Name: Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Aprenda a imagem volumétrica de células marcadas com proteínas fluorescentes em corações intactos de embriões e pós-natais. Este método de clareamento tecidual permite visualização em resolução de célula única para estudar funções gênicas no desenvolvimento cardíaco.

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Agradecemos aos membros do laboratório MW pela discussão científica. Este trabalho é apoiado pela AHA [13SDG16920099] para MW, e pelas doações do National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] para MW As imagens foram capturadas no Imaging Core Facility do Albany Medical College.

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC), em Albany Medical College e realizada de acordo com o Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. 1. Preparações Solução NOTA: O Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato foram adquiridos comercialmente cTnT-Cre 18 foi um presente do Dr. Jiao na Universidade do Alabama NFATc1-Cre.. foi um presente do Dr. Bin Zhou no Albert Einstein College of Medicine 19. Os ratinhos foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono em uma câmara fechada durante pelo menos 60 segundos, seguido por meios físicos de verificação morte por toracotomia bilateral, decapitação ou deslocamento cervical. <ol><li> Prepare Tamoxifeno. Dissolve-se 10 mg de Tamoxifeno em 10 ml de semente de girassol oieu. Uma vez que esteja completamente dissolvido, alíquota e armazenar a -20 ° C. </li><li> Preparar solução salina tamponada com fosfato (PBS). Dissolve-se Na 2 HPO 4 (1,41960 g), KH 2 PO 4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20129 g) em 1 L de água destilada e ajustar o pH para 7,4. </li><li> Prepare PBST: 0,1% de Tween-20 em PBS solução por dissolução de 100 ul de Tween-20 em 100 ml de PBS. </li><li> Preparar tampão de bloqueio. Adicione 3% de albumina de soro bovino a solução de bloqueio (BSA) por dissolução de 3 g de BSA em 100 mL de PBST contendo 0,2% de Tween-20. </li><li> Prepare CUBIC-1 (reagente 1). Misturar 25% em peso de ureia, 25% em peso de N, N, N &#39;, N&#39;-tetraquis (2-hidroxipropil) etilenodiamina e 15% em peso de Triton X-100 em dH2O </li><li> Prepare CUBIC-2 (reagente 2). Misturar 50% em peso de sacarose, 25% em peso de ureia, 10% em peso de 2, 2 &#39;, 2&#39; &#39;- nitrilotriethanol e 0,1% (v / v) de Triton X-100 em dH2O </li><li> Prepare Sca le A2: 4 M de ureia, 10% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH 2 O. Ajustar o pH para 7,7. </li><li> Prepare Sca le B4: ureia 8M e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O Ajustar o pH para 8,7. </li><li> Prepare Sca le 70: 4 M ureia, 70% w / v de glicerol e 0,1% w / v de Triton X-100 em dH2O </li></ol> 2. O tamoxifeno indução, isolamento de embriões e Fixação <ol><li> Tamoxifeno Indução e isolamento de embriões <ol><li> Usando um protocolo tubo de alimentação curva aprovado (ACUP 13-12007), sonda as fêmeas ratos R26Cre ERT2 Confetti (conectado por camundongos machos R26Cre ERT2) com 10 ug / g de Tamoxifen em embrionária dia de desenvolvimento E7.75 33. No dia embrionário 9,5 (E9.5) ou E10.5, eutanásia os ratos do sexo feminino com CO 2 e deslocamento cervical. </li><li> Após a verificação da morte do rato (ver secção 1 Nota), abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura e dissecar o corno uterino, remover as camadas de tubo uterino com a ajuda de tesouras e pinças, e relocar os embriões do 23,24 tuba uterina. <ol><li> Transferir os embriões para uma placa de Petri contendo PBS (pH 7,4). Sob o microscópio de dissecação, remover as camadas não-embrionárias (córion, saco vitelino e âmnio) com a ajuda da pinça. </li></ol></li><li> Com uma pinça e tesouras, recolher as amostras de mulheres do rato e da cauda do embrião para genotipagem conforme relatado anteriormente 22. Usando uma pipeta de plástico, transferir cada embrião para um poço de uma placa de 48 contendo 1 ml de PBS 1x. </li><li> Sob um microscópio de fluorescência, identificar os embriões / RFP / PCP positivas GFP por meio de um microscópio invertido com uma câmara. Descascar o pericárdio, usando uma pinça e gire o coração / embrião com a ajuda de pinças curvas para determinar o número de clones fluorescentes em ambos os lados do coração com os filtros GFP / RFP / CFP. Sem cortes são necessários. </li></ol></li><li> Depois de identificar GFP / RFP / embriões PCP positivos, lavar rapidamente os embriões duas vezes (2 min cada) com 1x PBS em the 48 bem-placa num agitador de placas à temperatura ambiente (TA). Isto irá remover o excesso de sangue. </li><li> Corrigir o coração do embrião / embrionário usando 4% de paraformaldeído (PFA) a TA. O tempo de fixação depende da idade e tamanho do tecido embrionário. Para corrigir o embrião E9.5 durante 2 h à TA. Os embriões estágio embrionário final exigem mais tempo de fixação, que pode até mesmo ser prolongada até 24 horas para o coração pós-natal. CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico, evitar o contacto com a pele, olhos e mucosas. </li><li> Após a fixação, lavar o embrião / coração no