Medindo In Vitro Actividade ATPase para enzimática Caracterização

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a atividade da ATPase in vitro de proteínas purificadas para caracterização funcional. Este método pode ser usado para caracterizar novas ATPases putativas, avaliar os potenciais ativadores ou inibidores efetivos e determinar a contribuição de domínios ou resíduos específicos para a atividade da ATPase. A principal vantagem dessa técnica é que ela é um método simples e sensível para medir a atividade da ATPase in vitro e pode ser facilmente otimizada.

Preparar as reservas de todos os reagentes necessários para a incubação com proteínas purificadas, conforme indicado no protocolo de texto. Pré-misture 100 milimolares de cloreto de magnésio e 100 milimolares de ATP em uma proporção de um para um antes de configurar a reação de hidrólise de ATP. Prepare e rotule tubos de 1,5 mililitro para coletar amostras em intervalos regulares durante a reação.

Preparar tubos para recolher amostras nos tempos zero, bem como nos tempos de 15, 30, 45 e 60 minutos. Adicione 245 microlitros de tampão 1x HNG a cada tubo para diluir as amostras coletadas das reações de hidrólise de ATP em uma diluição de um a 50. Em seguida, prepare um banho de gelo seco e etanol para congelar rapidamente as amostras para interromper a reação.

Em um balde de gelo de borracha ou outro recipiente seguro, adicione vários pedaços de gelo seco e despeje cuidadosamente 70% a 100% de etanol suficiente para cobrir o gelo seco. Dilua a proteína purificada em tampão 1X HNG e mantenha-a no gelo. Configure as reações de hidrólise de ATP nos tubos de 0,5 mililitro preparados, adicionando um volume pré-calculado de água para atingir um volume de reação final de 30 microlitros.

Seguido por seis microlitros de 5X HNG ou outro tampão, três microlitros de mistura de ATP de cloreto de magnésio 100 milimolares e 0,25 a cinco micromolares de proteína. Incubar uma condição de controlo negativo apenas tampão em que não seja adicionada proteína. Em seguida, remova cinco microlitros da reação vezes zero.

Em seguida, dilua a alíquota um a 50 no tubo preparado de 1,5 mililitro contendo 245 microlitros de tampão HNG. Congelar imediatamente a amostra no banho de etanol com gelo seco. Incube reações a 37 graus Celsius para permitir que a hidrólise do ATP ocorra por uma hora.

Em cada intervalo, remova cinco alíquotas de microlitros da reação e adicione aos tubos de amostra rotulados contendo tampão HNG como antes. No final da reação de hidrólise de ATP, mova as amostras diluídas para um freezer de 80 graus Celsius para armazenamento. Para garantir que todas as amostras estejam completamente congeladas, aguarde pelo menos 10 minutos antes de prosseguir.

Descongelar as amostras diluídas contendo alíquotas de reacção de hidrólise de ATP de cada ponto de tempo à temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma placa de 96 poços contendo amostras e padrões de fosfato. Em um tubo de 0,5 mililitro, dilua o padrão de fosfato de 800 micromolares para 40 micromolares, adicionando 5,5 microlitros do padrão a 104,5 microlitros de tampão HNG.

Misture bem e adicione 100 microlitros deste padrão de fosfato micromolar de 40 ao poço A1 da placa de 96 poços. Adicione 50 microlitros de tampão HNG aos poços B1 a H1 para diluições em série de um para um do padrão de fosfato. Remova 50 microlitros de fosfato 40 micromolar do poço A1, adicione-o aos 50 microlitros de tampão de ensaio no poço B1 e misture.

Em seguida, remova 50 microlitros do poço B1 e adicione-o ao poço C1, continuando as diluições através do poço G1. Descarte 50 microlitros do poço G1 após a mistura para garantir que cada poço tenha o mesmo volume. O poço H1 deve conter apenas tampão para criar um padrão de fosfato de 40 a zero micromolar. Em seguida, adicione 50 microlitros de cada amostra em duplicata à placa.

Adicione amostras do mesmo ponto de tempo em colunas verticalmente e de diferentes pontos de tempo horizontalmente. Isso permite até oito amostras e cinco pontos de tempo por placa. Use uma pipeta estéril para remover reagente de detecção de fosfato de meliptato verde malaquita suficiente para adicionar 100 microlitros a cada um dos poços contendo amostras e padrões.

Adicione o reagente de detecção a um prato para facilitar a pipetagem usando uma pipeta multicanal. Não despeje o reagente de detecção diretamente no prato, pois é provável que ocorra contaminação por fosfato. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 microlitros do reagente de detecção de fosfato a cada poço e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo um número consistente de vezes sem introduzir bolhas, trabalhando em ordem do último ponto de tempo para o primeiro ponto de tempo.

Deixe o prato em temperatura ambiente por 25 minutos ou de acordo com as instruções do fabricante. Para quantificar os resultados, leia a absorbância das amostras a 650 nanômetros usando um leitor de microplacas de absorbância. São mostrados resultados representativos de ATPases cinéticas e finais, nas quais a atividade das formas selvagem e mutante da ATPase / EPSE de secreção tipo dois é determinada na presença e ausência de uma cardiolipina estimulante.

Aqui são mostrados os resultados de uma ATPase cinética estimulada por cardiolipina, demonstrando a liberação linear de fosfato ao longo do tempo para EPSE do tipo selvagem e um mutante de lisina dupla, com albumina de soro bovino servindo como controle negativo. Esses dados podem ser representados como a quantidade de fosfato liberada por minuto dividida pela concentração da proteína, a fim de quantificar e comparar a atividade da ATPase de cada proteína. Os dados indicam que dois resíduos de lisina, K417 e K419, contribuem para a atividade da ATPase estimulada por cardiolipina da EPSE.

A comparação da atividade da ATPase das mesmas proteínas sem estimulação cardiolipina mostra que esses dois resíduos de lisina não contribuem para a baixa atividade basal da EPSE, mas sim para a capacidade da proteína de ser estimulada pela cardiolipina. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar com rapidez e precisão a atividade da ATPase de proteínas purificadas. Ao tentar este procedimento, é importante considerar a sensibilidade do reagente de detecção de fosfato.

Para evitar a contaminação por fosfato, recomendamos o uso de plástico descartável e água ultrapura e a realização de cromatografia de exclusão de tamanho ou troca iônica após a purificação de proteínas.