a GPI (soja). As enzimas produzidas eram mais activos em condições ácidas (pH 4,0) do que em condições neutras ou ligeiramente básicas (pH 8,0). Menor atividade no sentido de substratos ICB (Figura 3F)demonstra que quando os polissacarídeos são, num contexto mais natural, a eficiência da enzima não é o mesmo que com um polissacarídeo puro e por isso substratos ICB demonstrar uma visão mais realista sobre a eficiência da enzima, se for aplicada ao cru ou pré material vegetal tratado. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig3.jpg" /> Figura 3. Triagem de um sobrenadante de cultura de uma cultura líquida de idade de 3 dias de Phanerochaete chrysosporium utilizando uma placa de multi substrato contendo 19 CPH e 5 substratos ICB. A) um esquema da configuração da placa com 4 poços para cada substrato indivíduo (fundo cinza = substratos CPH, fundo laranja = substratos ICB). B) Imagem da placa de ensaio contendo o substrato. C) Esquema mostrando as condições de tampão utilizadas nesse experimento (200 mM de acetato de sódio pH 4,0, fosfato de sódio pH 6,0 e fosfato de sódio pH 8,0). D) imagem da placa de produto após 2 h a 25 ° C. E) As absorvências foram detectados a 517 nm e representada para cada substrato CPH indivíduo e F ) resulta de substrato ICB para as respectivas enzimas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig3large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Os substratos cromogénicos pode também ser usado para estudar os efeitos sinérgicos, utilizando uma mistura de diferentes substratos coloridos CPH num poço e analisando-se o sobrenadante da reacção após o tratamento utilizando enzimas individuais ou enzima cocktails. No exemplo a seguir mostrada na Figura 4, vermelho CPH-celulose e substratos amarelo CPH-xilano foram misturados em conjunto a uma aproximadamente equrazão Al em poços de placas de filtro de 96 poços. A Figura 4A mostra os produtos de reacção de cor depois do tratamento de 1 hora à temperatura ambiente com nenhuma enzima (controlo), CEL celulose (2 U / ml), xil xilanase (1 U / ml) e um mistura de ambas as enzimas (3 repetições de cada abordagem) em 100 mM de acetato de sódio tampão pH 4,5. Para análise, o produto da reacção foi quantificada espectrofotometricamente por digitalizar o espectro de absorvância de 350 nm a 700 nm (Figura 4B). Muitas vezes, uma inspecção visual por si só pode dar uma indicação de que a enzima actue por um ou vários substratos, no entanto registada a absorvância espectros que resultam de diferentes corantes também podem ser resolvidos por meio de regressão linear simples 8 para dar uma indicação mais precisa do grau de degradação de cada substrato a partir da mistura. Usando substratos de CPH como misturas substancialmente contribui para um rendimento do ensaio, permitindo SCReening contra até 4 substratos diferentes em uma experiência (um poço). No exemplo mostrado quatro diferentes substratos utilizados: CPH-β glucana azul (cevada), CPH-xilano amarelo (madeira de faia), CPH-amilose verde e galactan CPH-pectic vermelho (tremoço). A disposição da placa de substrato é mostrado na Figura 4C e uma imagem da placa de ensaio na Figura 4D. A reacção foi realizada em 100 mM de acetato de sódio tampão pH 4,5 durante 30 min a 25 ° C e 150 rpm. Primeira enzimas individuais com o aumento da concentração de enzima foram testados com o substrato correspondente CPH (Figura 4E) e o sobrenadante corado foi recebido como esperado na placa produto (Figura 4F, linha 1A - 12D). Fileira E continha os dois substratos diferentes CPH amarelo CPH-xilano e azul-CPH-β glucano, os quais foram degradados com diferentes proporções de enzimas correspondentes endo endo e -xylanase -glucanase. Após a reacção, o resultado é visible na placa produto: a cor do produto de reacção era mais escura verde-azul, quando mais endo -glucanase estava presente (Figura 4F, 4E-6E) e se transformou em um isqueiro verde-amarelo, quando o endo -xylanase concentração aumentada ( A Figura 4F, 10-12E). O mesmo é visto na linha F, em que os dois substratos galactano CPH-péctico vermelho e amarelo CPH-xilano foram degradados com endo endo e -galactanase -xylanase. Todos os quatro CPH substrato colorido diferente estavam presentes (Figura 4F, 1G-12F) e enzimas individuais degradou o substrato CPH apropriado e por adição de enzimas adicionais uma combinação dos produtos de reacção de cor foi recebido. