Name: Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a visualizar a ligação da proteína HIV-1 Gag a membranas de vesículas gigantes unilamelares (GUV) usando marcação YFP. Este método simplifica a detecção direta das interações lipídeo-proteína em virologia.

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Nós gostaríamos de agradecer Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan para discussões úteis. Agradecemos também Priya Begani de assistência durante as filmagens. Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R01 AI071727 (para AO) e R01 GM110052 (a SLV).

Dia 1: Expressão de mordaça proteínas utilizando a transcrição in vitro-translation sistema baseado em Lysate germe de trigo 1. Preparação do HIV-1 Gag <ol><li> Remove todos os reagentes do kit comercial CECF de gérmen de trigo a partir de congeladores (lisados ​​de gérmen de trigo são armazenadas a -80 ° C; outros reagentes, a -20 ºC). Descongelar-los em gelo e misturar os componentes como apresentados na Tabela 1. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Mix-1 (alimentação mix) </td><td></td></tr><tr><td> solução de alimentação </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 80 ul </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 1.000 l </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Mistura-2 (Lisado mix) </strong&gt; </td><td></td></tr><tr><td> lisados ​​de gérmen de trigo </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNase água livre </td><td> 7 ul </td></tr><tr><td> Aminoácidos </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> metionina </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> O DNA de plasmídeo em tampão TE (1 ug / uL) ** </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> tampão de reacção </td><td> 15 ul </td></tr><tr><td> RNasin * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Total </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Composições de misturas necessárias para reacções de gérmen de trigo. Nota: Se o experimento foi concebido para examinar o efeito da remoção de ARN por ARNase de Gag de ligação à membrana, substituir inibidores de ribonuclease com água sem RNase. O DNA de plasmídeo deve ser livre de impurezas de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, plasmids preparados utilizando técnicas convencionais, mas não, kits de isolamento de plasmídeos endotoxina-livres têm sido utilizados com sucesso. instruções do fabricante também recomenda o uso de DNA dissolvido em água livre de nuclease. Se utilizando ADN suspensas em TE [Tris-HCl a 10 (pH 7,4) contendo EDTA 1 mM], evitar a utilização de concentrações mais baixas de ADN, uma vez que o EDTA em TE pode afectar o rendimento. Os plasmídeos dissolvido em tampão TE a uma gama de concentrações de 0,8-1 mg / mL foram utilizadas com sucesso. <ol start="2"><li> Primeiro adicione a mistura de alimentação (Mix-1) na cassete de reacção (câmara transparente). Em seguida, adicione a mistura de lisado (Mix-2) para a outra câmara (vermelho). Não introduzir bolhas ao adicionar as misturas nas suas respectivas câmaras, uma vez que podem conduzir a troca ineficaz dos componentes da solução e, portanto, reduzir a eficiência da reacção. </li><li> Cobrir as câmaras com a película adesiva fornecida com o kit. </li><li> Insira a cassete de reação no compartimento de cassete e incubate o conjunto durante 24 horas a 24 ° C a uma velocidade de agitação constante de 900 rpm num Eppendorf Thermomixer R. </li></ol> Dia 2: Preparar GUVs por eletroformação e colheita de germe de trigo Lysates 2. Preparação de GUVs <ol><li> Alíquotas lípidos dissolvidos em solventes inorgânicos tais como o clorofórmio ou misturas de clorofórmio e metanol em frascos de vidro com tampas de rosca forrada com forros de teflon e embrulhados com parafilme. Lidar com lipídios com seringas de vidro Hamilton-tipo, ou se disponível, pontas de plástico de clorofórmio-resistente. Retire os frascos de vidro contendo lípidos para ser usado para preparação de GUV a -20 ºC congelador. <ol><li> Uma vez que os frascos são equilibrados até à temperatura ambiente, certifique-se por inspecção visual que as suspensões lipídicas são claras. A qualidade de lípidos, em particular lípidos ácidos, tais como fosfatidilserina palmitoil-oleoil (POP) e PI (4,5) P 2, é importante para experiências bem sucedidas. Não use lipídios que sãoem alíquotas durante mais de 2 meses. </li></ol></li><li> Pré-aquecer num bloco de aquecimento para a temperatura desejada. Esta temperatura deve ser de pelo menos 5 ° C superior à temperatura de fusão (Tm) do lípido (s) com a mais elevada Tm. </li><li> Calcular os volumes de lípidos necessários de acordo com os rácios molares desejados de lípidos. Para estudar o HIV-1 Gag de ligação aqui, utilizar as seguintes razões molares como mostrado na Tabela 2. