Imagens de cálcio na Drosophila At Activation Egg

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o cálcio durante a ativação do ovo em Drosophila melanogaster. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como qual é a fonte, a dinâmica e os papéis a jusante do cálcio na ativação do ovo. As principais vantagens dessa técnica são permitir maior resolução espacial, manipulação física do óvulo maduro antes da ativação e testar o papel da ativação do óvulo sem fertilização.

Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em isolar os ovos maduros sem danos e aplicar tampão de ativação ao ovo maduro sem perder a amostra. Para iniciar este procedimento, ajuste a ampliação do microscópio de dissecação para 4X. Na primeira lamínula, separe os dois ovários rasgando o oviduto com um par de pinças fechadas e uma sonda de dissecação, tomando cuidado para não perfurar nenhuma câmara de ovo.

Em seguida, insira uma sonda de dissecação padrão no centro do ovário, ao lado da pinça fechada. Arraste suavemente a sonda de dissecação através do ovário, em direção ao pólo posterior, onde os óvulos maduros estão localizados. Quando os óvulos maduros estiverem visíveis na lamínula fora do ovário, manobre de três a cinco deles em uma linha no centro.

Em seguida, remova o resto do tecido ovariano arrastando-o para longe dos óvulos alinhados. Em seguida, remova o excesso de óleo enxugando-o com a ponta de um lenço umedecido. Desenhe uma mira na lamínula com um marcador para localizar a amostra ao microscópio.

Depois disso, deixe as câmaras de ovos preparadas na lamínula descansarem por cinco a 10 minutos para permitir que os ovos se depositem no óleo. Traga para a instalação de imagem as lamínulas preparadas, o tampão de ativação à temperatura ambiente e as pipetas de vidro. Selecione uma objetiva adequada para obter imagens de todo o óvulo maduro.

Em seguida, monte a primeira lamínula preparada no microscópio stage. Em seguida, selecione um campo de view de uma câmara de ovo madura para ativação. Defina os parâmetros de imagem para excitação e emissão padrão de GFP.

Depois disso, configure uma visão de campo brilhante para visualizar e orientar o ovo maduro e o óleo deslocado. Agora, selecione o plano Z mais baixo onde os óvulos maduros são visíveis. E defina uma pilha Z completa para ser tomada por 40 micrômetros a dois micrômetros por etapa.

Em seguida, defina a série temporal para capturar as imagens por 30 minutos. Neste procedimento, inicie a captura de imagem e adquira uma a duas pilhas Z completas para mostrar o óvulo maduro antes da ativação. Em seguida, retire aproximadamente 300 microlitros de tampão de ativação em uma pipeta de vidro.

Posicione a ponta da pipeta de vidro contendo o tampão de ativação em um ângulo de 45 graus acima da lamínula e mova lentamente a pipeta para o caminho do feixe, até que esteja diretamente acima do ovo maduro que está sendo fotografado. Adicione uma a duas gotas de tampão de ativação em menos de cinco segundos, para deslocar o óleo. A adição de uma a duas gotas de tampão de ativação precisa ser feita no ângulo correto, suave e rapidamente.

Ao adicionar o buffer de ativação durante a aquisição da imagem, verifique o canal de campo claro para garantir que o óleo tenha sido deslocado. Assim que o óleo for deslocado com sucesso, permita que a série temporal seja executada até a conclusão. Para criar uma projeção dos dados adquiridos, selecione uma fatia Z inicial e uma fatia Z final para toda a seção.

Depois, selecione um tipo de projeção, por exemplo, intensidade máxima. Em seguida, marque a caixa de seleção Todos os períodos de tempo para aplicar as configurações selecionadas a toda a série. Para ajustar o brilho e o contraste da imagem, selecione Imagem e, em seguida, Ajustar, seguido de Brilho/Contraste.

Para exportar a série temporal como um filme, selecione Arquivo e, em seguida, Salvar como, seguido de AVI. Em seguida, selecione a taxa de quadros. Aqui é mostrada a série temporal de um ovo de Drosophila maduro ex vivo expressando um indicador de cálcio geneticamente codificado após a adição de tampão de ativação.

O aumento do cálcio citoplasmático se origina no pólo posterior e se propaga com uma velocidade média de aproximadamente 1,5 micrômetros por segundo. O início da onda é normalmente observado dentro de três minutos após a adição do tampão de ativação. Após a ativação, os níveis de cálcio intracelular do óvulo maduro se recuperam.

Em Drosophila, a co-visualização da onda de cálcio e do citoesqueleto de actina pode ser alcançada usando este ensaio de ativação ex vivo. A actina parece estar mudando com o tempo, conforme indicado pelas pontas das setas brancas. A falta de detecção do sinal de cálcio no centro do ovo maduro se deve ao movimento da amostra durante a captura da imagem.

Uma vez dominada, toda essa técnica pode ser feita em menos de uma hora, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de levar o seu tempo ao manobrar as câmaras de ovos e ao configurar os parâmetros para aquisição. Este procedimento pode ser adaptado para visualizar outras proteínas, organelas ou indicadores de cálcio marcados com fluorescência na ativação do ovo.

Isso pode ajudar a resolver questões sobre a fonte de cálcio e os efeitos a jusante.