Name: Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Aprenda a realizar detecção molecular rápida de Influenza A e B usando amplificação isotérmica e sondas beacon. Este método de 15 minutos melhora o diagnóstico clínico de infecções respiratórias.

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Agradecemos à equipe do Serviço de Microbiologia Clínica do Memorial Sloan-Kettering Cancer Center pela ajuda na coleta de amostras clínicas. Este estudo foi apoiado em parte por um acordo de pesquisa entre MSKCC e Alere Scarborough (SK2013-0262).

ÉTICA DECLARAÇÃO: A utilização de sobras de amostras clínicas é aprovado e segue as diretrizes da Cancer Center Institutional Review Board Memorial Sloan Kettering. 1. Antes de realizar o teste NOTA: O Influenza A e B do ensaio é aprovado para espécimens de esfregaço nasofaríngeo e das zaragatoas nasofaríngeas armazenados no meio de transporte viral. As mechas são incluídos no kit e deve ser usado para um desempenho óptimo. No entanto, rayon, espuma, reuniram-se cotonetes ou swab nasal de poliéster também pode ser usado para coletar amostras de swab nasal. <ol><li> Para a coleta de uma amostra de swab nasal, insira o cotonete na narina que tem a drenagem mais visível ou que é mais congestionado. Com a rotação suave, empurre a zaragatoa na narina até encontrar resistência e rodar várias vezes contra a parede nasal antes de lentamente retirar da narina. Armazenar os cotonetes e transportá-los em frascos contendo 3 ml de meio de transporte viral (VTM). NOTA: A atenção cuidadosa para aproprcoleta de amostras iate deve ser tomado como coleta de amostra inadequada pode produzir resultados errados. NOTA: As amostras de zaragatoa deve ser testado o mais rapidamente possível após a colheita. No entanto, elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante até 2 horas ou refrigerada a 2-8 ° C durante até 24 horas, se o teste não está imediatamente disponível. amostras recolhidas recentemente são ideais para o desempenho no teste ideal. O manuseio inadequado da amostra, armazenamento e / ou transporte podem produzir resultados errados. NOTA: Como medida de precaução, os indivíduos que executam este teste deve tratar todas as amostras como potencialmente infecciosas, seguindo as precauções universais ao manusear amostras. </li><li> Trazer todas as amostras à temperatura ambiente antes do teste. NOTA: Todos os componentes de ensaio são de uma única utilização e não deve ser utilizado para executar vários testes. Não misturar os componentes do kit de lotes diferentes. Não usar reagentes após a data de expiração. </li><li> Traga o receptor amostra azul para rootemperatura m antes do teste. A base de teste de laranja pode ser testada, sem a necessidade de aquecer até à temperatura ambiente. </li><li> Deixe todas as peças de teste no embrulho folha até imediatamente antes da utilização. Ligue o instrumento pressionando o botão de energia no lado do instrumento. Digite o user-ID e pressione &quot;OK&quot;. </li></ol> 2. A execução do teste <ol><li> Para iniciar o processo de teste, toque em &quot;Run Test&quot; na tela do instrumento. Digite o ID do paciente usando o teclado na tela ou scanner de código de barras e pressione &quot;OK&quot;. Abra a tampa e insira a base de teste laranja no suporte base de teste da Orange. </li><li> Confirmar que o teste correto é exibido na tela e pressione &quot;OK&quot;. Insira o receptor amostra azul no suporte do receptor amostra azul. NOTA: Não abra o receptor da amostra antes de colocar no instrumento, pois isso vai impedir que o tampão de eluição de atingir a temperatura de funcionamento correto e pode afetar o desempenho do teste. </li&gt; <li> Aguarde até que o receptor de exemplo para aquecer. Quando solicitado pelo instrumento, remover o selo de alumínio e coloque o cotonete doente a ser testado para o receptor da amostra. NOTA: Quando retirar o papel alumínio, coloque dois dedos sobre a borda do Receptor de exemplo para garantir que ele permanece no lugar. </li><li> Misture vigorosamente o cotonete no líquido durante 10 segundos, pressionando a cabeça cotonete contra a parede do receptor da amostra como você misturá-lo para ajudar a desalojar a amostra do cotonete. Pressione &quot;OK&quot; para prosseguir. Se o teste compressas armazenados em meio de transporte viral, vortex da VTM por 10 segundos, em seguida, adicione 200 mL para o receptor da amostra. </li><li> Pressionar o cartucho de transferência de branco para o receptor da amostra azul. Continue pressionando no receptor da amostra até que o indicador laranja sobe. </li><li> Levante e depois ligar o cartucho de transferência para a base de teste. Observe o indicador de laranja descer assim que a transferência cartucho está ligado corretamente. Feche a tampa e não abra até que o &quot;Teste completo&quot;mensagem aparece na tela. </li></ol> 3. Controlo de Qualidade <ol><li> Toque &#39;Run QC Test&#39; na tela inicial. Selecione o teste QC a ser executado. Confirme o tipo de teste para coincidir com a amostra QC destinado a testes tocando &#39;OK&#39; e seguir as instruções na tela para completar o teste. </li></ol> 4. Resultado Interpretação <ol><li> Após a execução do teste é completa, observar os resultados do teste apresentado no ecrã com as interpretações para a presença de Influenza A, B, subtipos desconhecidos. Para resultados inválidos repetir o teste. </li></ol> 5. Manutenção e Limpeza <ol><li> Limpar o aparelho e da área de banco circundante diariamente com 70% de etanol ou uma solução de lixívia a 10%. Pulverizar a solução de limpeza em um pano úmido, sem fiapos para limpar. Não deite as soluções diretamente no aparelho. </li></ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Prevention+control+of+seasonal+influenza+with+vaccines.+Recommendations+of+the+Advisory+Committee+on+Immunization+Practices--United+States%2C+2013-2014%22">Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices--United States, 2013-2014</a>. , Report No. 1057-5987 1-43 (2013).</li>
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<li>Leonardi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+2009+H1N1+influenza+A+virus+using+fluorescent+antibody+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods.</a> Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).</li>
<li>Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+Rapid+Influenza+Diagnostic+TestsA+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis.</a> Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).</li>
<li>Lee, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+rapid+diagnostic+test%2C+NanoSign%28R%29+Influenza+A%2FB+Antigen%2C+for+detection+of+the+2009+pandemic+influenza+A%2FH1N1+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses.</a> Virol J. 7, 244(2010).</li>
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<li>Teo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VereFlu%E2%84%A2%3A+an+integrated+multiplex+RT-PCR+and+microarray+assay+for+rapid+detection+and+identification+of+human+influenza+A+and+B+viruses+using+lab-on-chip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology.</a> Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).</li>
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<li>Chidlow, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+real-time+reverse+transcriptase+PCR+assays+for+rapid+detection+and+identification+of+pandemic+%28H1N1%29+2009+and+seasonal+influenza+A%2FH1%2C+A%2FH3%2C+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses.</a> J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).</li>
<li>Bell, J. J., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Alere+I+influenza+A%26B+nucleic+acid+amplification+test+by+use+of+respiratory+specimens+collected+in+viral+transport+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium.</a> J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).</li>
<li>Nie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Alere+i+Influenza+A%26B+for+Rapid+Detection+of+Influenza+Viruses+A+and+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).</li>
<li>Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+the+Molecular+Alere+i+Influenza+A%26B+Test+Compared+to+That+of+the+Xpert+Flu+A%2FB+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay.</a> Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os vírus da gripe são causas mundiais de morbidade e mortalidade. diagnóstico rápido e preciso da gripe é uma das principais chaves para gerir surtos de gripe durante a temporada respiratória. Outros testes à base de antigene é rápido e fácil de realizar; no entanto, eles têm baixa sensibilidade 13. Por outro lado, os testes moleculares tradicionais têm melhorado a sensibilidade, mas requerem técnicos de laboratório mais experientes para realizar e são mais dispendiosas. O ensaio de Influenza A e...