poço de placa 48 por duas vezes (10 minutos cada) com PBS 1x num agitador de placas à TA. Isto remove o excesso de PFA a partir do embrião / coração. Os embriões são então processadas para toda coloração montagem e desobstrução dos tecidos. </li></ol> 3. Whole Mount Coloração NOTA: Depois de PFA fixação do embrião / coração é submetido a toda a coloração de montagem como segue. <ol><li> Permeabilizar o embrião / coração em um bem-placa de 48 usando 1 ml de PBST 0,1% durante 2 horas num agitador de placas à TA. </li><li> Seguindo permeabilização, mergulhe o embrião / coração em 1 ml de tampão de bloqueio, por 2 horas ou durante a noite num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Mergulha-se o embrião / coração ao endotelial PECAM anticorpo específico da célula (CD31), diluído (1: 100) em 0,3 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Lave o embrião / coração utilizando PBST 5 vezes, 30 minutos cada à temperatura ambiente num agitador de placas. Isto remove o excesso de anticorpo primário não ligado específico do tecido. </li><li> Mergulha-se o embrião / coração em anticorpo secundário anti-rato de cabra Alexa Fluor 647, diluído (1: 1000) em 1 ml de tampão de bloqueio durante 48 horas num agitador de placas a 4 ºC. </li><li> Repetir o passo 3.4 para lavar o anticorpo secundário. </li><li> Pós-fixar o embrião / coração com 4% de PFA durante 1 h à TA num agitador de placas e lava-se duas vezes com PBS, 5 minutos cada. </li><li> Coloração do embrião / coração com o corante nuclear 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (diluído em PBST a uma concentração de 0,01 mg / mL) durante 10 min num agitador de placas à TA. Siga com duas lavagens com PBS de 5 minutos cada. </li></ol> 4. Embrião / Clearing coração com Sca l e ou Método CUBIC NOTA: Depois de toda coloração montagem, o embrião / coração é submetido tanto ao Sca le ou método de compensação cúbica de tecido. A escolha do método depende do tamanho e idade do tecido embrionário. Para E11.5 ou embriões idade mais precoce, o uso Sca l e método de limpeza de tecidos, enquanto que para embriões mais velhos ou corações pós-natal é preferido o método de compensação cúbica de tecido. <ol><li> Escala de tecidos Método Clearing <ol><li> Incubar o embrião / coração com 1 ml de Sca l solução de e A2 em um frasco de cintilação (embrulhadas em papel de alumínio) com ocasionais agitação suave (à mão) durante 48 horas a 4 ° C. </li><li> Após a incubação Sca l e A2, incubar o embrião / coração com 1 mL de Sca l solução de e B4 a 4 ° C no mesmo frasco com agitação suave ocasional para anot-lhe 48 h. </li><li> Incubar o embrião / coração durante mais 48 h com 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C com agitação suave ocasional. Mount embrião usando 90% de glicerol (ver secção 5.1). </li></ol></li><li> Cúbica de tecido Método Clearing <ol><li> Para toda embrião / coração compensação cúbicos, mergulhe cada embrião / coração em 1 ml de CUBIC-1 com ocasional agitação suave durante 48 horas a 37 ºC 7. Após 48 horas, substitui a solução com o mesmo volume de reagente fresco CUBIC 1, e incuba-se a amostra para uma 48 horas adicionais a 37 ° C com agitação ocasional com a mão. </li><li> Lavar a cúbica-1 tratados coração / embrião com 1x PBS várias vezes à temperatura ambiente com agitação suave com a mão. Isso remove o excesso de solução CUBIC-1. </li><li> Depois de lavar a CUBIC-1 com PBS, mergulhar os embriões / corações em CUBIC-2 solução (1 g por embrião / coração) por 48 horas a 37 ºC com agitação ocasional gentil com a mão. Isto segue de montagem usando glicerol embrião / coração (ver secção 50,2). </li></ol></li></ol> 5. Montagem Sample and Imaging NOTA: Os embriões desmatadas ou órgãos em Sca l e 70 ou cúbica-2 solução pode ser trabalhada diretamente com Escala 70 e cúbicas-2 solução como o meio de imagem, respectivamente. No entanto, considerando a vulnerabilidade das amostras embrionárias para reagentes de compensação, se as amostras não são imediatamente ser trabalhada, mas armazenada a longo prazo, armazenar as amostras em glicerol a 90%, seguindo o protocolo abaixo. <ol><li> Diretamente mergulhe o Sca le apuradas amostra em 1 ml de 90% de glicerol e armazenar a 4 ° C até imagiologia. </li><li> Lava-se a amostra tratada cúbicos com 1x PBS, duas vezes, 5 min cada e sequencialmente incubar a amostra com 1 ml de 30%, 50%, 70% e solução de glicerol a 90% durante 30 min cada. </li><li> Para imagiologia, transferir a amostra para uma placa de Petri de vidro de fundo com uma quantidade mínima de 90% de glicerol e imagem clones com um microscópio confocal equipado com duas capacidades de fotões. </li><li> Imagem do coração ou embrião no glicerol com um / 0.3 NA 10X, um 25X / 0.8 NA imersão, ou uma lente objetiva de corretiva 40X / 1.2 NA água. Imagem DAPI usando 2-fótons de excitação de um titânio coerente: a laser camaleão safira. A escolha do microscópio e a lente objectiva dependerá da finalidade das experiências, por exemplo, para super-resolução, um microscópio de fluorescência folha de luz poderia ser utilizado. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