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> mistura de lípidos </td><td> razão molar </td><td> Volume (em mL) </td><td> da concentração </td></tr><tr><td> POPC + POPS + Chol </td><td> 46,6 + 23,3 + 30 </td><td> 19,74 + 10,18 + 6,57 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> POPC + POPS + Chol + Brain-PI (4,5) P 2 </td><tdrowspan = &quot;2&quot;&gt; 40 + 20 + 30 + 10 </td><td rowspan="2"> 16,11 + 8,3 + 6,25 + 58,19 </td><td> POPC, POPS, Chol: 10 mg / ml </td></tr><tr><td> Brain-PI (4,5) P 2: 1 mg / mL </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Volumes de diferentes lipídios utilizada para obter GUVs. <ol start="4"><li> Adicione os volumes desejados de lípidos em um frasco de vidro com tampa de rosca limpo. </li><li> Lâminas de dimensões 25 x 50 x 1,1 mm3 e resistência 70-100 co (como descritos no catálogo) Uso de ITO revestido. Coloque duas lâminas ITO-revestidos de uma bancada limpa. Cada câmara eletroformação requer dois-tin-óxido de índio (ITO) lâminas de vidro -Revestido. Verificar que o lado condutora da lâmina de vidro é virada para cima, verificando a resistência utilizando um multímetro. Ele deve mostrar um valor de cerca de 200 Ω. Certifique-se a superfície das lâminas são limpos, limpando suavemente com 70% de etanol usando toalhetes sem fiapos. </li><li> Limpar a superfície exterior de uma agulha de uma seringa por RInsing com clorofórmio e colocar a seringa no bloco de calor. </li><li> Colocar uma nova lâmina de vidro revestido de ITO-no bloco de calor com o lado voltado para cima condutora e permitir que ele para equilibrar até à temperatura desejada geralmente cerca de 2-3 min. Não reutilize as lâminas de vidro ITO-revestidos para um risco potencial que o ITO-revestimento nas lâminas de vidro pode ser danificado durante procedimentos de limpeza. </li><li> Use um volume de 40-50 mL da mistura de lípidos para cada slide para uniforme e ainda rápida divulgação dos lipídios sobre a lâmina de vidro. Ajustar o volume total com um solvente orgânico apropriado tal como clorofórmio. <ol><li> Coloque uma metade do volume total da mistura de lípidos na lâmina de vidro e espalhou imediatamente o lípido usando a seringa limpa (passo 2.6) para dar uma película lipidica uniforme (movendo a agulha 2-3 vezes em toda a corrediça). Espalhe o filme lipídico gentilmente (mas rapidamente) para evitar qualquer dano ao revestimento ITO fina. Não uniforme difundir ou espalhar áspera pode levar a sub-óptimarendimentos ou heterogeneidade computacional de GUVs. </li><li> Portanto, certifique-se disseminação uniforme inspecionando o filme lipídico após espalhar antes de prosseguir para a próxima etapa. Se a opacidade do filme parece excessivamente não uniforme, refazer o procedimento usando uma nova lâmina. </li></ol></li><li> Colocar a lâmina revestido dentro de um prato de Petri com o lado revestido voltado para cima. </li><li> Repita os passos de 2,6-2,9 para o resto da mistura utilizando uma outra lâmina de ITO revestido. </li><li> Colocar a placa de petri contendo ambos os diapositivos numa câmara de vácuo convencional dessecação durante 60-90 minutos para remover quaisquer vestígios de solventes orgânicos. </li><li> Durante este processo, definido na incubadora para a mesma temperatura que a do bloco de aquecimento (65 ° C na maior parte dos casos) e pré-aquecer a 300 mM de uma solução de sacarose na incubadora. </li><li> Após a secagem, trazer o prato de petri para o banco e colocar a lâmina de vidro sobre uma superfície limpa. </li><li> Suavemente limpar uma junta de PDMS (Figura 1) usando 70% de etanol e seca-lo completely. </li><li> Colocá-lo sobre a lâmina de vidro revestida de lípido, como mostrado na Figura 1 e suavemente e pressione firmemente de modo a que as formas de vedação uma vedação estanque à água. Confirmar a ausência de lacunas entre a junta PDMS eo slide. Isto resulta na formação de uma câmara superficial que contém a solução de sacarose. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig1.jpg" /> Figura 1:. O layout da lâmina de vidro ITO revestido usado para eletroformação <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="16"><li> Encha a câmara com solução de sacarose pré-aquecido, sem quaisquer bolhas. </li><li> Coloque a outra lâmina revestida em cima para fazer um selo apertado. Certifique-se que não há bolhas. A montagem final deve aparecer como mostrado na Figura 2. Aperte o usin câmaraclips g Binder. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig2.jpg" /> Figura 2:. Representação esquemática da câmara de eletroformação (vista lateral) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="18"><li> Retire o excesso de sacarose por aspiração e limpar os slides usando toalhetes sem fiapos. Apertem os slides para a barra de cobre para que os lados condutores estão em contato uniforme com a barra. Certifique-se de que apenas um lado condutor da placa de vidro está em contacto com uma barra de cobre. </li><li> Conectar-se a barra de cobre para a saída do gerador de função usando as garras jacaré. Coloque o conjunto dentro da incubadora para permitir que o conjunto para equilibrar com a temperatura desejada. </li><li> Aplique uma freqüência de onda senoidal de 10 Hz e uma diferença de potencial de 1 V por 90 min. assegue que a tensão é 1 V por um multímetro conforme mostrado na Figura 3. Continuar o processo durante 90 min. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54293/54293fig3.jpg" /> Figura 3:. As posições em que os eléctrodos do multímetro são colocados para medir a frequência e corrente <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54293/54293fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="21"><li> Após 90 min, lentamente diminuir a frequência de 2 Hz e continuar eletroformação durante mais 10 min. Durante este tempo, a colheita em reacções de tradução in vitro (passos 3,1-3,2). </li><li> Desligue o gerador de função e permitir que o conjunto arrefecer lentamente à temperatura ambiente (desligando a incubadora e deixando a porta da incubadora ligeiramente aberta). </li><li> Após o resfriamento, desconecte os cabos do geradordos conjuntos deslizantes. GUVs pode ser muito frágil e, portanto, precisa ser manuseado com muito cuidado. trazer cuidadosamente o conjunto para o banco. </li><li> Desmonte a câmara, removendo suavemente o cursor superior usando uma pinça. Colheita das suspensões contendo GUVs sacarose utilizando uma ponta ul corte 1.000 e transferir para um tubo limpo. Lidar com o tubo suavemente para evitar a interrupção de GUVs. </li><li> Use as GUVs imediatamente. GUVs são estáveis ​​durante pelo menos 90 minutos após a colheita, quando armazenados à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Reacções colheita tradução in vitro <ol><li> Colher as reacções de tradução in vitro contendo proteínas desejadas a partir da câmara de vermelho utilizando uma micropipeta para um tubo. </li><li> Para remover proteínas agregadas, girar os lisados ​​a 16200 xg durante 15 min numa centrífuga de mesa e transferir cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. </li></ol> 4. ensaio de ligação GUV <ol><li> Usando uma ponta de corte, misturar 51; l de reacções de tradução in vitro contendo proteínas traduzidas e 5 ul de GUVs em um tubo e incubar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Anexar uma folha de PDMS com um pequeno furo (3-4 mm de diâmetro) em uma lamela limpa e garantir a vedação estanque, pressionando-o suavemente e firmemente contra a lamela. </li><li> Coloque a mistura de 10 ul a partir do passo 4.1 no pequeno orifício. </li><li> Imagem a mistura sob um microscópio de fluorescência invertido confocal de epi ou à temperatura ambiente. Nota: Para evitar a evaporação, a câmara de imagem pode ser coberto por uma lamela. </li></ol>

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</ol>

Declaramos que não temos interesses conflitantes.

