Name: Medindo In Vitro Actividade ATPase para enzimática Caracterização (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda a quantificar a atividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para caracterização enzimática. Este método sensível permite avaliar ativadores, inibidores e otimizar condições experimentais.

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Os autores gostariam de agradecer o financiamento de uma bolsa do National Institutes of Health RO1AI049294 (para MS).

1. Execute Reaction ATP hidrólise com Proteína Purificada <ol><li> Prepare estoques de todos os reagentes necessários para a incubação com proteína purificada. <ol><li> Prepare 5x HEPES / NaCl / glicerol (HNG) contendo tampão HEPES 100 mM, pH 8,5, NaCl 65 mM e glicerol a 5% (ou outro tampão de ensaio conforme o caso). </li><li> Preparação de 100 mM de MgCl2 (ou outro metal, se é de ATPase dependente de metais) em água. </li><li> Prepare fresco ATP 100 mM em 200 mM Tris Base (não ajustar o pH ainda mais), utilizando alta ATP pureza. Alíquotas e armazenar o estoque de ATP a -20 ° C durante não mais do que algumas semanas, como ATP vai quebrar ao longo do tempo, e se abstenham de congelamento e descongelamento o estoque de ATP. </li><li> Pré-mistura de MgCl2 e ATP em uma relação de 1: 1 pouco antes de se a reacção de hidrólise de ATP. </li></ol></li><li> Preparar e rotular tubos de 1,5 ml para a recolha de amostras em intervalos regulares ao longo da reacção. Preparar tubos para recolher amostras no momento 0 e no momento 15, 30,45 e 60 min. NOTA: Como alternativa, recolher amostras apenas em tempo de 0 e o ponto final. <ol><li> Adicionar 245 ul de tampão 1x HNG a cada tubo, a fim de diluir as amostras recolhidas a partir das reações de hidrólise de ATP 1:50. </li></ol></li><li> Prepara-se uma banho de gelo seco e etanol para congelar rapidamente amostras para parar a reacção. Em um balde de borracha gelo ou recipiente outra segura (não de plástico), adicione vários pedaços de gelo seco e despeje com cuidado suficiente de etanol 70-100% para cobrir o gelo seco. </li><li> Diluir proteína purificada em tampão HNG 1x, conforme apropriado (tipicamente 5-10 mM), e manter em gelo. </li><li> Configurar as reações de hidrólise de ATP. <ol><li> Em separados 0,5 ml de tubos para cada amostra, adicionar os seguintes reagentes (por ordem): H2O (até um volume final de 30 ul), 6 ul de 5x tampão HNG ou outra, 3 ul de MgCl 100 mM de 2 -ATP mistura, e 0,25-5 proteína uM. </li><li> Incluir uma única tampão-condicionado de controlo negativo em que é adicionado nenhuma proteína.</li></ol></li><li> Retirar 5 ul a partir da reacção no tempo 0, dilui-se a 1:50 em o tubo de 1,5 mL contendo 245 uL preparado tampão HNG, e congelar imediatamente a amostra no banho de gelo seco / etanol. </li><li> Incubar as reacções a 37 ° C para permitir a hidrólise do ATP a ocorrer durante 1 h. Em cada intervalo (15, 30, 45, e 60 min), remover aliquotas de 5 ul a partir da reacção e adicionar aos tubos de amostra marcado contendo tampão HNG como no passo 1.6. </li><li> No final da reacção de hidrólise de ATP, mover-se amostras diluídas para um congelador de -80 ° C para armazenamento. Para garantir que todas as amostras são completamente congelado, espere pelo menos 10 minutos antes de prosseguir. </li></ol> 2. As amostras Incubar Contendo gratuito Pi com Detecção de Reagente <ol><li> Descongelar as amostras diluídas contendo alíquotas de reacção de hidrólise de ATP em cada ponto de tempo (obtidos a partir dos passos 1,6 e 1,7) à temperatura ambiente. </li><li> Defina-se uma placa de 96 poços contendo amostras e padrões de fosfato. <ol><li> Em 0,5 ml de uma TUser, dilui-se o padrão de fosfato (fornecida com o reagente de detecção Pi) a partir de 800 uM a 40 uM por adição de 5,5 mL de tampão HNG a 800 uM padrão de 104,5 ul. Misturar bem e adicionar 100 ul deste padrão 40 pM Pi a bem A1 de uma placa de 96 poços. </li><li> Adicionar tampão HNG 50 ul a poços B1-H1 para 1: 1 de diluições em série do padrão Pi. </li><li> Remover 50 pi de 40 uM de Pi bem A1 e adicionar ao tampão de ensaio 50 uL de B1 bem, misturar e remover a partir de 50 ul bem B1 e adicionar ao Poço C1, continuando através de diluições G1 bem. Descartar 50 ul de G1 bem após a mistura para assegurar a cada poço tem o mesmo volume. Bem H1 deve conter apenas buffer para criar um padrão Pi 40-0 M. NOTA: Se um factor adicional (tal como um inibidor) foi adicionado às amostras, criar uma curva padrão, contendo esse factor para controlar as variações de libertação de fosfato ou absorvância sob essas condições. </li><li> Adicionar 50 ul de cada SAMPle em duplicado à placa. Adicionar amostras a partir do mesmo ponto de tempo em colunas verticalmente (amostra de 1 hora 0 = A2, A3; amostra 2 0 tempo = B2, B3) e diferentes pontos de tempo horizontalmente. Isto permite até 8 amostras e 5 pontos de tempo por placa. </li></ol></li><li> Usar uma pipeta estéril para remover o reagente suficiente malaquite verde / molibdato Pi detecção para adicionar 100 ul a cada um dos poços que contêm as amostras e padrões (reagente necessários (ml) = 0,1 x número de amostras e os padrões) e adicionar a um prato para facilitar a pipetagem utilizando uma pipeta multicanal. Não despeje o reagente de detecção diretamente no prato, como a contaminação Pi é provável que ocorra. </li><li> Usando uma pipeta multicanal, adicionar 100 uL de reagente de detecção Pi a cada poço e misture cuidadosamente por pipetagem para cima e para baixo um número consistente de vezes sem bolhas de introdução, de um modo preferido, a fim de os últimos pontos de tempo para os primeiros pontos de tempo. </li><li> Incubar a placa durante 25 minutos à temperatura ambiente, ou de acordo com a madireções de nufacturer. </li></ol> 3. Resultados quantificar usando um leitor de microplacas <ol><li> Leia a absorvância das amostras a 650 nm usando um leitor de microplacas de absorvância. </li><li> Fazer uma curva padrão Pi. Usando um software de gráficos, o gráfico dos valores de absorção para as amostras padrão Pi em função da concentração, a fim de encontrar uma equação usada para resolver a quantidade de fosfato em cada amostra. </li><li> Calcula-se a actividade de ATPase para cada amostra de calibração com o padrão de fosfato. Fosfato libertado = (OD 650 - Y ordenada) / inclinação. <ol><li> Média do total Pi de duplicatas de cada amostra. Subtrair a leitura de absorvância do controlo só de tampão a partir deste número. Multiplique isso pelo fator de diluição (50 no nosso exemplo). </li><li> Determine o Pi nmol libertada por proteína mol. Representação gráfica destes valores para cada ponto de tempo em um ensaio cinético deve render ajuste linear de, pelo menos, R = 0,99 (Figura 1); Se not, o ensaio pode ser ajustado com mais ou menos proteína ou um tempo de incubação mais longo ou mais curto. </li></ol></li><li> Representam os resultados como nmol de Pi / mol de proteína / min (Figuras 2, 3), ou como proteínas nmol Pi / g / min, se desejado. </li></ol>

