Combinada Near-infrared imagens fluorescentes e tomografia Micro-computado para Diretamente Visualizando Cerebral tromboêmbolos

O objetivo geral desta técnica de imagem direta de trombo é visualizar quantitativamente tromboêmbolos cerebrais marcados com fluorescência in vivo e ex vivo, usando nanopartículas de ouro, tomografia computadorizada e imagens fluorescentes de infravermelho próximo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da hemostasia e trombose, como tempo ou dose dependente e resposta ortopédica grave de tromboêmbolos cerebrais ao ativador de plasminogênio tecidual ou novos agentes trombolíticos sob investigação. A principal vantagem dessa técnica é que, após a injeção intravenosa de nanopartículas de ouro, a micro-TC de alta resolução permite capturar a evolução dinâmica dos tromboêmbolos cerebrais, visualizando suas localizações e carga quantitativamente in vivo e corroborada por imagens de trombo fluorescente no infravermelho próximo ex vivo.

A demonstração do procedimento será feita por Jeong-Yeon Kim, que é pós-doutoranda do meu laboratório. Depois de coletar 300 a 1.000 microlitros de sangue arterial por punção cardíaca, adicione 70 microlitros da amostra a 30 microlitros do fator de coagulação ativado apropriado, 13 sonda fluorescente sensível à atividade de reticulação de fibrina mediada e carregue uma seringa de três mililitros, equipada com uma agulha de calibre 23, com a mistura resultante. Em seguida, injete o sangue marcado em um tubo de polietileno de 20 centímetros de comprimento e deixe o sangue coagular à temperatura ambiente.

Após duas horas, transfira o tubo para quatro graus Celsius por 22 horas e, em seguida, corte o tubo em pedaços de 1,5 centímetro. Usando uma seringa de três mililitros cheia de PBS, expulse o trombo de cada pedaço de tubo para poços individuais de uma placa de seis poços contendo PBS. Lave os trombos três vezes com PBS, em seguida, insira uma seringa de um mililitro cheia de solução salina equipada com uma agulha de calibre 30 em uma extremidade do tubo PE10 de 15 centímetros e puxe cuidadosamente um único trombo lavado na extremidade oposta do tubo.

Em seguida, conecte o tubo PE10 carregado com trombo com um tubo PE50 de três centímetros de comprimento com extremidade cônica de 200 mícrons de diâmetro. Após confirmar a anestesia por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, desinfete a área cirúrgica com Betadine e álcool 70% e use um bisturi para fazer uma incisão vertical de um centímetro entre a orelha esquerda e o olho. Cole a extremidade distal da fibra óptica de um medidor de fluxo Doppler a laser na superfície exposta do osso temporal esquerdo, um milímetro à esquerda e quatro milímetros abaixo do bregma e inicie o monitoramento Doppler.

Em seguida, faça uma incisão vertical na linha média de três centímetros através dos tecidos moles perivasculares para expor a área do bulbo carotídeo esquerdo. Usando uma sutura estéril de seda preta 6-0, ligue a artéria carótida comum proximal esquerda, seguida pela ligadura da artéria carótida interna esquerda e da artéria pterigopalatina esquerda com suturas estéreis de seda preta 7-0. Usando um cautério elétrico monopolar, cauterize a artéria tireóidea superior esquerda e, em seguida, use suturas estéreis de seda preta 7-0 para ligar frouxamente a artéria carótida externa proximal esquerda e ligar firmemente a extremidade distal do vaso.

Use uma microtesoura para fazer um orifício de 0,2 a 0,25 mícron entre os locais ligados da artéria carótida externa e insira o cateter contendo trombo no orifício enquanto afrouxa a ligadura proximal da artéria carótida externa. Avance o cateter na artéria carótida comum para prender o cateter no lugar e reapertar a ligadura proximal da artéria carótida externa. Corte a extremidade distal da artéria carótida externa por cauterização e gire a extremidade proximal livre da artéria carótida externa no sentido horário para alinhar o vaso com a artéria carótida interna enquanto retira o cateter.

Em seguida, afrouxe a ligadura da artéria carótida interna e avance imediatamente o cateter cerca de nove milímetros na bifurcação da artéria cerebral anterior média. Agora, reaperte a sutura da artéria carótida interna ao redor do cateter e pressione suavemente a seringa para injetar o trombo na área de bifurcação. Se um fluxo sanguíneo maior ou igual a 30% menor que a linha de base for observado no Doppler, remova o cateter e ligue imediatamente a extremidade proximal da artéria carótida externa.

Para obter imagens do trombo por tomografia de microcomputador no ponto de tempo experimental apropriado, dilua as nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina a uma concentração de PBS de 10 miligramas por mililitro de 10 milimolares e sonice o agente de imagem do trombo por 30 minutos para garantir a suspensão homogênea das nanopartículas. Em seguida, injete 300 microlitros das partículas direcionadas à fibrina na veia peniana do animal experimental. Transfira o animal para a cama do gerador de imagens micro-CT e use um barbante preso a um pino para puxar suavemente os dentes frontais superiores para endireitar o pescoço.