O ensaio de ligação GUV como descrito acima fornece uma boa alternativa em situações onde outros ensaios de interação proteína-lipídica têm as suas limitações. Este ensaio nos permite examinar as interações entre ácido mirístico Gag de corpo inteiro e lipídios ácidos com cadeias acilo de comprimento nativa no contexto bicamada lipídica e fazê-lo sem longas centrifugação flotação por meio de alta densidade gradientes de sacarose ou outro processamento pós-obrigatório de Gag-lipídico complexos. Outra vantagem é que o comp...

vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) é um vírus com envelope que monta a e gomos a partir da membrana plasmática (PM) na maior parte dos tipos de células. A montagem do HIV-1 partículas de vírus é conduzida por a proteína de núcleo virai de 55 kDa chamado Pr55 Gag (GAG). Gag é sintetizado como um precursor de poliproteina composto por quatro domínios estruturais principais, isto é, matriz, da cápside, nucleocápside, e P6, bem como dois péptidos espaçadores SP1 e SP2. Durante a montagem, o (MA) de domínio matriz é responsável pelo direcionamento de mordaça para o local de montagem, o capsídeo (CA) de domínio medeia interações-Gag Gag, o (NC) de domínio nucleocï¿½side recruta RNA genômico viral, e fatores do hospedeiro p6 recrutas que auxiliam vírus cisão de partícula a partir da membrana plasmática. Gag também sofre uma modificação co-translacional pela adição de um ácido gordo de 14 carbonos ou radical miristato na sua extremidade N-terminal. ligação de Gag membrana é um requisito essencial para a montagem viral, uma vez que mutants que são defeituosos na ligação à membrana não produzem partículas virais. Nós e outros autores mostraram que a ligação de gag é mediada por sinais bipartidos dentro do domínio MA membrana: a porção miristato de N-terminal que medeia interacções hidrófobas com a bicamada lipídica e um aglomerado de resíduos básicos dentro do domínio MA denominado como região altamente básica ( HBR) que interage com lípidos ácidas sobre o PM 1-4. Estudos de gag-membrana interacções utilizando a expressão ectópica de polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), uma enzima que catalisa a hidrólise do fosfolípido phosphatidylinositol- ácida PM-específico (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] a fosfatidilinositol-4-fosfato, em células sugeriram que Gag-AM localização é mediada por PI (4,5) P 2 3,5. No entanto, estudos in vitro visando a entender mais detalhes mecanicistas de Gag-PI (4,5) P 2 interações têm provado ser um desafio para um número de razões. Paraexemplo, a purificação de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 por experiências bioquímicas tem sido tecnicamente difícil, pelo menos em parte, devido à tendência de Gag para agregar durante a purificação. Assim, as formas truncadas de HIV-1 da mordaça, tais como Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou a forma não-miristoiladas têm sido frequentemente utilizada em estudos que necessitam de purificação da mordaça (por exemplo, ressonância magnética nuclear, a pegada de proteína, e a superfície ressonância de plasma de 6-9). Alternativamente, acoplados em reacções de transcrição-tradução in vitro têm sido utilizados para produzir de comprimento completo miristoilada Gag de HIV-1 em outros estudos bioquímicos 1,2. Tipicamente neste sistema, um plasmídeo Gag-codificação é transcrita e traduzida com lisados ​​de células eucarióticas (por exemplo, os lisados ​​de reticulócitos de coelho) que são desprovidas de quaisquer membranas celulares e RNAs mensageiros mas contêm os mecanismos de transcrição e tradução. Após a reacção, os lisados ​​de células que contêm gag são misturados com membranes para análise das interações da mordaça com lipídios. Além da facilidade de preparação de comprimento completo miristoilada Gag, os métodos que utilizam o sistema de tradução in vitro de transcrição têm uma vantagem que a síntese de gag e reacções de ligação à membrana posterior ocorrer num meio &#39;eucariótica citosol-like &quot;, que podem representar melhor as condições fisiológicas. Esta propriedade contribuiu para os estudos que mostraram que as moléculas de RNA ligadas ao domínio MA regular Gag ligação a lípidos ácidas de forma competitiva 1,2,10-12. No