<ol><li>Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA%2B+proteins%3A+have+engine%2C+will+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">AAA+ proteins: have engine, will work.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).</li>
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<li>Shiue, S., Kao, K., Leu, W., Chen, L., Chan, N., Hu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XpsE+oligomerization+triggered+by+ATP+binding%2C+not+hydrolysis%2C+leads+to+its+association+with+XpsL%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">XpsE oligomerization triggered by ATP binding, not hydrolysis, leads to its association with XpsL.</a> EMBO J. 25 (7), 1426-1435 (2006).</li>
<li>Ghosh, A., Hartung, S., van der Does, C., Tainer, J. A., Albers, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Archaeal+flagellar+ATPase+motor+shows+ATP-dependent+hexameric+assembly+and+activity+stimulation+by+specific+lipid+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Archaeal flagellar ATPase motor shows ATP-dependent hexameric assembly and activity stimulation by specific lipid binding.</a> Biochem J. 437 (1), 43-52 (2011).</li>
<li>Savvides, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirB11+ATPases+are+dynamic+hexameric+assemblies%3A+new+insights+into+bacterial+type+IV+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">VirB11 ATPases are dynamic hexameric assemblies: new insights into bacterial type IV secretion.</a> EMBO J. 22 (9), 1969-1980 (2003).</li>
<li>Sanghera, J., Li, R., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+luminescent+ADP-Glo+assay+to+a+standard+radiometric+assay+for+measurement+of+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Techn%22%5BJournal%5D)">Comparison of the luminescent ADP-Glo assay to a standard radiometric assay for measurement of protein kinase activity.</a> Assay Drug Dev Techn. 7 (6), 615-622 (2009).</li>
<li>Sherman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoupling+catalytic+activity+from+biological+function+of+the+ATPase+that+powers+lipopolysaccharide+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decoupling catalytic activity from biological function of the ATPase that powers lipopolysaccharide transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (13), 4982-4987 (2014).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cofactor+regulation+with+disease-associated+p97%2FVCP+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Altered cofactor regulation with disease-associated p97/VCP mutations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (14), E1705-E1714 (2015).</li>
<li>Rowlands, M. G., Newbatt, Y. M., Prodromou, C., Pearl, L. H., Workman, P., Aherne, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Anal Biochem. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este é um protocolo geral para a medição da actividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para a caracterização bioquímica. Este método é facilmente optimizado; Por exemplo, ajustando a quantidade de proteína, tampão e composições de sal, temperatura, e variando-se o comprimento de ensaio e intervalos (incluindo o aumento do número total de intervalos) pode melhorar a actividade de quantificação. reagentes verde à base de malaquita comercialmente disponíveis são altamente sensíveis, e pode detect...

