Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d'extraction de l'ADN simple et rapide

Le but global de cette méthode FINA, acronyme de filtration isolation of nucleic acids, est d'isoler l'ADN génomique pour l'amplification par PCR à partir d'échantillons complexes rapidement et simplement, sans utiliser d'instrumentation de laboratoire telle qu'une centrifugeuse. Cette méthode rapide d'extraction de l'ADN sur papier, destinée à l'ADN proviral du VIH, a été développée pour être intégrée dans un dispositif diagnostique de PCR quantitative. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les modules de préparation des échantillons et les tubes de PCR peuvent être préparés à l'avance, de sorte que l'extraction de l'ADN prend moins de deux minutes.

Nous avons d'abord mis au point cette méthode afin de l'intégrer à un échantillon pour un test de diagnostic précoce du VIH-1 chez les nourrissons à partir d'un prélèvement sanguin au talon. Généralement, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car le retrait du support du ruban adhésif double face qui maintient la membrane de capture des cellules sur le côté du tube PCR nécessite de la pratique. La procédure sera démontrée par Jen Reed, technicienne principale de mon laboratoire.

Commencez cette procédure en préparant les matériaux nécessaires à l'assemblage du module de préparation d'échantillons FINA. Préparez le tampon d'absorption en découpant un carré de 35 par 35 millimètres dans un tampon en coton à 100 % d'une épaisseur de 2,6 millimètres. Préparez un film plastique en paraffine muni d'un ruban protecteur en papier.

Découpez un morceau de film en paraffine de 25 sur 50 mm, puis utilisez un marteau pour percer un trou de 7,14 mm de diamètre au centre du film. Préparez un disque de capture en verre ou une membrane liante pour séparation du sang en utilisant un marteau pour découper un cercle de 8,35 mm de diamètre. Pour assembler le module de préparation d'échantillon FINA, utilisez une pince pour placer le disque de capture au centre du tampon d'absorption.

Retirez le support du ruban en film de paraffin et placez-le sur le disque de capture de manière à ce que l'ensemble du ruban de paraffin laisse la partie centrale du disque de capture exposée. Assurez un contact maximal entre le disque et le tampon de transfert en étirant légèrement le ruban de paraffin pour couvrir entièrement le tampon et en appuyant fermement sur le ruban afin de l’adhérer solidement au tampon tout autour des bords du disque. Un disque de ruban de 5,1 mm est nécessaire pour fixer la membrane de capture sur la paroi du tube de qPCR, empêchant ainsi la membrane de bloquer la détection de fluorescence par l'appareil de PCR en temps réel.

Préparez ce disque adhésif en utilisant un marteau pour découper un cercle de ruban diagnostique polyester double face à partir d'une feuille de ce ruban. À l'aide de pinces, retirez un côté du support protecteur du ruban. Placez le ruban dans un tube PCR de 200 microlitres, en le collant sur un côté et vers le fond du tube.

Retirez le deuxième support adhésif. Le tube est maintenant prêt à recevoir le disque préparé. La détection de l'ADN proviral à partir de sang total enrichi avec 8e5 cellules LAV sera démontrée dans cette vidéo.

Dégeler les pastilles de cellules LAV 8e5 précédemment congelées sur de la glace. Préparer une dilution sériée des cellules dans le milieu de congélation avec des concentrations allant de 1 à 400 cellules par microlitre. Prélever 10 microlitres de cellules à partir de chaque dilution et les transférer dans un tube micro-centrifuge.

Ajouter 100 microlitres d'échantillon frais de sang total traité à l'eDTA et négatif pour le VIH-1 dans chaque tube afin de créer une courbe standard. Mélanger en tapotant doucement le fond du tube cinq fois. Pour commencer la procédure d'extraction de l'ADN, lyser les cellules sanguines en ajoutant du Triton X-100 à une concentration finale de un pour cent.

Mélanger en tapotant doucement le fond du tube cinq fois. Le sang doit devenir rouge translucide. Prélever l'ensemble de l'échantillon sanguin à l'aide d'une pipette et l'appliquer sur le disque de capture.

Un joint étanche entre le ruban de paraffine et la membrane de capture garantit que le sang circule à travers la membrane. Un bon contact entre la membrane de contact et l'ensemble du tampon d'absorption assure une montée rapide de l'échantillon. Laissez l'échantillon pénétrer complètement à travers le filtre.

Le lysat sanguin a pénétré dans le disque de capture et le disque apparaît terne. Ajouter 600 à 1 000 microlitres d'hydroxyde de sodium à 10 mmol goutte à goutte sur le disque de capture. Le filtre passera du rouge au blanc, indiquant l'élimination de l'hémoglobine.

Ensuite, séparez le disque du tampon d'absorption et appliquez le disque sur le ruban dans le tube PCR préparé. Une fois le filtre placé dans le tube PCR, analysez l'échantillon immédiatement. Préparez le mélange maître de qPCR comme décrit dans le texte du protocole et assurez-vous que le filtre est entièrement recouvert par le mélange maître et reste fixé sur la paroi du tube tout au long de la réaction.

Réalisez l'amplification à l'aide d'un appareil de PCR en temps réel, comme décrit dans le texte du protocole. En alternative, si la PCR quantitative ne peut pas être effectuée immédiatement, séchez le filtre pendant une nuit dans une boîte contenant un desséchant à base de sulfate de calcium. Le jour suivant, fermez hermétiquement le tube PCR et placez-le dans une pochette en aluminium contenant un desséchant à base de silice, puis conservez-le à température ambiante jusqu'au moment de l'analyse.

Cette méthode permet une amplification efficace du provirus du VIH-1 à partir de cellules 8e5 LAV à différents nombres de copies. Les lignes continues représentent les courbes d'amplification obtenues à partir de quatre réplicats de sang total négatif pour le VIH-1, enrichi avec 4 000, 400, 40 et 10 cellules 8e5 LAV, avec 500 copies par réaction du contrôle interne. La ligne pointillée indique le seuil.

Ce graphique suivant présente des courbes standards des valeurs de cycle de quantification calculées à partir du tracé d'amplification en fonction du logarithme du nombre de copies de 8e5 cellules LAV par 100 microlitres de sang total. L'efficacité calculée de la PCR était de 103 %. Les répliques de la courbe standard de l'ADN proviral du VIH présentent également une amplification hautement reproductible.

En outre, la présence d'un témoin interne de 500 copies de réductase hydroxy pyruvique montre qu'il n'y a aucune inhibition de la PCR résultant de l'extraction du sang par cette méthode, indépendamment du nombre de copies du provirus VIH-1 présentes. Les lignes continues représentent les courbes d'amplification et la ligne pointillée représente le seuil. Suivant cette procédure, les cibles de PCR peuvent être amplifiées à partir de divers types d'échantillons afin de détecter votre gène d'intérêt.

Par exemple, des prélèvements buccaux pour le dépistage pharmacogénétique ou du sang pour la génotypage rapide de modèles animaux. N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes transmissibles par le sang peut être extrêmement dangereux et que des précautions universelles doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.