O isolamento de embriões é um passo muito crítica. embriões E9.5 são muito frágeis e pequeno em tamanho, por isso o cuidado extra deve ser tomado para não danificar as estruturas do embrião / coração durante o isolamento. As camadas extras não-embrionárias que envolvem o embrião / cardíaca devem ser cuidadosamente removidos especialmente quando imagiologia todo o embrião. Isto permite a penetração de anticorpos e de compensação mistura profunda dentro dos tecidos embrionários, e também ajuda na remoção do sinal de fundo...

Morfogénese cardíaca é um evento sequencial requer que a organização espaço-temporal de quatro tipos diferentes de células progenitoras cardíacas em sectores distintos do coração, e também requer múltiplas redes reguladoras genéticos para orquestrar este processo de modo a formar a 1,2 coração funcional. Especificação, diferenciação, padronização, e maturação das câmaras cardíacas são regulados por fatores de transcrição cardiogênicos 3. Mutação genética ou aberração pós-transcricional desses fatores em células progenitoras cardíacas pode resultar em qualquer letalidade embrionária ou cardiopatias congênitas (CC) 4. O estudo da morfogênese cardíaca requer uma compreensão de detalhes inerentes estruturais em três dimensões (3D) e linhagem de células progenitoras cardíacas simples marcado com traçado durante o desenvolvimento cardíaco irá promover o entendimento da morfogênese cardíaca. Um número de métodos de tomografia secção base de alta resolução foram desenvolvidos no the passado poucas décadas a imagem Estrutura de órgãos 5,6; No entanto, estes métodos requerem, instrumentos especializados caros, mão de obra extensa, e carecem de organização estrutural detalhada em resolução de uma única célula na volumétrica final, reconstruído imagem 7,8. Imagiologia volumétrica 3D ao nível da célula individual fornece um meio para estudar diferenciação de células progenitoras e o comportamento celular in vivo 7. No entanto, espalhamento de luz tecido permanece o principal obstáculo para imagiologia células e estruturas em 3D profundamente dentro do coração intacto. Lipídios são uma importante fonte de dispersão de luz, ea remoção de lípidos e / ou ajuste da diferença do índice de refração entre lipídios e seus arredores são abordagens potenciais para aumentar a transparência do tecido 8. Nos últimos anos, um número de métodos de limpeza de tecido foram desenvolvidos, que reduzir a opacidade do tecido e dispersão de luz, como BABB (álcool de benzilo e benzilo benzoate mistura) e DBE (tetra-hidrofurano e dibenzylether); mas nestes métodos, extinção de fluorescência permanece um problema 8-10. O solvente baseado métodos hidrofílicos, tais como SeeDB (frutose / tioglicerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), preservar sinais fluorescentes, mas não tornem todo o órgão transparente 7,8,11. Em comparação, o método tecido desobstrução-Clareza torna o órgão transparente, mas exige um dispositivo de electroforese especializada para remover os lípidos 8,12, assim como Pact (técnica passiva clareza), que também requer a incorporação de hidrogel 7,13. Para informações detalhadas sobre todos os métodos de remoção de tecidos disponíveis, consulte a Tabela 1 em Richardson e Lichtman, et al. 7. Em 2011, Hama et al. Serendipitously descobriu uma mistura hidrofílica &#39;Sca le&#39; (uréia, glicerol e Triton mistura X-100), que torna o cérebro do rato e transpar embriãoent completamente, preservando sinais fluorescentes a partir de clones marcados 14. Isto permite a formação de imagens do cérebro intacto a uma profundidade de vários milímetros e reconstrução em grande escala de populações neuronais e as projecções com uma resolução subcelular. Susaki et ai. melhorada Sca le adicionando aminoálcoois e desenvolveu o (e desobstruídas cocktails claras de imagem cerebral e análise computacional) &#39;CÚBICAS &quot;método de compensação do tecido, o que aumentou a solubilização fosfolipídios, reduziu o tempo de compensação, e permitiu multicolor fluorescente imaging 8. No presente estudo, aproveitando a Sca le e técnicas de limpeza cúbica de tecido e alta resolução seccionamento óptico 3D, clones individuais dentro do coração durante cardiogenesis foram rastreados usando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, </strong&gt; NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linhas de rato. A combinação do método de coloração de montagem inteira (WMS) desenvolvido anteriormente 21,22 com métodos de compensação de tecido mais permitidos para a coloração de outras proteínas em clones marcados e para o estudo do seu comportamento em um contexto volumétrica 3D. A combinação de tecido e de compensação WMS permite uma melhor compreensão dos papéis dos diferentes genes e proteínas durante o desenvolvimento cardíaco, e a etiologia de defeitos cardíacos. Este protocolo pode ser aplicado para estudar diferenciação de células progenitoras outro, o comportamento celular, e morfogénese eventos órgão durante o desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>2,2&prime;,2&prime; '-nitrilotrietanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído em PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis(2-hidroxipropil) etilenodiamina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Fosfato Salino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Uréia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Óleo de semente de girassol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI coloração nuclear</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC Incubadora</td><td>Termocientífica Fischer</td><td>Heratherm, Incubadoras Microbiológicas Compactas</td><td></td></tr><tr><td>48 placas de poços</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscópio</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510 microscópio</td><td></td>confocal</tr><tr><td>Microscópio de Dissecação</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Esterilizador de</td> Contas de Vidro Z1 <td></td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de Luz</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Par de Tesouras Ferramentas de</td><td>Ciência Fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&nbsp; Plataforma Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cintilantes</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

imagiologia cleared embrionário e pós-natal corações na resolução de célula única

