Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

O objetivo geral desse processo de funcionalização de superfície de vidro é permitir a captura e liberação suave de células de interesse. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de angiogênese tumoral, possibilitando a triagem de biomarcadores celulares que indiquem resistência a fármacos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é totalmente personalizável, para praticamente qualquer tipo celular de interesse.

Desde que exista um anticorpo específico para o tipo celular, a superfície pode ser adaptada para sua captura. Embora este método possa fornecer informações sobre a angiogênese no câncer, ele também pode ser aplicado a outras doenças, já que amostras purificadas são necessárias para o desenvolvimento de tratamentos mais personalizados. Tivemos a ideia inicial deste método ao tentar desenvolver um mecanismo reversível de liberação para captura de células, utilizando a interação entre desthiobiotina e a família avidina.

Após limpar uma superfície de vidro em uma máquina de plasma de oxigênio por cinco minutos de acordo com o protocolo descrito, prepare 2,5 mililitros de uma solução de 3-Aminopropil trietoxissilano (APTES) reconstituído a 2%, combinando 50 microlitros de APTES e 2,45 mililitros de etanol em um tubo cônico. Pipete a solução de APTES sobre as superfícies de vidro, cubra-as e coloque-as em um agitador orbital à temperatura ambiente por 50 minutos para distribuir uniformemente a camada de APTES. Enquanto isso, preaqueça o forno a 55 graus Celsius para as placas de oito e 24 poços, ou a 90 graus Celsius para as placas de vidro.

Após remover as placas do agitador, use etanol para enxaguar as superfícies de vidro de acordo com o protocolo descrito no texto. Com gás nitrogênio a 100%, seque as superfícies. Em seguida, coloque as placas de oito e 24 poços no forno por duas horas, ou as placas de vidro no forno por uma hora.

Em seguida, prepare 2,5 mililitros de d-Desthiobiotina, ou solução de DSB, misturando 1,5 miligramas por mililitro de DSB em 37,5 microlitros de DMSO, e adicionando cinco miligramas por mililitro de EDC a 2.462,5 microlitros de tampão MES 0,1 Molar, pH 6. Em seguida, combine as duas soluções. Após 15 minutos, adicione um microlitro de BME para interromper a reação entre DSB e EDC.

Retire as superfícies de vidro funcionalizadas com APTES quentes do forno e deixe-as esfriar por cinco a dez minutos. Adicione tampão MES às superfícies de vidro para lavá-las, segurando a pipeta em um ângulo de 70 graus, de modo que a ponta não fique diretamente apontada para a superfície. Em seguida, descarregue e aspire o tampão de um ponto fixo, como o canto do poço.

Em seguida, use o tampão MES para lavar mais duas vezes. Aplique a solução DSB nas superfícies de vidro. Transfira-as para uma toalha de papel úmida dentro de uma placa de Petri, cubra a placa e incube na geladeira por 18 a 24 horas.

Após a incubação a quatro graus Celsius, use PBS para lavar cada superfície de vidro três vezes, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, dilua a estreptavidina, ou solução estoque de SAV, até 0,4 miligramas por mililitro e aplique-a uniformemente sobre as superfícies de vidro de modo que se forme uma camada fina. Após a incubação do vidro por 18 a 24 horas, use 150 microlitros de PBS para lavar cada superfície três vezes.

Em seguida, umedeça uma toalha de papel com água desionizada e coloque-a plana em uma placa de Petri de 14 centímetros ao redor das placas para reter a umidade nas cavidades. Cubra a placa de Petri com as superfícies de vidro e coloque-a em uma geladeira de nível de biossegurança 1 a quatro graus Celsius até o momento do uso. Para realizar a captura celular, aspire o meio dos frascos T175 de células.

Em seguida, use PBS para lavar as células e aspire o tampão. Adicione 10 mililitros de um agente de desanexação não enzimático, como a Solução de Dissociação Celular, ao frasco. Incube então a 37 graus Celsius por seis minutos.

Após seis minutos, adicione 10 mililitros de HBSS frio para diluir o agente de desanexação. Em seguida, pipete 20 microlitros das células e utilize um hemocitômetro para contá-las. Centrifugue a suspensão celular a 500 × g, a quatro graus Celsius, por cinco minutos.

E utilize HBSS para ressuspender as células em uma concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Pipete para cima e para baixo para ressuspender completamente as células na solução e reduzir a formação de agregados celulares, que pode diminuir a ligação do anticorpo. Em seguida, divida a suspensão celular em soluções separadas de controle e experimental.

Adicione os anticorpos biotinilados às soluções respectivas de células e incube em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 30 minutos. Utilize 150 microlitros de HBSS para lavar o vidro funcionalizado em placas de oito poços três vezes, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Adicione a solução celular aos poços e incube em gelo no agitador por 45 minutos.

Enquanto isso, prepare uma solução de 20 milimolar de biotina em HBSS estéril. Em seguida, após a incubação, use suavemente 150 microlitros de HBSS para lavar a solução celular do vidro. Após repetir a lavagem mais duas vezes, adicione 150 microlitros da solução de biotina a cada poço de liberação correspondente e incube por 20 minutos para permitir que a reação prossiga.

Recupere as células ligadas de forma não específica utilizando HBSS para lavar as células. Em seguida, prossiga para a imagem e análise de fluorescência conforme o protocolo descrito no texto. Inclua imagens de células vivas em um frasco como controle.

Neste experimento, células MCF7GFP foram expostas à superfície funcionalizada. 60% das células foram capturadas utilizando o anticorpo HLA-ABC. Após exposição a 20 milimolares de biotina, 80% das células capturadas foram liberadas.

Como mostrado aqui, quando as células MCF7GFP foram misturadas com as células RAW 264,7, 50% dos macrófagos RAW foram capturados, e a adição de 20 micromolar de biotina liberou posteriormente 80% das células RAW capturadas. Esta figura ilustra que os macrófagos RAW do controle positivo não apresentam atividade fluorescente. No entanto, as células MCF7GFP do controle negativo são positivas para fluorescência GFP.

Como o excesso de anticorpo pode reduzir a captura celular, a concentração de anticorpo foi otimizada por meio de titulação de zero a 10.000 nanogramas por mililitro de anticorpo HLA. Os resultados mostraram que a concentração ideal de anticorpo estava entre 100 e 1.000 nanogramas por mililitro. Além disso, experimentos de otimização celular determinaram que a concentração ideal de células que podem ser capturadas está entre um vezes 10 à quinta e um vezes 10 à sexta células, já que quantidades abaixo desse número são inferiores ao fundo.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, com menos de seis horas de tempo experimental, sem incluir as incubações noturnas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de coletar as lavagens celulares durante os experimentos, pois elas podem fornecer informações vitais sobre a eficácia da superfície. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como os níveis de expressão de receptores que as células de interesse possam ter.

Após seu desenvolvimento, a funcionalização de superfícies abriu caminho para pesquisadores na área de biomateriais explorarem a integração biossegura de materiais, como implantes em pacientes para diversas doenças e lesões. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como funcionalizar quimicamente superfícies de vidro para capturar e liberar células de interesse, permitindo análises posteriores. Não se esqueça de que trabalhar com células vivas em azida de sódio pode ser extremamente perigoso, e precauções como treinamento adequado, EPIs e descarte correto devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.