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54286/54286fig4.jpg" /> Figura 4. Uma combinação de dois substratos de CPH diferentes, vermelho CPH-celulose e amarelo CPH-xilano, tratados com diferentes enzimas. UMA) Sobrenadantes de reacção após o tratamento de substratos com dois endo -cellulase (cel) ou endo -xylanase (Xil) ou ambas as enzimas. B) os espectros de absorvância dos sobrenadantes de reacção. Uma combinação de quatro substratos CPH diferentes tratados com diferentes enzimas C) Esquema da placa de substrato contendo os substratos CPH:. Azul CPH-β-glucano (cevada), CPH-xilano amarelo (madeira de faia), verde CPH-amilose e CPH- vermelho galactano péctico (tremoço) D) Imagem da placa de ensaio contendo as diferentes substratos CPH E) Esquema da placa de produto que mostra a relação entre as enzimas adicionadas (as concentrações nominais (NC):.. glu = 1 U / ml de endo -glucanase, Xil = 1 U / ml de endo -xylanase, Amy = 5 U / ml de endo-amilase e Gl = 0,5 U / ml de endo -galactanase). F) Imagem da placa de produto após 30 minutos de incubação a 25 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54286/54286fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substrato </td><td> Fonte </td></tr><tr><td> CPH-2-hidroxietilcelulose </td><td rowspan="2"> N / D </td></tr><tr><td> (CPH-2-HE-celulose) </td></tr><tr><td> CPH-amilopectina </td><td> Batata </td></tr><tr><td> CPH-amilose </td><td> Batata </td></tr><tr><td> CPH-arabinana </td><td> beterraba sacarina </td></tr><tr><td> CPH-arabinoxilano </td><td> trigo </td></tr><tr><td> CPH-caseína </td><td> leite bovino </td></tr><tr><td> CPH-quitosana </td><td> origem animal </td></tr><tr><td> CPH-curdlan </td><td> Alcaligenes faecalis </td></tr><tr><td> CPH-dextrano </td><td> Leuconostoc spp. </em&gt; </td></tr><tr><td> CPH-galactomanano </td><td> alfarroba </td></tr><tr><td> CPH-laminarina </td><td> Laminaria digitata </td></tr><tr><td> CPH-liquenana </td><td> musgo islandês </td></tr><tr><td> CPH-metilcelulose </td><td> N / D </td></tr><tr><td> CPH-pachyman </td><td> Poria cocos </td></tr><tr><td> galactan CPH-pectic </td><td> Batata </td></tr><tr><td> CPH-pululano </td><td> Aureobasidium pullulans </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalacturonano I (RG I) </td><td> Batata </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalacturonano I (Gal) * </td><td> Batata </td></tr><tr><td> CPH-ramnogalacturonano </td><td> feijão de soja </td></tr><tr><td> CPH-xilano </td><td> Madeira de faia </td></tr><tr><td> CPH-xiloglucano </td><td> Tamarindo </td></tr><tr><td> CPH-β-glucano de cevada </td><td> cevada </td></tr><tr><td> CPH-β-glucano de aveia </td><td> aveia </td&gt; </tr><tr><td> CPH-β-glucano de levedura </td><td> fermento </td></tr><tr><td> ICB-Arabidopsis </td><td> Rosette folhas de Arabidopsis thaliana Col-0 (planta adulta) </td></tr><tr><td> sementes ICB-Arabidopsis </td><td> Arabidopsis thaliana </td></tr><tr><td> ICB-bagaço </td><td> Saccharum officinarum (planta adulta secos, caule e folhas) </td></tr><tr><td> celulose ICB-cristalino (papel de filtro) </td><td> papel Whatman 3MM Chr Cromatografia comercial </td></tr><tr><td> sementes de feno-grego ICB- </td><td> Trigonella spp. Sementes </td></tr><tr><td> ICB-cânhamo </td><td> Cannabis spp. (Planta adulta secos, caule e folhas) </td></tr><tr><td> sementes ICB-tremoço </td><td> Lupinus angustifolius sementes </td></tr><tr><td> ICB-pólen P. pratense </td><td> Pólen Phleum pratense </td></tr><tr><td> ICB-abeto </td><td> Picea spp. (Mitronco de árvore lled) </td></tr><tr><td> ICB-tabaco </td><td> folhas da Nicotiana benthamiana (planta jovem) </td></tr><tr><td> palha ICB-de trigo </td><td> Triticum spp. (Planta adulta secos, caule e folhas) </td></tr><tr><td> ICB-salgueiro </td><td> Salix spp. (Planta adulta secas, tronco de árvore branqueado) </td></tr><tr><td> ICB-Sorghum </td><td> Sorghum spp. (Sai da planta adulta) </td></tr><tr><td colspan="2"> (cadeias laterais β-1,4-D-galactano removidos com endo -β-1,4-D-galactanase) * </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Lista de disponíveis Cromogênico polímero de hidrogel (CPH) e substratos Insolúvel Cromogênico Biomassa (ICB).