Infecções de vírus da gripe resultar em uma quantidade significativa de morbidade e mortalidade em cada ano 1, 2, 3. Influenza não complicada é caracterizada por sintomas respiratórios e constitucionais, tais como febre, mialgia, dor de cabeça e tosse não produtiva 4, 5. Os indivíduos mais velhos, crianças, doentes imunocomprometidos e pacientes com comorbidades subjacentes correm um risco maior de complicações graves, como pneumonia, miocardite, doença do sistema nervoso central, ou morte 6, 7. Infecção por influenza é original de outros vírus respiratórios em que a administração rápida de terapêutica antiviral dentro de 48 h do início dos sintomas pode reduzir a gravidade da doença e comprimento 8. A identificação rápida da gripe, também tem sidomostrado para reduzir o uso de antibióticos desnecessários 9, 10. Além disso, pacientes hospitalizados com infecções de gripe devem ser colocados em quartos isolados com precauções de controle de infecção apropriadas. No entanto, doenças respiratórias provocadas por vírus influenza não pode ser difícil distinguir clinicamente de gripe. Por esse motivo, os testes de diagnóstico rápidos e precisos para a gripe é muito importante para a gestão clínica do paciente. Vários ensaios estão disponíveis para a detecção e identificação dos vírus da gripe. Os testes de detecção de antígeno da gripe rápidas (RIDTs) são amplamente utilizados na prática clínica como testes point-of-care, porque eles são simples de usar e fornecer resultados dentro de 15 a 30 min 11, 12; no entanto, as suas sensibilidades variam muito (10-80%), dependendo do fabricante e da população que está sendo testado, eo tipo de gripe e subtyPE 13, 14, 15. Ensaios de fluorescência direta (DFAS) fornecem sensibilidades superiores sobre RIDTs, mas o tempo de processamento é maior (~ 3 horas) e deve ser concluída por técnicos qualificados 16, 17. A cultura viral tem sido o padrão ouro para o diagnóstico da gripe e melhorou a sensibilidade sobre ambos os RIDTs e DFAs 18. No entanto, a cultura viral influenza pode levar de 2-14 d para completar, diminuindo sua utilidade em ajudar manejo do paciente 19. Por último, os testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT) substituíram as técnicas de cultura como o novo padrão ouro no diagnóstico da gripe. NASC são considerados como tendo a maior sensibilidade para a detecção de gripe em poucas horas. No entanto, NASC são os ensaios mais caros e exigem equipamentos e técnicos especializados para realizar 5 <sup&gt;, 20, 21, 22, 23, 24, 25. O ensaio de influenza A e B aqui descrito é o primeiro teste da gripe dispensada-CLIA molecular rápida que está prontamente disponível. Este ensaio trabalha utilizando uma Reacção nicking endonuclease de amplificação (NEAR) que utiliza amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. Este ensaio diferencia influenza A com B, requer dois minutos para configurar e processar uma amostra, e exige um total de 15 minutos para se completar. Aqui, apresentamos o protocolo para o ensaio Influenza A &amp; B. Além disso, nós fornecemos um conjunto de dados de amostra definida comparando o desempenho da Influenza A e B do ensaio de swab nasofaríngeo arquivado (NPS) amostras armazenadas em meio de transporte viral (VTM) para outro ensaio painel patógeno respiratório.

