Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

O objetivo geral deste método FINA, que significa isolamento por filtração de ácidos nucleicos, é isolar o DNA genômico para amplificação por PCR a partir de espécimes complexos de forma rápida e simples, sem o uso de instrumentação laboratorial, como uma centrífuga. Este método rápido de extração de DNA em papel para o DNA proviral do HIV foi desenvolvido para ser incorporado em um dispositivo diagnóstico de PCR quantitativa. A principal vantagem desta técnica é que os módulos de preparação da amostra e os tubos de PCR podem ser preparados com antecedência, de modo que a extração do DNA leve menos de dois minutos.

Desenvolvemos inicialmente este método para ser incorporado em uma amostra com o objetivo de realizar um teste diagnóstico precoce de HIV-1 em recém-nascidos a partir de sangue coletado por furo no calcanhar. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades, pois a remoção da proteção da fita dupla face que prende a membrana de captura celular à lateral do tubo de PCR exige prática. O procedimento será demonstrado por Jen Reed, técnica sênior do meu laboratório.

Inicie este procedimento preparando os materiais necessários para montar o módulo de preparação de amostras FINA. Prepare a almofada de absorção cortando um quadrado de 35 por 35 milímetros de uma almofada de algodão 100% com 2,6 milímetros de espessura. Prepare uma película plástica de parafina com fita adesiva de suporte de papel.

Corte um pedaço de filme de parafina de 25 por 50 mm e, em seguida, use um martelo para furar um orifício de 7,14 mm de diâmetro no centro da fita. Prepare uma membrana de separação de sangue de vidro ligado ou disco de captura fazendo um círculo de 8,35 mm de diâmetro com um martelo. Para montar o módulo de preparação de amostra FINA, use pinça para colocar o disco de captura no centro do suporte de absorção.

Remova o suporte da fita de filme de parafina e coloque-a sobre o disco de captura de forma que toda a fita de parafina deixe exposta a parte central do disco de captura. Garanta o máximo contato entre o disco e o suporte de transferência esticando levemente a fita de parafina para cobrir o suporte de transferência e pressionando firmemente a fita de parafina para fixá-la ao suporte de transferência em todas as bordas do disco. Um disco de fita de 5,1 mm é necessário para fixar a membrana de captura à lateral do tubo de qPCR, evitando que a membrana bloqueie a detecção de fluorescência do instrumento de PCR em tempo real.

Prepare este disco de fita utilizando um martelo para furar um círculo de fita diagnóstica de poliéster dupla face a partir de uma folha da fita. Com o auxílio de pinça, remova um dos lados do forro adesivo da fita. Coloque a fita em um tubo PCR de 200 microlitros, aderindo-a a uma das laterais e próximo ao fundo do tubo.

Remova o segundo forro adesivo. O tubo agora está pronto para receber o disco preparado. Neste vídeo, será demonstrada a detecção de DNA proviral de sangue total adicionado com células LAV 8e5.

Retire os pellets celulares de LAV 8e5 previamente congelados e descongele-os em gelo. Prepare uma diluição seriada das células em meio de congelamento com concentrações variando de 1 a 400 células por microlitro. Pipete 10 microlitros de células de cada uma das diluições em um tubo microcêntrifuga.

Adicione 100 microlitros de amostra fresca de sangue total tratado com eDTA e negativo para HIV-1 a cada tubo para criar uma curva padrão. Misture batendo suavemente na parte inferior do tubo cinco vezes. Para iniciar o procedimento de extração de DNA, lise as células sanguíneas adicionando triton X-100 até uma concentração final de um por cento.

Agite suavemente batendo na parte inferior do tubo cinco vezes. O sangue deve ficar vermelho translúcido. Pipete todo o espécime sanguíneo sobre o disco de captura.

Um selo hermético entre a fita de parafina e a membrana de captura garante que o sangue passe através da membrana. E um bom contato entre a membrana de contato e o conjunto do suporte absorvente assegura a rápida capilaridade da amostra. Deixe a amostra penetrar completamente no filtro.

O lisado sanguíneo foi absorvido pelo disco de captura e o disco apresenta-se fosco. Adicione de 600 a 1.000 microlitros de hidróxido de sódio 10 mmol gota a gota sobre o disco de captura. O filtro mudará de vermelho para branco, indicando a remoção da hemoglobina.

Em seguida, separe o disco da almofada de blotting e aplique o disco à fita no tubo de PCR preparado. Após o filtro ser colocado no tubo de PCR, analise a amostra imediatamente. Prepare a mistura mestra de qPCR conforme descrito no texto do protocolo e certifique-se de que o filtro esteja completamente coberto pela mistura mestra e permaneça fixado à parede do tubo durante toda a reação.

Realize a amplificação utilizando um aparelho de PCR em tempo real conforme descrito no texto do protocolo. Alternativamente, se a PCR em tempo real não puder ser realizada imediatamente, seque o filtro durante a noite em uma caixa contendo dessicante de sulfato de cálcio. No dia seguinte, tampe o tubo de PCR e coloque-o em um envelope de alumínio com dessicante de sílica, armazenando-o em temperatura ambiente até o momento da análise.

Este método permite a amplificação eficiente do provírus HIV-1 a partir de células 8e5 LAV em diferentes números de cópias. As linhas contínuas são gráficos de amplificação obtidos de quatro réplicas de sangue total negativo para HIV-1, adicionado com 4.000, 400, 40 e 10 células 8e5 LAV, com 500 cópias por reação do controle interno. A linha tracejada indica o limite de detecção.

Este próximo gráfico mostra curvas-padrão de valores do ciclo de quantificação calculados a partir do gráfico de amplificação versus log do número de cópias de células LAV 8e5 por 100 microlitros de sangue total. A eficiência calculada da PCR foi de 103%. As réplicas da curva-padrão de DNA proviral do HIV também apresentam amplificação altamente reprodutível.

Além disso, a presença de um controle interno de 500 cópias de hidroxipiruvato redutase mostra que não há inibição da PCR resultante da extração de sangue com este método, independentemente do número de cópias do provírus HIV-1 presentes. As linhas contínuas representam os gráficos de amplificação e a linha tracejada representa o limiar. Após este procedimento, alvos de PCR podem ser amplificados a partir de diversos tipos de espécimes para detectar seu gene de interesse.

Por exemplo, swabs bucais para triagem farmacogenética ou sangue para genotipagem rápida de modelos animais. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos transmitidos pelo sangue pode ser extremamente perigoso e precauções universais devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.