entanto, uma vez que a quantidade total de proteínas Gag obtidos nestes lisados ​​de células não são elevadas, a marcação metabólica das proteínas com aminoácidos marcados radioactivamente é necessário para a sua detecção. Dependendo do método para medir as interações Gag-lípidos, têm sido utilizados uma variedade de preparações de membrana. Cada um desses métodos tem seus pontos fortes e limitações. A maioria dos ensaios baseados-RMN requerem a utilização de lípidos com acilo curtocadeias que são solúveis em água (por exemplo, C4-C8-e PI (4,5) P 2) 6,8. Enquanto os métodos de RMN de teste de ligação de Gag aos lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento encontradas nas células estão a ser desenvolvidos, eles foram usados ​​apenas com MA com ácido mirístico ou nonmyristoylated, até agora, 8,13. Em alternativa, os lipossomas preparados a partir de lípidos que têm cadeias de acilo de comprimento nativos têm sido utilizados em métodos bioquímicos, tais como lipossomas ou flotação fluorescente talão lipossoma ensaios de ligação 2,3,10,14-16. No entanto, os lipossomas utilizados nestes ensaios têm pequenos diâmetros, e, assim, as suas membranas têm curvaturas acentuadas e positivos. Em contraste, durante a fase inicial de montagem de partículas em células de VIH-1 infectados, Gag se liga ao PM, que é praticamente planar na escala de Gag, e, subsequentemente, induz curvatura negativa durante a floração. Portanto, as membranas de lipossomas com curvatura acentuada e positivo pode não ser bicamadas lipídicas ideais para estudar as interações da mordaça-lipídico. Quanto Flot lipossomaensaios ation, outra ressalva potencial é que a exposição de complexos Gag-lipídicas para gradiente de sacarose hipertônica durante a centrifugação pode afetar o resultado experimental. Para atenuar estas limitações e proporcionar um sistema experimental complementar, para ensaios de ligação a GAG de gigantes vesículas unilamelares (GUVs) têm sido desenvolvidos nos últimos anos. GUVs são vesículas única bicamada lipídica cujos diâmetros se estendem a várias dezenas de micrómetros. Assim, a curvatura destas membranas se assemelha a PM na escala de Gag. Além disso, devido ao seu grande tamanho, que permite a inspeção visual sob microscópios ópticos, ligação à membrana proteínas da mordaça de fluorescência marcados ou rotulados com essas vesículas após a mistura pode ser facilmente determinada sem tratamento posterior dos complexos Gag-lipídicas. Nós aqui descrevemos um protocolo para estudar HIV-1 Gag membrana ligação usando GUVs obtidos a partir de um método eletroformação. Vários métodos, tais como a hidratação suave, hidratação assistida-gel, microfonerofluidic de jacto, e eletroformação 17-22 têm sido usados ​​para obter GUVs. Para o protocolo aqui descrito, o método da eletroformação é utilizado principalmente devido à sua eficiência na formação GUVs lípidos com ácidos e a sua relativa facilidade de utilização, sem a necessidade de instalações dispendiosas. Uma vez que a visualização de Gag necessita de um repórter fluorescente, amarela proteína fluorescente (YFP) está geneticamente adicionado ao C-terminal de Gag (gag-YFP). Proteínas gag-YFP são obtidos por reacções de transcrição in vitro e tradução em lisados ​​de gérmen de trigo com base na tecnologia contínua de permuta de fluxo contínuo (CECF). Nesta tecnologia, tanto a remoção de produtos secundários inibidores das reacções e fornecimento de substratos de reacção e componentes de energia são alcançados de um mecanismo baseado em diálise. Para estas reacções, é usado um plasmídeo que codifica Gag-YFP sob o controlo de um promotor de T7. É de notar, como mostrado anteriormente, lisados ​​de gérmen de trigo apoiar miristoilaï¿½o sem componentes adicionais 23,24. Usando este método, foi possível obter quantidades suficientes de comprimento completo miristoilada Gag-YFP para visualização de Gag em membranas GUV 24. Aqui nós descrevemos o protocolo com a qual o HIV-1 Gag ligação a PI (4,5) P 2 molecular contendo membranas GUV podem ser examinados sem processamento subsequente longa seguinte reacções de ligação e propor que este método complementa preexistente Gag-membrana ensaios de ligação e pode ser estendido para entender melhor o HIV-1 Gag-membrana vinculativo.