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

O objetivo geral deste ensaio cromogênico é triar diversas enzimas em formato de alto rendimento contra uma seleção de diferentes substratos cromogênicos. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de descoberta de enzimas, como a identificação de novas atividades enzimáticas para a degradação de biomassa. A principal vantagem desta técnica é que os substratos cromogênicos estão disponíveis em quatro cores diferentes, tornando-a de alto rendimento, extremamente confiável e economicamente eficiente.Para começar, ative a placa do kit de ensaio com filtro de 96 poços adicionando 200 microlitros de solução de ativação em cada poço. Incube em temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos. Utilize uma centrífuga e qualquer placa padrão de 96 poços para coleta.Para centrifugar a solução de ativação existente, adicione 100 microlitros de água estéril aos substratos de hidrogel polimérico cromogênico ou CPH e aplique vácuo ou centrifugação para remover o estabilizante. Repita a lavagem mais duas vezes. Para preparar a reação enzimática, adicione 150 microlitros de tampão de acetato de sódio 100 mM, pH 4,5 e 5 microlitros de solução de endo-celulase com três concentrações diferentes a cada poço da placa do kit de ensaio.Coloque a placa do produto sob a placa do kit de ensaio para coletar qualquer vazamento potencial da placa de reação durante a agitação. Em seguida, incube a placa do kit de ensaio à temperatura ambiente em um agitador horizontal a 100 rpm por 30 minutos. Para obter dados confiáveis, é necessário agitar a mistura de reação durante a incubação.Coloque a placa do kit de ensaio com a placa de produto abaixo dela na centrífuga e centrifugue a 2.700 x g durante 10 min para transferir o produto da reação para os poços da placa de produto. Após a centrifugação, inspecione visualmente a placa de produto para verificar se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo.Usando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta em 630 nm para os diferentes substratos verdes de CPH. Analise e represente graficamente os dados de acordo com o protocolo descrito no texto. Para realizar o ensaio cromogênico com biomassa cromogênica vermelha insolúvel ou palha de trigo ICB, comece adicionando 200 microlitros de solução de ativação em cada poço da placa de ensaio.Em seguida, incubar a placa à temperatura ambiente sem agitação por 10 minutos. Remover o estabilizador lavando os poços três vezes com 100 microlitros de água estéril. Em seguida, adicionar 150 microlitros de tampão de acetato de sódio 100 mM pH 4,5 e 5 microlitros de 10 unidades por mililitro de diferentes soluções de endo-xilanase.Posicione a placa de produto sob a placa de substrato para coletar qualquer vazamento potencial da placa de substrato durante a agitação. Incube a reação à temperatura ambiente a 100 rpm por duas horas. Após a incubação, coloque a placa do kit de ensaio com a placa de produto sob ela no centrífuga e centrifugue a 2.700 x g por 10 min para transferir o produto da reação para os poços da placa de produto.Verifique se o volume de líquido em cada poço é aproximadamente o mesmo. Em seguida, utilizando um leitor de placas, leia a absorbância da placa de coleta em 517 nm para o ICB de palha de trigo vermelho. Realize a análise dos dados de acordo com o protocolo descrito no texto.É mostrado aqui um exemplo da resposta à dose de arabinoxilana CPH frente à xilanase em diferentes concentrações da enzima, em que a diminuição da concentração enzimática pode ser observada visualmente. Uma quantificação espectrofotométrica mais detalhada é utilizada para traçar a absorbância em função da concentração da enzima. A intensidade do sinal corresponde à atividade enzimática.Neste exemplo do ensaio utilizado para triagem enzimática, uma endo-celulase foi testada em três concentrações contra diferentes substratos CPH. Como visto aqui, atividade adicional à celulase foi exibida para CPH-glucano, CPH-xilano, CPH-xiloglucano, e baixa atividade foi observada contra CPH-galactomanano. Os mesmos substratos CPH foram digeridos com enzimas comercialmente disponíveis utilizadas como controles positivos nas mesmas condições.Os resultados aqui apresentados mostram que todos os substratos foram degradados em níveis que aumentaram com o aumento das concentrações de enzima. Neste experimento, cinco substratos de ICB foram incluídos juntamente com 19 substratos de CPH para analisar as enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium sob três condições diferentes de pH. As enzimas de P. chrysosporium degradaram diversos glucanos, amidos e xilanos.Sinais mais baixos puderam ser detectados para as hemiceluloses arabinana e galactana péctica, bem como para RGI. As enzimas produzidas foram mais ativas em condições ácidas do que em condições neutras ou levemente básicas. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de uma hora, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de misturar a reação durante a incubação. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de triagem de alto rendimento explorarem novas atividades enzimáticas para biotecnologia. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar o kit de triagem.

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