Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única
7 de outubro de 2016
Descrevemos um protocolo para obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações embrionários e pós-natais intactos. Utilizando métodos de limpeza de tecido em combinação com coloração de montagem inteira, células marcadas com proteína fluorescente única dentro de um coração embrionário ou pós-natal podem ser visualizadas com clareza e precisão.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens volumétricas de células marcadas com proteínas fluorescentes profundamente dentro de corações intactos, para estudar a função do gene em resolução de célula única durante o desenvolvimento cardíaco e em corações pós-natais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave durante o desenvolvimento cardíaco, como o estudo das funções dos genes e ajudar a imagem na resolução de uma única célula durante o desenvolvimento cardíaco e artefatos animidais. A principal vantagem deste método é que ele é relativamente simples, barato e pró-sábio em que a análise temporal especial das funções do gene e da proteína na resolução de uma única célula em embrião ou coração intacto.
Embora usemos esse sistema para estudar o desenvolvimento do coração em camundongos, você também pode usá-lo para estudar outros sistemas de órgãos, como músculos, cérebro e pulmões e em outros organismos modelo também. Embriões positivos de proteína fluorescente de barragens de confete R-26 Cre-RET2 tratadas com Tamoxifren são usados aqui. Comece a coloração imergindo cada embrião fixado em paraformaldeído em um mililitro de 0,1% PBST nos poços de uma placa de 48 poços.
Incubar durante duas horas num agitador de placas à temperatura ambiente para permeabilizar o tecido. Em seguida, substitua a solução de permeabilização por um mL de tampão bloqueador e incube, com agitação, por duas horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, prepare uma diluição de um a 100 do anticorpo específico da célula endotelial, PECAM, em 0,3 mililitros de tampão de bloqueio para cada poço e adicione-o aos poços que contêm os embriões.
Incubar por 48 horas com agitação a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave os embriões cinco vezes com PBST por 30 minutos de cada vez para remover o excesso de anticorpo primário do tecido. Em seguida, mergulhe os embriões em solução de anticorpo secundário antivato de cabra Alexa Fluor 647 e incube com agitação por 48 horas a quatro graus Celsius, enquanto protegido da luz.
48 horas depois, após a lavagem antes, pós-fixar os embriões com 4% de PFA por uma hora em temperatura ambiente com agitação. Em seguida, depois de lavar duas vezes com PBS por cinco minutos de cada vez, incubar os embriões com coloração nuclear DAPI por dez minutos. Em seguida, faça duas lavagens de PBS de cinco minutos cada, depois prossiga para a limpeza do tecido.
A limpeza do tecido é a etapa mais crítica neste protocolo para obter imagens do coração em uma resolução de célula única. Além disso, a seleção do método de clareamento em escala ou CUBIC também é muito importante para preservar os sinais fluorescentes no coração embrionário intacto. Transfira os embriões lavados e corados para um frasco de cintilação envolto em papel alumínio, que contém um mililitro de solução de escala A2.
Incube a quatro graus Celsius com agitação suave ocasional com a mão por 48 horas. Após a incubação da escala A2, substitua a solução no frasco para injetáveis por um mililitro de solução da escala B4 e incube a quatro graus Celsius com agitação suave ocasional por mais 48 horas. Incube os embriões por mais 48 horas com um mililitro de escala 70 a quatro graus Celsius com agitação suave ocasional como antes.
Por fim, mergulhe a amostra limpa da balança em um mililitro de glicerol a 90% e armazene a quatro graus Celsius até a imagem. Para obter a imagem, transfira a amostra para uma placa de Petri com fundo de vidro com uma quantidade mínima de 90% de glicerol e a imagem com um microscópio confocal equipado com recursos de dois fótons. Para limpeza CÚBICA, mergulhe cada embrião em um mililitro de CÚBICO com agitação suave ocasional por 48 horas a 37 graus Celsius.
Após 48 horas, substituir a solução pelo mesmo volume de reagente CÚBICO fresco e incubar a amostra durante mais 48 horas, como antes. Após a incubação, lave os embriões tratados com CUBIC one com PBS várias vezes com agitação suave com a mão para remover o excesso de solução CUBIC one. Em seguida, mergulhe os embriões em solução CUBIC dois por 48 horas a 37 graus Celsius com agitação suave ocasional com a mão.
Se houver um atraso antes da imagem, incube sequencialmente as amostras com um mililitro de glicerol a 30% 50% e 70% e PBS por 30 minutos cada. Depois de passar pela série, transfira para solução de glicerol a 90% para armazenamento a quatro graus Celsius. Quando estiver pronto, imagem em uma placa de Petri com fundo de vidro com 90% de glicerol, como antes.
Este filme mostra seções ópticas de um coração E 8,75 tratado com escamas, da superfície do coração ao lúmen. O amarelo marca a expressão de PECAM e todos os cardiomiócitos aparecem em verde. A profundidade é de 110,4 mícrons e existem 93 fatias no total.
Esta é a imagem da superfície 3D do coração reconstruído que acabamos de mostrar. Novamente, o amarelo marca a expressão de PECAM e o verde marca todos os cardiomiócitos. Este filme mostra seções de um único clone progenitor de um coração E 9.5 tratado com escamas na região do trato de saída.
Amarelo marca a expressão PECAM e o clone aparece em verde. A profundidade é de 36 mícrons e há 10 fatias no total. Este filme mostra seções de um coração P dois tratado com CUBIC da superfície ao lúmen.