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

rastreamento clonal único e análise ao nível de todo o coração pode determinar o comportamento de células progenitoras cardíacas e diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco e permitir o estudo das bases celulares e moleculares da morfogênese cardíaca normal e anormal. tecnologias emergentes recentes de análises clonais individuais retrospectivos tornar o estudo da morfogênese cardíaca em resolução única célula viável. No entanto, a opacidade dos tecidos e espalhamento de luz do coração como a profundidade da imagem é aumentada dificultar imagem de todo o coração a uma resolução de uma única célula. Para superar esses obstáculos, um sistema de compensação de todo o embrião, que pode tornar o coração altamente transparentes para iluminação e detecção deve ser desenvolvida. Felizmente, nos últimos anos, muitas metodologias para sistemas de compensação de todo o organismo, tais como clareza, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cúbico, DBE, BABB e PACT foram relatados. Este laboratório está interessado nos mecanismos celulares e moleculares de cartãomorfogênese iac. Recentemente, estabelecemos única linhagem de células de rastreamento via ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti às células rótulo escassamente durante o desenvolvimento cardíaco. Nós adaptada várias metodologias de remoção de embriões inteiros, incluindo Sca le e cúbicos (, coquetéis de imagem cerebral claras desobstruídas e análise computacional) para limpar o embrião em combinação com toda a coloração de montagem a imagem clones individuais dentro do coração. O coração foi fotografada com sucesso na resolução de uma única célula. Descobrimos que Sca le pode limpar o coração embrionário, mas não podem efectivamente limpar o coração pós-natal, enquanto cúbico pode limpar o coração pós-natal, mas danifica o coração embrionário por dissolução do tecido. Os métodos descritos aqui irão permitir o estudo da função dos genes em um único clone de resolução durante a morfogénese cardíaca, o que, por sua vez, pode revelar a base molecular e celular de defeitos cardíacos.

Imaging o coração embrionário apuradas Formação do coração dos vertebrados é um processo morphogenic espaço-temporalmente regulados e depende da organização e diferenciação de células progenitoras de quatro fontes diferentes 1. As células a partir do primeiro campo do coração do crescente cardíaca irá dobrar para a linha mediana ventral, para formar um tubo cardíaco linear. As células a partir do segundo campo do co...

Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente localizadas em corações intactos, a fim de estudar a função gênica com resolução de única célula durante o desenvolvimento cardíaco e em corações pós-natais. Este método pode auxiliar a responder perguntas fundamentais durante o desenvolvimento cardíaco, como o estudo das funções gênicas e a obtenção de imagens com resolução de única célula durante o desenvolvimento cardíaco e artefatos animais. A principal vantagem deste método é que ele é relativamente simples, econômico e vantajoso no sentido de permitir análises temporais especiais das funções gênicas e proteicas com resolução de única célula em embriões ou corações intactos.Embora utilizemos este sistema para estudar o desenvolvimento cardíaco em camundongos, você também pode usá-lo para estudar outros sistemas orgânicos, como músculos, cérebro e pulmões, bem como em outros organismos modelo. Aqui, são utilizados embriões positivos para proteína fluorescente provenientes de fêmeas R-26 Cre-RET2 confetti tratadas com Tamoxifeno. Inicie a coloração imergindo cada embrião fixado com paraformaldeído em um mililitro de PBST 0,1% nas cavidades de uma placa de 48 poços.Incube por duas horas em um agitador de placa à temperatura ambiente para permeabilizar o tecido. Em seguida, substitua a solução de permeabilização por um mL de tampão bloqueador e incube, sob agitação, por duas horas à temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus celsius. A seguir, prepare uma diluição de um para 100 do anticorpo específico para células endoteliais, PECAM, em 0,3 mililitros de tampão bloqueador para cada poço e adicione esta solução aos poços contendo os embriões.Incube por 48 horas com agitação a quatro graus celsius. Após a incubação, lave os embriões cinco vezes com PBST, durante 30 minutos cada vez, para remover o excesso de anticorpo primário do tecido. Em seguida, imerja os embriões na solução de anticorpo secundário de cabra antivat marcado com Alexa Fluor 647 e incube com agitação por 48 horas a quatro graus celsius, protegido da luz.48 horas depois, após lavar previamente, pós-fixe os embriões com PFA 4% durante uma hora à temperatura ambiente com agitação. Em seguida, após duas lavagens com PBS de cinco minutos cada, incube os embriões com o corante nuclear DAPI por dez minutos. Prossiga com duas lavagens com PBS de cinco minutos cada, e então avance para a clareza do tecido.A clareza do tecido é a etapa mais crítica deste protocolo para obter imagens do coração com resolução de única célula. Além disso, a escolha do método de clareza, seja scale ou CUBIC, é igualmente importante para preservar os sinais fluorescentes no coração embrionário intacto. Transfira os embriões lavados e corados para um frasco de cintilação envolto em folha de alumínio, contendo um mililitro de solução scale A2.Incubar a quatro graus Celsius com agitação suave ocasional à mão por 48 horas. Após a incubação com a solução A2, substituir a solução no frasco por um mililitro de solução B4 e incubar a quatro graus Celsius com agitação suave ocasional por mais 48 horas. Incubar os embriões por mais 48 horas com um mililitro da solução 70 a quatro graus Celsius com agitação suave ocasional, como antes.Por fim, imergir a amostra clareada na escala em um mililitro de glicerol a 90% e armazenar a quatro graus Celsius até a obtenção das imagens. Para a aquisição de imagens, transferir a amostra para uma placa de Petri com fundo de vidro contendo uma quantidade mínima de glicerol a 90% e realizar a imagem com um microscópio confocal equipado com capacidades de dois fótons. Para o clareamento