<table><tbody><tr><td>Fabricante de instrumentos</td><td></td><td>NAT-000 (Global), NAT-024 (EUA)</td><td></td></tr><tr><td>Vírus da gripe A e Kit de teste B 24</td><td>Alere</td><td>425-000 (Global), 425-024 (US)</td><td></td></tr><tr><td>Alere i Barcode Scanner</td><td>Alere</td><td>EQ001001</td><td></td></tr><tr><td>Alere Universal Printer</td><td>Alere</td><td>55115 (Global), alereiprinter&nbsp;( EUA)</td><td></td></tr> <tr><td>200 e micro; l pipeta</td><td></td><td></td><td></td>de precisão</tr><tr><td>200 &micro; l pontas</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta descartáveis</tr><tr><td>Meio de transporte viral</td><td>Remel</td><td>M4-RT</td><td></td></tr></tbody></table>

rápida detecção molecular e diferenciação de influenza vírus a e b

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

A gripe é uma doença respiratória contagiosa causada por vírus da gripe A e B em seres humanos e faz com que uma quantidade significativa de morbilidade e mortalidade a cada ano. A Influenza A e B do ensaio foi o primeiro teste molecular gripe rápida dispensada-CLIA disponível. O teste de Influenza A e B funciona através do emprego de amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. Aqui, o desempenho do ensaio de Influenza A e B em congelado, arquivado esfregaço nasofaríngeo (NPS) amostras armazenadas no meio de transporte viral (VTM) foram comparados com um ensaio de painel respiratório. O desempenho do ensaio de Influenza A e B foi avaliada por comparação dos resultados com o método de referência do painel respiratório. A sensibilidade para o vírus total de influenza A foi 67,5% (CI de 95% (IC), 56,6-78,5) e a especificidade foi de 86,9% (Cl, 71,0-100). Para os testes de vírus da gripe B, a sensibilidade e a especificidade foram de 90,2% (Cl, 68,5-100) E 98,8% (Cl, 68,5-100), respectivamente. Este sistema tem a vantagem de um tempo de teste significativamente mais curto do que qualquer outro ensaio molecular actualmente disponíveis e o processo simples, livre de pipeta é executado em um sistema totalmente integrado, fechada, de pequenas dimensões. No geral, a Influenza A e B ensaio avaliada neste estudo tem o potencial de servir como um teste de diagnóstico da gripe rápida point-of-care.

Neste estudo, os espécimes NPS arquivados foram coletadas de pacientes internados com sintomas semelhantes aos da gripe no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC), durante um surto de gripe entre 15 de dezembro de 2012 e 1º de março de 2013. Os espécimes NPS foram apresentados em 3 ml da VTM e testado como parte da prática clínica de rotina com um ensaio molecular que detecta um painel de vírus respiratórios (PR), incluindo a gripe a, a-1, a-3 e B. Durante o período do estudo, 3.6...