<table><tbody><tr><td>Multímetro Digital</td><td>Meterman</td><td>30XR</td><td>Um multímetro genérico que pode medir resistência e volts servirá ao propósito.</td></tr><tr><td>Gerador de função</td><td>Instek</td><td>GFG-8216A</td><td>Um gerador de função genérico capaz de gerar uma onda senoidal a 10 Hz e 1 V é suficiente.</td></tr><tr><td>Lâminas de vidro revestidas com ITO</td><td>Delta Technologies, Loveland, CO</td><td>CG-90IN</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Hoefer</td><td></td><td>Qualquer incubadora que possa manter a temperatura com precisão será suficiente</td></tr><tr><td>Câmara de vácuo</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Seringa</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td>Calibre 22S, número da seringa 702</td></tr><tr><td></td><td>Kit de base de elastômero PDMS Sylgard, Dow-Corning</td><td>Sylgard, 184</td><td></td></tr><tr><td>RTS 100 Kit CECF de Gérmen de Trigo</td><td>BiotechRabbit, Berlim, Alemanha</td><td>BR1401001</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA&nbsp;</td><td>D7757</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Lipídios Polares, Alabastro, AL&nbsp;</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>700041P</td><td></td></tr><tr><td>Brain-PI(4,5)P2&nbsp;</td><td>Lipídios Polares</td><td>Avanti 840046X</td><td></td></tr></tbody></table>

visualização de hiv-1 gag vinculação a gigante unilamelares vesículas (guv) membranas

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

A proteína estrutural do VIH-1, Pr55 da mordaça (ou GAG), liga-se à membrana plasmática em células durante o processo de montagem do vírus. ligação de Gag membrana é um passo essencial para a formação de partículas de vírus, uma vez que um defeito no resultado de ligação à membrana da mordaça em grave comprometimento da produção de partículas virais. Para obter detalhes mecanísticos de interacções da membrana Gag-lipídicos, e métodos in vitro com base em RMN, a pegada de proteína, ressonância de plasma de superfície, a centrifugação dos lipossomas de flutuação, ou grânulo fluorescência ligação de lípidos têm sido desenvolvidos até agora. No entanto, cada um destes métodos in vitro tem as suas limitações. Para ultrapassar algumas destas limitações e proporcionar uma abordagem complementar com os métodos previamente estabelecidos, foi desenvolvido um ensaio in vitro em que as interacções entre o HIV-1 gag e membranas lipídicas ter lugar num ambiente de &quot;célula-like&quot;. Neste ensaio, Gag ligação a membranas lipídicas é visualmente analisadas usando-YFP Tagged Gag sintetizado em um germe de trigo baseada no sistema de tradução in vitro e GUVs preparados por uma técnica da eletroformação. Aqui nós descrevemos os antecedentes e os protocolos para obtenção de proteínas da mordaça completos com ácido mirístico e membranas GUV necessárias para o ensaio e para detectar Gag-GUV ligação por microscopia.

