Isolamento de filtração de Ácidos Nucleicos: Um Método de extracção de DNA simples e rápido

O objetivo geral deste método FINA, que significa isolamento de filtração de ácidos nucléicos, é isolar o DNA genômico para amplificação por PCR de amostras complexas de forma rápida e simples, sem o uso de instrumentação laboratorial, como uma centrífuga. Este método rápido de extração de DNA baseado em papel para DNA pró-viral do HIV foi desenvolvido para incorporação em um dispositivo de diagnóstico de PCR quantitativo. A principal vantagem dessa técnica é que os módulos de preparação de amostras e os tubos de PCR podem ser preparados com antecedência, de modo que a extração de DNA leva menos de dois minutos.

Primeiro desenvolvemos este método para ser incorporado a uma amostra para responder ao teste de diagnóstico infantil precoce para HIV-1 a partir do sangue do calcanhar. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque remover o suporte da fita dupla face que prende a membrana de captura de células ao lado do tubo de PCR requer prática. Demonstrando o procedimento estará Jen Reed, uma técnica sênior do meu laboratório.

Comece este procedimento preparando os materiais necessários para montar o módulo de preparação de amostras FINA. Prepare o mata-borrão cortando um quadrado de 35 por 35 milímetros de uma almofada 100% algodão de 2,6 milímetros de espessura. Prepare o filme plástico de parafina com uma fita de suporte de papel.

Corte um pedaço de filme de parafina de 25 por 50 mm e, em seguida, use um martelo para fazer um furo de 7,14 mm de diâmetro no centro da fita. Prepare uma membrana separadora de sangue de vidro encadernada ou disco de captura usando um martelo para perfurar um círculo de 8.35 mm de diâmetro. Para montar o módulo de preparação de amostras FINA, use uma pinça para colocar o disco de captura no centro da almofada de mancha.

Remova o suporte da fita de filme de parafina e coloque-o sobre o disco de captura de forma que toda a fita de parafina deixe o centro do disco de captura exposto. Garanta o contato máximo entre o disco e a almofada de mancha esticando levemente a fita de parafina para cobrir a almofada de mancha e pressionando a fita de parafina firmemente para colá-la à almofada de mancha em todas as bordas do disco. Um disco de fita de 5.1 mm é necessário para ancorar a membrana de captura na lateral do tubo de qPCR para evitar que a membrana bloqueie a detecção de fluorescência do instrumento de PCR em tempo real.

Prepare este disco de fita usando um martelo para perfurar um círculo de fita diagnóstica de poliéster dupla face de uma folha da fita. Usando uma pinça, remova um lado do forro do adesivo da fita. Coloque a fita em um tubo de PCR de 200 microlitros, colando-o em um lado e em direção ao fundo do tubo.

Remova o segundo forro de adesivo. O tubo está agora pronto para receber o disco preparado. A detecção de DNA proviral de sangue total enriquecido com células 8e5 LAV será demonstrada neste vídeo.

Descongele os pellets de células 8e5 LAV previamente congelados no gelo. Preparar uma diluição seriada das células em meio de congelação com concentrações que variam de 1 a 400 células por microlitro. Pipete 10 microlitros de células de cada uma das diluições em um tubo de microcentrífuga.

Adicione 100 microlitros de amostra de sangue total tratada com eDTA negativo para HIV-1 fresco a cada tubo para criar uma curva padrão. Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo cinco vezes. Para iniciar o procedimento de extração de DNA, lise as células sanguíneas adicionando tritão X-100 a uma concentração final de um por cento.

Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo cinco vezes. O sangue deve ficar vermelho translúcido. Pipetar toda a amostra de sangue para o disco de captação.

Uma vedação à prova d'água entre a fita de parafina e a membrana de captura garante que o sangue flua através da membrana. E um bom contato entre a membrana de contato e o conjunto da almofada de mata-borrão garante a rápida absorção da amostra. Deixe a amostra de molho através do filtro.

O lisado de sangue foi absorvido pelo disco de captura e o disco parece mate. Adicionar 600 a 1 000 microlitros de hidróxido de sódio a 10 mmol gota a gota no disco de captura. O filtro mudará de vermelho para branco, indicando a depuração da hemoglobina.

Em seguida, separe o disco da almofada de mancha e aplique o disco na fita no tubo de PCR preparado. Depois que o filtro é colocado no tubo de PCR, analise a amostra imediatamente. Prepare a mistura principal de qPCR conforme descrito no texto do protocolo e certifique-se de que o filtro esteja completamente coberto com a mistura principal e permaneça fixado na lateral do tubo durante toda a reação.

Realize a amplificação usando um dispositivo de PCR em tempo real, conforme descrito no texto do protocolo. Em alternativa, se a qPCR não puder ser realizada, seque imediatamente o filtro durante a noite numa caixa contendo sulfato de cálcio dessecante. No dia seguinte, tampe e coloque o tubo de PCR em uma bolsa laminada com dessecante de sílica e armazene em temperatura ambiente até que esteja pronto para análise.

Este método permite a amplificação eficiente do provírus HIV-1 a partir de células 8e5 LAV em diferentes números de cópias. As linhas sólidas são gráficos de amplificação obtidos a partir de quatro repetições de sangue total HIV-1 negativo enriquecido com 4.000, 400, 40 e 10 células 8e5 LAV com 500 cópias por reação do controle interno. A linha pontilhada indica o limite.

O próximo gráfico mostra curvas padrão de valores de ciclo de quantificação calculados a partir do gráfico de amplificação vs. log número de cópias de 8e5 células LAV por 100 microlitros de sangue total. A eficiência de PCR calculada foi de 103%As réplicas da curva padrão do DNA proviral do HIV também têm amplificação altamente reprodutível.

Além disso, a presença de um controle interno de 500 cópias da hidroxipiruvato redutase mostra que não há inibição da PCR resultante da extração de sangue com esse método, independentemente do número de cópias do provírus HIV-1 presentes. As linhas sólidas representam os gráficos de amplificação e a linha pontilhada representa o limiar. Seguindo este procedimento, os alvos de PCR podem ser amplificados a partir de vários tipos de amostras para detectar seu gene de interesse.

Por exemplo, esfregaços de bochecha para triagem farmacogenética ou sangue para genotipagem rápida de modelos animais. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos transmitidos pelo sangue pode ser extremamente perigoso e precauções universais devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.