A profundidade é de 130 mícrons com três mícrons por seção. Este filme mostra seções de um coração E 17.5 tratado com CUBIC da superfície ao lúmen. A profundidade é de 630 mícrons com seis mícrons por seção.
Esta é uma imagem da superfície 3D do coração que acabamos de mostrar, reconstruída por meio do software de reconstrução 3D. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o embrião é frágil e a patologia cardíaca pode ser perturbada facilmente. Após este procedimento, outras proteínas podem ser realizadas, usando coloração para estudar a função do gene em uma pós-osteologia e espuma.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para a imagem volumétrica de células marcadas com proteínas fluorescentes em corações intactos embrionários e pós-natais. O método combina técnicas de clareamento de tecidos com coloração em montagem inteira para obter imagens nítidas com resolução em nível celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Desenvolvimento cardíaco
- Imagem fluorescente
- Análise da função gênica
Antecedentes
- Compreender as funções dos genes durante o desenvolvimento cardíaco é fundamental.
- A imagem com resolução em nível de célula única permite uma análise detalhada.
- O método é aplicável a diversos sistemas orgânicos e organismos modelo.
- A marcação com proteínas fluorescentes melhora a visualização de células específicas.
Objetivo do Estudo
- Estudar a função gênica em resolução de única célula em tecidos cardíacos.
- Investigar processos de desenvolvimento em corações embrionários e pós-natais.
- Fornecer um método de imagem relativamente simples e de baixo custo.
Métodos Utilizados
- Utilização de métodos de clareamento de tecidos.
- Coloração em montagem inteira de células marcadas com proteína fluorescente.
- Obtenção de imagens de embriões fixados com paraformaldeído.
- Aplicação do método a diversos sistemas orgânicos além do coração.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida de células marcadas com proteínas fluorescentes em corações intactos.
- Visualização clara das funções gênicas durante o desenvolvimento cardíaco.
- Demonstração da versatilidade do método em diferentes sistemas orgânicos.
- Estabelecimento de um protocolo acessível e eficiente.
Conclusões
- O protocolo permite o estudo detalhado do desenvolvimento cardíaco no nível celular.
- Pode ser adaptado para uso em outros sistemas biológicos.
- Este método aprimora nossa compreensão das funções gênicas no desenvolvimento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A obtenção de imagens de corações embrionários e pós-natais clarificados com resolução de única célula permite uma análise detalhada do comportamento e diferenciação de células progenitoras cardíacas durante o desenvolvimento. Esta abordagem auxilia na validação de alvos ao esclarecer os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à morfogênese cardíaca normal e anormal. O método fornece confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao associar a função gênica a resultados estruturais em tecido intacto.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da visualização da dinâmica clonal em tecido cardíaco em desenvolvimento.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da observação direta das contribuições de células progenitoras para estruturas cardíacas.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança na seleção de alvos ao associar perturbações gênicas a desfechos fenotípicos com resolução de única célula.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos posteriores, preservando sinais fluorescentes após a clareação.
- Valor Operacional: Permite a padronização de ensaios por meio de protocolos reprodutíveis de clareamento de tecidos e coloração em montagem inteira.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em estágios embrionários e pós-natais com métodos de clareamento apropriados para cada estágio (ScaLe para embrionário, CUBIC para pós-natal).
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao permitir a realização consistente de imagens da função gênica em diferentes estágios de desenvolvimento.
- Redução de Riscos Mecanicistas: Revela a base celular de defeitos cardíacos congênitos por meio de análise clonal em corações intactos.
- Sistema Relevante para Doenças: Oferece um modelo fisiologicamente rico em contexto para o estudo da morfogênese cardíaca relevante para o desenvolvimento humano.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores e validação pré-clínica, ao permitir leituras quantitativas e com resolução espacial da função gênica em tecido cardíaco intacto.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao visualizar a expansão clonal e a diferenciação durante o desenvolvimento cardíaco.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de protocolos padronizados de clareamento e coloração que preservam os epítopos e os sinais de proteínas fluorescentes.
- Análises: Gera dados quantitativos de imagem 3D que possibilitam a comparação da distribuição, tamanho e localização clonal entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir a avaliação longitudinal de fenótipos estruturais cardíacos associados a perturbações genéticas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de imagem reutilizável aplicável a diversos sistemas orgânicos (coração, cérebro, pulmão, músculo) e organismos modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de desenvolvimento cardíaco.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio de etapas definidas de clareamento e coloração, compatíveis com microscopia confocal e de dois fótons.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer evidência visual direta do engajamento do alvo e das consequências fenotípicas em tecido intacto.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao vincular fenótipos precoces de desenvolvimento a mecanismos potenciais de defeitos congênitos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em marcação com proteínas fluorescentes, imunomarcação em montagem inteira e técnicas de clareamento de tecidos.
- Depende do acesso a sistemas de microscopia confocal ou de dois fótons capazes de realizar imagens em tecidos profundos.
- Necessita padronização na escolha do método de clareamento (ScaLe versus CUBIC) com base no estágio de desenvolvimento, a fim de preservar a integridade do tecido e o sinal.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a outros sistemas orgânicos, devido a variações na densidade do tecido e na tolerância ao clareamento.
- Inclui limitações práticas, como a fragilidade do tecido durante o manuseio e o potencial de disruptura da patologia caso o clareamento não seja otimizado para o estágio de desenvolvimento.