CUBIC, imergir cada embrião em um mililitro de CUBIC um com agitação suave ocasional por 48 horas a 37 graus Celsius.Após 48 horas, substitua a solução pelo mesmo volume de reagente CUBIC um fresco e incube a amostra por mais 48 horas, como anteriormente. Após a incubação, lave os embriões tratados com CUBIC um com PBS várias vezes, agitando suavemente à mão, para remover o excesso de solução de CUBIC um. Em seguida, imerja os embriões na solução CUBIC dois por 48 horas a 37 graus celsius, com agitação suave ocasional à mão.Se houver um atraso antes da aquisição de imagens, incubar sequencialmente as amostras com um mililitro de glicerol a 30%–50% e 70% em PBS por 30 minutos cada. Após a passagem pela série, transferir para uma solução de glicerol a 90% para armazenamento a quatro graus Celsius. Quando estiver pronto, realizar a aquisição de imagens em uma placa de Petri com fundo de vidro contendo glicerol a 90%, como anteriormente.Este vídeo mostra seções ópticas de um coração tratado com escala de E 8,75, da superfície cardíaca até a luz. O amarelo marca a expressão de PECAM e todos os cardiomiócitos aparecem verdes. A profundidade é de 110,4 mícrons e há um total de 93 cortes.Esta é a imagem tridimensional da superfície do coração reconstruído mostrado anteriormente. Novamente, a cor amarela marca a expressão de PECAM, e a verde identifica todos os cardiomiócitos. Este vídeo mostra seções de um único clone progenitor de um coração tratado com escala no estágio E 9,5, na região do trato de saída.Amarelo marca a expressão de PECAM e o clone aparece verde. A profundidade é de 36 mícrons e há 10 cortes no total. Este filme mostra seções de um coração P dois tratado com CUBIC, da superfície até a luz.A profundidade é de 130 mícrons com três mícrons por corte. Este vídeo mostra cortes de um coração E17,5 tratado com CUBIC, da superfície até a luz. A profundidade é de 630 mícrons com seis mícrons por corte.Esta é uma imagem tridimensional da superfície do coração mostrada anteriormente, reconstruída por meio do software de reconstrução 3D. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o embrião é frágil e que a patologia cardíaca pode ser facilmente perturbada. Após este procedimento, outras proteínas podem ser analisadas, utilizando coloração para estudar a função gênica em um estágio pós-implantação e posterior.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Mutações que levam a defeitos cardíacos congênitos se beneficiam da investigação in vivo da estrutura cardíaca durante o desenvolvimento, mas estudos estruturais de alta resolução no coração embrionário de camundongos são tecnicamente desafiadores. Aqui apresentamos um método robusto de imunofluorescência e análise de imagem para avaliar estruturas específicas de cardiomiócitos no coração de camundongo em desenvolvimento.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Apresenta-se um protocolo para a análise dos vasos coronários em corações inteiros de murino embrionárias até E15.5, utilizando métodos de coloração imunológicas convencionais seguido pela depuração da óptica e microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização dos vasos sanguíneos ao longo de todo o coração, sem a necessidade de uma análise demorada de secções seriadas.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular em cardiomiócitos, apresentamos protocolos usando duas linhagens de camundongos transgênicos: camundongos transgênicos Myh6-H2B-mCh, para a identificação inequívoca de núcleos de cardiomiócitos, e camundongos CAG-eGFP-anilina, para distinguir a divisão celular das variações do ciclo celular.