ATPases são enzimas integrais em muitos processos em todos os reinos da vida. As ATPases atuam como motores moleculares que usam a energia da hidrólise do ATP para alimentar reações tão diversas como tráfego, desdobramento e montagem de proteínas; replicação e transcrição; metabolismo celular; movimento muscular; motilidade celular; e bombeamento de íons1-3. Algumas ATPases são proteínas transmembranares envolvidas no transporte de solutos através das membranas, outras são citoplasmáticas e podem estar associadas a uma membrana biológica, como a membrana plasmática ou as de organelas.
AAA+ ATPases (ATPases associadas a várias atividades celulares) compõem um grande grupo de ATPases que compartilham alguma sequência e conservação estrutural. Essas proteínas contêm motivos de ligação de nucleotídeos conservados, como as caixas Walker-A e -B, e formam oligômeros (geralmente hexâmeros) em seu estado ativo1. Grandes mudanças conformacionais nessas proteínas após a ligação de nucleotídeos foram caracterizadas entre diversos membros da família AAA+. EpsE é uma ATPase AAA+ e membro da subfamília de secreção bacteriana Tipo II/IV de NTPases4-6. EpsE potencializa a secreção tipo II (T2S) em Vibrio cholerae, o agente causador da cólera. O sistema T2S é responsável pela secreção de uma grande variedade de proteínas, como a toxina do fator de virulência da cólera, que causa diarreia aquosa abundante quando V. cholerae coloniza o intestino delgado humano7. 
As técnicas para quantificar a atividade da ATPase in vitro são variadas, mas comumente medem a liberação de fosfato usando substratos colorimétricos, fluorescentes ou radioativos8-11. Descrevemos um método básico para determinar in vitro a atividade da ATPase de proteínas purificadas usando um ensaio colorimétrico baseado em um substrato contendo verde de malaquita comercialmente disponível que mede o fosfato inorgânico liberado (Pi). Em pH baixo, o molibdato verde malaquita forma um complexo com Pi e o nível de formação do complexo pode ser medido a 650 nm. Este ensaio simples e sensível pode ser usado para caracterizar funcionalmente novas ATPases e avaliar os papéis de potenciais ativadores ou inibidores, para determinar a importância de domínios e/ou resíduos específicos, ou para avaliar o efeito de tratamentos específicos na atividade enzimática.

<table><tbody><tr><td>Tampão HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina (ATP)</td><td>Placas Fisher</td><td>BP41325</td><td></td></tr><tr><td>de 96 poços (transparente, fundo plano)</td><td>VWR</td><td>82050-760</td><td></td></tr><tr><td>BIOMOL Green</td><td>Enzo Life Ciências</td><td>BML-AK111</td><td>Reagente de detecção de fosfato preferido. Cuidado: irritante.</td></tr><tr>Leitor <td></td><td></td><td>de microplacas</td><td>BioTek Synergy ou software</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td></tr> comparável</tbody></table>