Cinco minutos após a injeção das nanopartículas de ouro, começa a imagem. Para visualizar o trombo por imagens ex vivo de infravermelho próximo, coloque o tecido cerebral excisado no gerador de imagens com a base apontando para cima. Obtenha imagens dos tromboêmbolos marcados com fluorescência nas artérias do círculo de Willis.

Em seguida, posicione o tecido com o vértice apontando para cima e visualize os tromboêmbolos corticais. Hidrate o tecido com algumas gotas de solução salina e, em seguida, usando o dispositivo de matriz cerebral de acordo com as instruções do fabricante, obtenha rapidamente seis fatias cerebrais coronais de dois milímetros de espessura. Mantendo as fatias hidratadas com solução salina, obtenha imagens adicionais de infravermelho próximo das superfícies frontal e traseira das seções.

Para quantificar a área do trombo após a imagem de micro-CT, abra os arquivos de sequência de imagem e selecione Imagem seguida de Tipo seguido de 8 bits para converter as imagens em escala de cinza de 8 bits. Quando um pixel de arquivos de imagem de TC corresponder a 0,053 milímetros, use Analisar Escala de conjunto para inserir um, 0,053 e milímetros para Distância em pixels, Distância conhecida e Unidade de comprimento, respectivamente. Em seguida, em Editar, escolha Seleção seguido de Especificar para colocar uma região de interesse em uma área do parênquima cerebral sem trombo ou região hiperdensa relacionada ao osso.

Como a região de interesse especificada se aplica a cada fatia da pilha, confirme se a região não se sobrepõe a uma região hiperdensa em nenhuma das fatias. Em seguida, em Plug-in, selecione Região de interesse e Subtração de fundo da região de interesse e insira dois para o Número de desvios padrão da média. Encontre lesões hiperdensas relacionadas a tromboembolias e amplie a área lesional.

Agora, escolha Imagem seguido de Ajustar e Limite e insira um Nível de Limite Inferior de 22 e um Nível de Limite Superior de 255. Selecione Acima/Abaixo para exibir os pixels abaixo do valor de limite inferior em azul, os pixels com limite em escala de cinza e os pixels acima do valor de limite superior em verde. Em seguida, use a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar regiões de interesse ao redor das lesões hiperdensas relacionadas a tromboêmbolos sem áreas ósseas.

Use Analisar, Definir Medidas para escolher Área, Valor médio de cinza e Área de densidade integrada vezes média. Marque as opções a seguir, Limitar ao limite e Exibir rótulo. Use Analisar Medida para obter os dados quantificados e salve os resultados.

Essas imagens de micro-CT de linha de base foram obtidas in vivo cinco minutos após a injeção de nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina uma hora após o AVC embólico em camundongos. O trombo cerebral pode ser claramente visualizado na área de bifurcação da artéria cerebral anterior média da artéria carótida interna distal. As imagens de micro-TC de acompanhamento não demonstram alterações no círculo do trombo de Willis nos animais tratados com solução salina, no entanto, os animais tratados com ativador de plasminogênio tecidual exibem uma dissolução gradual do círculo do trombo de Willis ao longo do tempo, indicada pelas pontas das setas azuis.

Existe uma forte correlação entre a densidade da TC in vivo e a imagem ex vivo no infravermelho próximo para tromboembolia residual em 24 horas. Por exemplo, nessas imagens, as áreas hiperdensas de micro-CT, visualizadas pela fibrina direcionada a partículas de ouro, correspondem diretamente às áreas de sinal infravermelho próximo identificadas pela sonda fluorescente sensível à atividade de reticulação de fibrina mediada pelo fator de coagulação 13A que se liga ao trombo durante o processo de maturação do coágulo pré-formado. Além disso, conforme visualizado nessas imagens, a coloração TTC pode ser usada para avaliar os efeitos da trombólise no dano cerebral isquêmico em solução salina de controle em comparação com animais tratados com ativador de plasminogênio tecidual.

Uma vez dominada, esta técnica para a imagem de micro-CT in vivo e imagem de trombo fluorescente de infravermelho próximo ex vivo pode ser feita em cerca de uma hora se for realizada corretamente e quando as sondas de imagem estiverem disponíveis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar nanopartículas de ouro não agregadas e direcionadas à fibrina para imagens diretas de trombo cerebral baseadas em micro-CT. Após este procedimento, outros métodos como microscopia eletrônica ou ICPMS, que é espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como distribuição de tecidos e cinética sanguínea de nanopartículas de ouro.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do acidente vascular cerebral ou pesquisa cardiovascular explorarem o tromboembolismo em modelos animais que estavam dentro de trombose coronária ou infração cerebral embólica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer coágulos marcados com fluorescência para AVC tromboembólico em camundongos e realizar imagens seriadas e quantificação de tromboêmbolos cerebrais in vivo e depois ex vivo, monitorando assim a evolução do trombo.