<html> Usando o protocolo acima, preparamos GUVs compostos por POPC + + POPS Chol (razão molar: 4,66: 2,33: 3). Esta composição foi escolhida para aproximadamente reflectir as concentrações de colesterol e de PS PM. Robusto e eficiente ligação de Gag foi observada somente quando o cérebro-PI (4,5) P 2 foi incluída na mistura POPC + POPS + Chol-PI cerebral (4,5) P 2 [razão molar (POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1], neste exemplo) (Figura 4, comparar o...

Ilustramos aqui um ensaio de ligação à membrana in vitro no qual as interações entre HIV-1 Gag e membranas lipídicas são analisadas visualmente usando Gag marcado com YFP sintetizado em um sistema de tradução in vitro baseado em gérmen de trigo e GUVs preparados por uma técnica de eletroformação.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a ligação da proteína Gag do HIV-1 em membranas de vesículas unilamelares gigantes. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de Montagem Biológica, como os papéis desempenhados por lipídios com diferentes cadeias lipídicas na ligação à membrana ou em proteínas viroestruturais, tais como as proteínas Gag virais in vitro.A principal vantagem desta técnica é que a ligação da proteína Gag à membrana pode ser detectada visualmente em membranas de vesículas unilamelares gigantes, diretamente após a mistura, evitando etapas pós-mistura potencialmente prejudiciais e demoradas. A preparação da proteína Gag do HIV-1 é abordada no protocolo descrito no texto e deve ser realizada um dia antes da preparação das VUGs.Retire os estoques de lipídios do congelador e equilibre à temperatura ambiente. Enquanto isso, ajuste a temperatura do bloco de aquecimento em pelo menos cinco graus Celsius acima da temperatura de fusão mais alta dos lipídios em uso. Nesta demonstração, a temperatura é ajustada em 65 graus Celsius, a temperatura mais alta que utilizamos.Os lipídios devem ser dissolvidos em solventes inorgânicos, armazenados em frascos de vidro com tampas rosqueáveis revestidas com teflon e envolvidos em Parafilm. Após o descongelamento, certifique-se de que as suspensões estejam clarificadas. Calcule os volumes de lipídios necessários de acordo com as proporções desejadas de molar/lipídio.Em seguida, alíquotar os volumes calculados em um frasco de vidro limpo com tampa de rosca, utilizando um dispositivo resistente ao clorofórmio, como uma seringa de vidro do tipo Hamilton. Ajustar o volume total com um solvente orgânico apropriado, como clorofórmio. Em seguida, preparar dois novos lâminas revestidas com ITO para cada câmara de eletroformação.Verifique se o lado condutor da lâmina está voltado para cima, verificando a resistência com um multímetro, que deve ser de aproximadamente 200 ohms. Em seguida, limpe suavemente suas superfícies usando etanol a 70% e lenços livres de fiapos. A seguir, limpe a superfície externa da agulha da seringa enxaguando-a com clorofórmio e coloque a seringa no bloco de aquecimento.Coloque também as lâminas revestidas com ITO limpas no bloco de aquecimento, com o lado condutor voltado para cima. Em alguns minutos, as lâminas atingirão a temperatura. Em seguida, adicione de 40 a 50 microlitros da mistura lipídica a uma das lâminas.O lipídio deve ser espalhado rapidamente, mas de forma tão uniforme quanto possível. Em seguida, adicione outra metade do volume da mistura de lipídios a outra lâmina de vidro e espalhe imediatamente para formar um filme lipídico uniforme. Seja rápido e delicado para evitar danificar o revestimento fino de ITO.Se a opacidade do filme parecer excessivamente não uniforme, repita o procedimento usando uma nova lâmina. Em seguida, prepare um segundo par de lâminas com uma mistura lipídica diferente da primeira. Uma camada uniforme de lipídios é necessária para obter rendimentos ótimos de GUVs e para a uniformidade composicional dos GUVs.Armazene as lâminas em uma câmara de dessicação a vácuo por 60 a 90 