Descreve-se um ensaio rápido, com base molecular da gripe A e B. O ensaio detecta Influenza cada alvo dentro de 15 min, utilizando amplificação isotérmica com iniciadores específicos de influenza, seguido de detecção do alvo com as sondas farol molecular. O ensaio de Influenza A e B é de fácil utilização e necessário hands-on tempo mínimo para executar.

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

O objetivo geral deste ensaio é diagnosticar ou descartar a infecção pelo vírus influenza em pacientes que apresentam sistema respiratório. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do diagnóstico clínico, como o diagnóstico das principais causas de infecções respiratórias. A principal vantagem dessa técnica é que é um método rápido que pode ser usado em ambientes de cuidados agendados.Demonstrando o procedimento estará Sam Kaplan, um técnico do nosso laboratório. Para coletar uma amostra de swab nasal, insira o swab na narina que tem a drenagem mais visível ou que está mais congestionada. Com rotação suave, empurre o cotonete para dentro da narina até encontrar resistência e gire várias vezes contra a parede nasal antes de removê-lo lentamente da narina.Em seguida, armazene o cotonete e transporte-o em um frasco contendo três mililitros de meios de transporte viral. Em seguida, leve a amostra e o receptor de amostra azul à temperatura ambiente antes do teste. A base de teste laranja pode ser testada sem a necessidade de aquecer à temperatura ambiente.Deixe todas as peças de teste no papel alumínio até imediatamente antes do uso. Em seguida, ligue o instrumento,

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Resgate de vírus influenza A partir de DNA plasmídeo é uma técnica básica e essencial experimental que permite aos pesquisadores a gripe para gerar vírus recombinante para estudar os múltiplos aspectos da biologia do vírus da gripe, e para ser usado como vetores potenciais ou vacinas.

Geração de recombinante do vírus Influenza de DNA plasmidial

ampliPHOX tecnologia de detecção colorimétrica é apresentado como uma alternativa barata para detecção de fluorescência para microarrays. Com base na fotopolimerização, ampliPHOX produz spots polímero sólido visível a olho nu em apenas alguns minutos. Resultados são então fotografada e automaticamente interpretados com um pacote de software simples, mas poderosa.

ampliPHOX Detecção colorimétrica em um Microarray de DNA para Influenza

Um método simples blot slot foi desenvolvido para a quantificação da gripe hemaglutinina e neuraminidase viral utilizando anticorpos universal, direccionado para suas seqüências mais conservadas identificados através de análises de bioinformática. Esta abordagem inovadora pode fornecer uma alternativa útil para determinação quantitativa de todos os hemaglutinina e neuraminidase viral.

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Este estudo descreve o diagnóstico de influenza aviária em aves selvagens usando um sistema rRT-PCR portátil. O método aproveita liofilizadas reagentes para a tela aves selvagens em um ambiente não-laboratorial, típico de um cenário de surto. Uso de ferramentas moleculares oferece alternativas precisas e sensíveis para o diagnóstico rápido.

Diagnóstico rápido de vírus da gripe aviária em aves selvagens: o uso de um Portable rRT-PCR e liofilizados Reagentes no Campo

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

O vídeo demonstra um ensaio para quantificar os vírus influenza A e B. Este ensaio emprega amplificação de endonuclease de corte com primers específicos para influenza e detecção de alvos usando sondas de farol molecular.

Um ensaio de base molecular para quantificar os vírus influenza A e B

Um chip microfluídico integrado termoplástico tem sido desenvolvido para utilização como um diagnóstico molecular. O chip realiza a extracção dos ácidos nucleicos, a transcriptase reversa, e PCR. Os métodos para fabricar e executando o chip encontram-se descritos.

Fabricação de chips microfluídicos e método para detectar a gripe

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Descreve-se a utilização de um ensaio de inibição da neuraminidase à base de fluorescência fenotípica para avaliar a susceptibilidade de vírus influenza A e B para a classe dos inibidores da neuraminidase de medicamentos antivirais.

-Fluorescência baseado Neuraminidase Ensaio de Inibição Para avaliar a susceptibilidade do vírus influenza A de neuraminidase Inibidor de Classe Antivirais

Nós apresentamos um protocolo para usar um microarray da proteína construído imprimindo antígenos da gripe em corrediças nitrocelulose-revestidas para sonda simultaneamente o soro para isotipos múltiplos do anticorpo de encontro a mais de 250 antígenos das tensões diferentes do vírus, assim permitindo a medida da amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus.

Uso de um microarray do antígeno da gripe para medir a amplitude de anticorpos do soro através dos subtypes do vírus

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Aprenda a realizar detecção molecular rápida de Influenza A e B usando amplificação isotérmica e sondas beacon. Este método de 15 minutos melhora o diagnóstico clínico de infecções respiratórias.

Rápida Detecção Molecular e diferenciação de Influenza vírus A e B

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