Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

O objetivo geral dessa técnica de imagem direta de trombo é visualizar quantitativamente tromboembolias cerebrais marcadas com fluorescência in vivo e ex vivo, utilizando nanopartículas de ouro, tomografia computadorizada e imagem fluorescente no infravermelho próximo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de hemostasia e trombose, como o tempo ou dose dependente e a resposta ortopédica grave de tromboembolias cerebrais ao ativador do plasminogênio tecidual ou novos agentes trombolíticos em investigação. A principal vantagem desta técnica é que, após a injeção intravenosa de nanopartículas de ouro, a micro-TC de alta resolução permite capturar a evolução dinâmica de tromboembolias cerebrais ao visualizar suas localizações e carga quantitativamente in vivo, sendo posteriormente confirmada pela imagem de trombo fluorescente no infravermelho próximo ex vivo.

O procedimento será demonstrado por Jeong-Yeon Kim, pós-doutoranda do meu laboratório. Após coletar de 300 a 1.000 microlitros de sangue arterial por punção cardíaca, adicione 70 microlitros da amostra a 30 microlitros do fator de coagulação ativado apropriado, 13 mediado pela atividade fluorescente sensível à reticulação de fibrina, e carregue uma seringa de três mililitros, equipada com agulha de 23 gauge, com a mistura resultante. Em seguida, injete o sangue marcado em um tubo de polietileno de 20 centímetros de comprimento e deixe o sangue coagular à temperatura ambiente.

Após duas horas, transfira o tubo para quatro graus Celsius por 22 horas, depois corte o tubo em pedaços de 1,5 centímetro. Usando uma seringa de três mililitros cheia com PBS, expulse o trombo de cada pedaço do tubo para poços individuais de uma placa de seis poços contendo PBS. Lave os trombos três vezes com PBS, então insira uma seringa de um mililitro cheia com soro fisiológico, equipada com uma agulha de 30 graus, em uma extremidade de um tubo PE10 de 15 centímetros e delicadamente aspire um único trombo lavado para a extremidade oposta do tubo.

Em seguida, conecte o tubo PE10 carregado com trombo a um tubo PE50 de três centímetros de comprimento com extremidade afunilada de 200 mícrons de diâmetro. Após confirmar a anestesia pela ausência de resposta ao aperto dos dedos dos pés, desinfete a área cirúrgica com Betadine e álcool 70% e use um bisturi para fazer uma incisão vertical de um centímetro entre a orelha esquerda e o olho. Cole a extremidade distal da fibra óptica de um medidor de fluxo sanguíneo por laser Doppler sobre a superfície exposta do osso temporal esquerdo, um milímetro à esquerda e quatro milímetros abaixo do bregma, e inicie o monitoramento Doppler.

Em seguida, faça uma incisão mediana vertical de três centímetros através dos tecidos moles perivasculares para expor a região do bulbo carotídeo esquerdo. Usando um fio de seda preto estéril 6-0, ligue a artéria carótida comum proximal esquerda, seguido pela ligadura da artéria carótida interna esquerda e da artéria pterigopalatina esquerda com fios de seda preta estéreis 7-0. Usando uma cautérização elétrica monopolar, cauterize a artéria tireóidea superior esquerda, depois use fios de seda preta estéreis 7-0 para ligar frouxamente a artéria carótida externa proximal esquerda e para ligar firmemente a extremidade distal do vaso.

Use microtesouras para fazer um orifício de 0,2 a 0,25 mícrons entre os pontos ligados da artéria carótida externa e insira o cateter contendo o trombo no orifício, afrouxando ao mesmo tempo a ligadura proximal da artéria carótida externa. Avance o cateter para dentro da artéria carótida comum para fixá-lo no lugar e reaperte a ligadura proximal da artéria carótida externa. Corte a extremidade distal da artéria carótida externa por eletrocoagulação e gire a extremidade proximal livre da artéria carótida externa no sentido horário para alinhar o vaso com a artéria carótida interna enquanto retira o cateter.

Em seguida, solte a ligadura da artéria carótida interna e avance imediatamente o cateter cerca de nove milímetros até a bifurcação da artéria cerebral média com a artéria cerebral anterior. Agora, reaperte o ponto da artéria carótida interna ao redor do cateter e pressione suavemente a seringa para injetar o trombo na região da bifurcação. Se um fluxo sanguíneo igual ou superior a 30% inferior ao valor basal for observado no Doppler, remova o cateter e ligue imediatamente a extremidade proximal da artéria carótida externa.

Para obter imagens do trombo por microtomografia computadorizada no ponto temporal experimental apropriado, dilua nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina até uma concentração de 10 miligramas por mililitro em PBS 10 milimolar e sonique o agente de imagem do trombo por 30 minutos para garantir uma suspensão homogênea das nanopartículas. Em seguida, injete 300 microlitros das partículas direcionadas à fibrina na veia peniana do animal experimental. Transfira o animal para a plataforma do microtomógrafo por TC e use um fio preso a um pino para puxar suavemente os dentes incisivos superiores, alinhando o pescoço.