minutos para remover traços de solvente orgânico. Para o próximo passo, ajuste uma estufa à temperatura do bloco de aquecimento utilizado nas etapas anteriores e aqueça um estoque de solução de sacarose 300 milimolares até essa temperatura. Além disso, prepare uma junta de PDMS limpando-a suavemente com etanol 70%, e deixe-a secar completamente.Uma vez que as lâminas tenham secado, coloque-as sobre uma superfície limpa e pressione suave, mas firmemente, a junta em uma das lâminas, de modo que ela forme um selo estanque. Confirme a ausência de gás entre a junta de PDMS e a lâmina. Em seguida, preencha completamente a junta com a solução de sacarose pré-aquecida.Não deixe bolhas. Agora, pressione a outra lâmina revestida sobre a junta, alinhando-a com a outra lâmina. Certifique-se de que não haja bolhas e fixe a câmara usando clipes de papel.Em seguida, remova a solução de sacarose em excesso por aspiração e limpe as lâminas utilizando panos livres de fiapos. Para prosseguir, fixe o conjunto de lâminas a uma barra de cobre de modo que o lado condutor de cada lâmina tenha contato uniforme com a barra. Depois, conecte a barra de cobre à saída do gerador de funções e coloque o conjunto dentro do incubador, mantendo o gerador de funções do lado de fora.Uma vez atingida a temperatura, configure o gerador de funções para aplicar uma onda senoidal de 10 Hz e uma diferença de potencial de um volt por 90 minutos. Certifique-se de que a tensão seja de um volt utilizando um multímetro. Após 90 minutos, diminua lentamente a frequência para 2 Hz e continue a eletroformação por mais 10 minutos.Neste período, colete a proteína Gag do HIV-1 a partir da reação de tradução in vitro preparada no dia anterior. Remova agregados indesejados centrifugando os lisados e transfira cuidadosamente o sobrenadante para outro tubo. Após 10 minutos a dois Hz, desligue o gerador de funções, desligue o incubador e mantenha a porta do incubador aberta até que o conjunto retorne à temperatura ambiente.Após esfriar, leve cuidadosamente o conjunto da lâmina até a bancada e desmonte suavemente a câmara removendo a lâmina superior com pinça. Transfira as GUVs com uma ponteira de pipeta de 1000 microlitros recortada para um novo tubo. Manipule este tubo com cuidado e utilize as GUVs dentro de 90 minutos.Em seguida, prepare uma câmara de imagem. Fixe uma folha de PDMS contendo um pequeno orifício sobre uma lamínula limpa. Pressione suave e firmemente para obter um selamento hermético.Em seguida, misture cinco microlitros da reação de tradução in vitro com cinco microlitros de GUVs. Após alguns minutos, transfira a mistura para a câmara de imagem e prossiga com a aquisição de imagens. Para prevenir evaporação, a câmara de imagem pode ser coberta com uma lamínula.Utilizando o protocolo descrito, foram preparadas GUVs compostas por POPC, POPS e colesterol em uma proporção molar de 4,7:2,3:3. A medição da fluorescência dos sinais de Gag YFP em uma GUV mostra que eles não são detectáveis acima do fundo na superfície da GUV. No entanto, a proteína Gag-YFP se ligou eficientemente às GUVs quando o brain-PIP2 foi incluído na mistura lipídica.A ligação de Gag é evidente pelo aumento da intensidade da fluorescência na superfície da membrana, que, quando escaneada, aparece como um pico acentuado. Após dominada, desde que a proteína esteja disponível em forma fluorescentemente marcada, esta técnica pode ser realizada em quatro a cinco horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manipular as GUVs com cuidado e sempre usar lipídios frescos quando possível.Essa técnica permitiu que pesquisadores na área de montagem de retrovírus examinassem as interações com membranas das proteínas Gag retrovirais in vitro, sem os demorados procedimentos pós-mistura, que podem alterar o estado latente das interações.

visualization-hiv-1-gag-binding-to-giant-unilamellar-vesicle-guv

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