Visualização de Variações do ciclo celular e Determinação de Nucleação no pós-natais Cardiomyocytes

Aqui, descrevemos um protocolo para toda montagem imunofluorescência e baseados em imagem volumétrica análise quantitativa de embriões adiantados de rato de palco. Apresentamos esta técnica como uma poderosa abordagem qualitativa e quantitativamente avaliar estruturas cardíacas durante o desenvolvimento, e propor que seja amplamente adaptável a outros sistemas de órgãos.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

Este estudo utiliza uma técnica de microscopia (LSFM) de fluorescência de luz-folha de iluminação dupla face combinada com compensação óptica para estudar o coração murino.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para o estudo do coração murino

A proliferação de cardiomiócitos após a lesão é um processo dinâmico que requer uma sinfonia de pistas extracelulares de populações de células não miócitos. Utilizando o rastreamento de linhagem, claridade passiva e técnicas tridimensionais de microscopia confocal de montagem completa, podemos analisar a influência de uma variedade de tipos de células na reparação e regeneração cardíaca.

Capturando a resposta de lesão cardíaca de populações de células-alvo através de imagens tridimensionais do coração limpo

Relatamos um método para reconstrução mesoscópica de todo o coração do rato, combinando novos avanços na transformação e coloração de tecidos com o desenvolvimento de um microscópio de folha de luz digitalizado axialmente.

Imagem óptica mesoscópica do coração de todo o rato

Apresentamos um protocolo detalhado para cultura e imagem de embriões de camundongos que permite imagens 3D + tempo de células progenitoras cardíacas. Este kit de ferramentas de vídeo aborda as principais habilidades necessárias para o sucesso da geração de imagens ao vivo, de outra forma difíceis de adquirir de publicações somente de texto.

Imagem ao vivo de progenitores cardíacos precoces no embrião de camundongo

O protocolo utiliza microscopia avançada de folha de luz junto com métodos adaptados de limpeza de tecidos para investigar estruturas cardíacas intrincadas em corações de roedores, com grande potencial para a compreensão da morfogênese e remodelação cardíaca.

Imagem de folha de luz para revelar estrutura cardíaca em corações de roedores

Este protocolo apresenta um método rápido para imagens vasculares tridimensionais quantitativas de montagem total usando microscopia de fluorescência de folha de luz. A eficácia do método é demonstrada usando o sistema de artérias do arco faríngeo do modelo de embrião de galinha, com forças hemodinâmicas quantificadas via fluidodinâmica computacional.

Imagens rápidas de alta resolução de montagem total de vasculatura de pequenos animais para estudos quantitativos

Aprenda a imagem volumétrica de células marcadas com proteínas fluorescentes em corações intactos de embriões e pós-natais. Este método de clareamento tecidual permite visualização em resolução de célula única para estudar funções gênicas no desenvolvimento cardíaco.

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

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