Cinco minutos após a injeção das nanopartículas de ouro, inicie a aquisição de imagens. Para visualizar o trombo por imagem ex vivo na faixa do infravermelho próximo, posicione o tecido cerebral ressecado no equipamento de imagem com a base voltada para cima. Obtenha imagens dos tromboembolos marcados com fluoróforo nas artérias do círculo de Willis.

Em seguida, posicione o tecido com o vértice voltado para cima e visualize os tromboembolismos corticais. Hidrate o tecido com algumas gotas de solução salina e, utilizando o dispositivo de matriz cerebral de acordo com as instruções do fabricante, obtenha rapidamente seis fatias coronais do cérebro com dois milímetros de espessura. Mantendo as fatias hidratadas com solução salina, obtenha imagens adicionais no infravermelho próximo de ambas as superfícies, frontal e posterior, das seções.

Para quantificar a área do trombo após a imagem de micro-TC, abra os arquivos de sequência de imagens e selecione Imagem seguido por Tipo seguido por 8 bits para converter as imagens em escala de cinza de 8 bits. Quando um pixel dos arquivos de imagem de TC corresponde a 0,053 milímetros, use Analisar Definir Escala para inserir um, 0,053 e milímetros para Distância em pixels, Distância conhecida e Unidade de comprimento, respectivamente. Em seguida, em Editar, escolha Seleção seguido por Especificar para colocar uma região de interesse em uma área do parênquima cerebral sem região hiperdensa relacionada a trombo ou osso.

Como a região de interesse especificada se aplica a todas as fatias da pilha, confirme que a região não se sobrepõe a uma região hiperdensa em nenhuma das fatias. Em seguida, em Plugin, selecione Região de Interesse e Subtração de Fundo na Região de Interesse e insira dois para o Número de desvios padrão da média. Localize lesões hiperdensas relacionadas a tromboembolias e aumente o zoom na área lesional.

Agora, escolha Imagem seguida de Ajustar e Limiar, e insira um Nível de Limiar Inferior de 22 e um Nível de Limiar Superior de 255. Selecione Sobre/Abaixo para exibir os pixels abaixo do valor do limiar inferior em azul, os pixels limiarizados em escala de cinza e os pixels acima do valor do limiar superior em verde. Em seguida, utilize a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar regiões de interesse ao redor das lesões hiperdensas relacionadas aos tromboembolismos, sem incluir áreas ósseas.

Utilize Análise, Definir Medidas para escolher Área, Valor Médio de Cinza e Densidade Integrada (área vezes a média). Marque as seguintes opções: Limitar ao Limiar e Exibir Rótulo. Utilize Análise Medir para obter os dados quantificados, depois salve os resultados.

Essas imagens de micro-TC de referência foram obtidas in vivo cinco minutos após a injeção de nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina, uma hora após acidente vascular cerebral embólico em camundongos. O trombo cerebral pode ser claramente visualizado na região da bifurcação da artéria cerebral média com a artéria cerebral anterior da artéria carótida interna distal. As imagens de micro-TC de acompanhamento demonstram ausência de alterações no trombo do círculo de Willis nos animais tratados com solução salina; no entanto, nos animais tratados com ativador tecidual do plasminogênio, observa-se uma dissolução progressiva do trombo do círculo de Willis ao longo do tempo, indicada pelas cabeças de seta azuis.

Existe uma forte correlação entre a densidade no CT in vivo e a imagem ex vivo na faixa do infravermelho próximo para tromboembolias residuais em 24 horas. Por exemplo, nessas imagens, as áreas hiperdensas na micro-TC, visualizadas por partículas de ouro direcionadas ao fibrinogênio, correspondem diretamente às áreas de sinal no infravermelho próximo identificadas pelo sonda fluorescente sensível à atividade de reticulação do fator de coagulação 13A mediada pelo fibrina, que se liga ao trombo durante o processo de maturação do coágulo pré-formado. Além disso, conforme visualizado nessas imagens, a coloração com TTC pode ser utilizada para avaliar os efeitos da trombólise no dano cerebral isquêmico em animais tratados com solução salina controle comparados àqueles tratados com ativador do plasminogênio tecidual.

Uma vez dominada, esta técnica de imagem micro-TC in vivo e imagem fluorescente no infravermelho próximo de trombos ex vivo pode ser realizada em cerca de uma hora, se for executada corretamente e quando as sondas de imagem estiverem disponíveis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de usar nanopartículas de ouro não agregadas e direcionadas à fibrina para a imagem direta de trombos cerebrais baseada em micro-TC. Após este procedimento, outros métodos, como microscopia eletrônica ou ICPMS, que é espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como distribuição tecidual e cinética sanguínea das nanopartículas de ouro.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de acidente vascular cerebral ou pesquisa cardiovascular explorarem o tromboembolismo em modelos animais predispostos à trombose coronariana ou à infarto cerebral embólico. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir coágulos marcados com fluorescência para acidente vascular cerebral tromboembólico em camundongos e realizar imagens seriadas e quantificação de tromboembolias cerebrais in vivo e posteriormente ex vivo, permitindo assim o monitoramento da evolução do trombo.