medindo<em&gt; in vitro</em&gt; actividade atpase para enzimática caracterização

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

enzimas de hidrólise de trifosfato de adenosina, ou ATPases, desempenham um papel crítico num conjunto diversificado de funções celulares. Estas proteínas dinâmicas podem gerar energia para o trabalho mecânico, tais como o tráfico de proteínas e degradação, transporte de soluto e movimentos celulares. O protocolo aqui descrito é um ensaio de base para a medição da actividade in vitro de ATPases purificadas para a caracterização funcional. Proteínas hidrolisar ATP numa reacção que resulta na libertação de fosfato inorgânico, e a quantidade de fosfato libertado é então quantificada utilizando um ensaio colorimétrico. Este protocolo altamente adaptável pode ser ajustado para medir a actividade de ATPase em ensaios cinéticos ou terminal. Um protocolo representante é fornecido aqui com base na atividade e as exigências de Epse, a AAA + ATPase envolvida no Tipo II Secreção na bactéria Vibrio cholerae. A quantidade de proteína purificada necessária para medir a actividade, duração do ensaio e o calendário e número de saintervalos mpling, tampão e a composição de sal, temperatura, co-factores, estimulantes (se houver), etc., podem variar a partir dos descritos aqui, e, assim, alguma optimização pode ser necessário. Este protocolo fornece uma estrutura básica para ATPases que caracterizam e pode ser realizado de forma rápida e facilmente ajustado conforme necessário.

A actividade in vitro da ATPase T2S Epse pode ser estimulada por copurification de Epse com o domínio citoplasmático de EPSL (Epse-cytoEpsL) e adição do ácido 12 cardiolipina fosfolípido. É também possível determinar o papel de determinados resíduos Epse em hidrólise de ATP comparando a actividade do tipo selvagem (WT) para formas variantes da proteína utilizando este ensaio. Aqui, o efeito da substituição de dois resíduos de lisina no domínio de ligação de zinco Epse...

Descrevemos um protocolo básico para quantificar a atividade da ATPase in vitro. Este protocolo pode ser otimizado com base no nível de atividade e requisitos para uma determinada ATPase purificada.

Medindo<em&gt; In Vitro</em&gt; Actividade ATPase para enzimática Caracterização

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a atividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para caracterização funcional. Este método pode ser utilizado para caracterizar novas ATPases putativas, avaliar potenciais ativadores ou inibidores eficazes e determinar a contribuição de domínios ou resíduos específicos para a atividade ATPase. A principal vantagem desta técnica é que se trata de um método simples e sensível para medir a atividade ATPase in vitro, podendo ser facilmente otimizado.Prepare estoques de todos os reagentes necessários para incubação com a proteína purificada conforme instruído no protocolo textual. Pré-misture cloreto de magnésio 100 milimolar e ATP 100 milimolar em uma proporção de um para um pouco antes de montar a reação de hidrólise de ATP. Prepare e rotule tubos de 1,5 mililitro para coletar amostras em intervalos regulares durante toda a reação.Prepare tubos para coletar amostras nos tempos zero, bem como nos tempos de 15, 30, 45 e 60 minutos. Adicione 245 microlitros de tampão HNG 1x a cada tubo para diluir as amostras coletadas das reações de hidrólise de ATP em uma diluição de 1 para 50. Em seguida, prepare um banho de gelo seco e etanol par

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Biology

Biologia

Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.

Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas

Este vídeo demonstra um ensaio enzimático baseado em cromatografia em camada fina para determinar a atividade da pirofosfoquinase usando nucleotídeos radiomarcados. O método fornece informações sobre a síntese de nucleotídeos e reações de fosfotransferência.

Ensaio de atividade enzimática baseado em cromatografia em camada fina: uma técnica para determinar a atividade da pirofosfoquinase in vitro usando cromatografia em camada fina

Este vídeo demonstra a medição in vitro da atividade enzimática da α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida em amostras usando substratos sintéticos de 4-metilumbeliferil.

Medição in vitro da atividade da enzima α-galactosidase A e da α-glicosidase ácida

Descrevemos um método para quantificar a atividade de ATPases do tipo P de contratransporte de K+ pela expressão heteróloga das enzimas em oócitos de Xenopus e medindo a captação de Rb+ ou Li+ em células individuais por espectrofotometria de absorção atômica. O método é uma alternativa sensível e segura aos experimentos de fluxo de radioisótopos, facilitando estudos cinéticos complexos.

Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

Aqui descrevemos ensaios bioquímicos que podem ser usados para caracterizar enzimas de remodelação da cromatina dependentes de ATP por suas habilidades de 1) catalisar o deslizamento do nucleossomo dependente de ATP, 2) envolver-se com substratos de nucleossomos e 3) hidrolisar ATP de maneira dependente de nucleossomo ou DNA.

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Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.

Uma purificação e ensaio de atividade In Vitro para um ppGpp (p) sintetase de Clostridium difficile

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.

Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Aprenda a quantificar a atividade ATPase in vitro de proteínas purificadas para caracterização enzimática. Este método sensível permite avaliar ativadores, inibidores e otimizar condições experimentais.

Medindo

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