Name: Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprenda um método de funcionalização de superfície de vidro para isolamento celular suave usando destiobiotina e estreptavidina. Esta técnica personalizável permite capturar e liberar células específicas, auxiliando no estudo da angiogênese tumoral e resistência a medicamentos.

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Gostaríamos de agradecer à American Cancer Society, Illinois Division (282802) e à National Science Foundation CBET (1512598) pelo apoio financeiro. Também gostaríamos de agradecer à Dra. Dianwen Zhang, do Instituto Beckman da Universidade de Illinois, pelo treinamento em microscopia. Por fim, gostaríamos de agradecer a Jared Weddell, Stacie Chen e Spencer Mamer pelas discussões perspicazes.

1. Limpar a superfície de vidro e preparação de reagentes <ol><li> Colocar uma superfície de vidro numa máquina de plasma de oxigénio durante 5 min a 50% de potência para o limpar. </li><li> Prepare reconstituída (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) solução de 2,5 ml de 2%, por adição de 50 ul de APTES e 2,45 ml de etanol num tubo cónico. </li></ol> 2. APTES e DSB funcionalização <ol><li> Adicionar solução APTES para as superfícies. Pipete 150 pi por poço para 8 placas de poços. Pipetar 100 ul por poço de placas de 24 poços. Pipetar 1,1 ml para pratos de vidro de 60 x 15 mm. Cobrir as superfícies para evitar a evaporação e distribuição desigual de solução APTES. Coloque as superfícies num agitador de plataforma durante 50 min à temperatura ambiente, o que cria uma distribuição uniforme da camada de APTES. NOTA: APTES é um aminosilano que forma a primeira camada de superfície. Se utilizar uma superfície diferente, heuristicamente determinar o volume de solução necessário para cobrir a superfície. </li><li> Seleccionar a temperatura para o forno, ao passo que as superfícies estão no agitador: Aquece-se a 55 ° C durante 2 h para as placas de poços e 8 placas de 24 poços. vidro de calor apenas pratos a 90 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavar as superfícies com etanol. <ol><li> Administrar a quantidade de etanol necessária referenciando baseado na superfície usado. Adicionar 150 ul de etanol a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de etanol a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de etanol para pratos de vidro. </li><li> Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Lavar mais duas vezes com etanol. NOTA: Se qualquer um dos vidro placas bem inferior têm todo o plástico em si, não aquecê-los acima de 65 ° C, como o plástico vai começar a derreter e deformar. </li></ol></li><li> Seco com gás de azoto a 100% dispensado a partir de um tanque. Coloque as superfícies no oven. </li><li> Preparar 2,5 ml de uma solução de d-destiobiotina (DSB) através da combinação de 1,5 mg / ml de DSB em 37,5 ul de dimetil sulfóxido (DMSO), e 5 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) em 2462,5 ul da 0,1 M de 4-morpholinoethanesulfonic hidrato de ácido (MES) (6 pH) tampão. Em seguida, combinar as duas soluções. </li><li> Adicionar 1 ml de 2-mercaptoetanol β, após 15 min, à solução para extinguir a reacção entre OSC e EDC. Remover APTES quentes funcionalizados superfícies de vidro do forno. Aguarde 5-10 min para as superfícies de vidro para esfriar. </li><li> Adicionar tampão MES a superfície de lavar, utilizando-se quantidades com base na superfície. Adicionar 150 mL de tampão MES a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de tampão MES a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de tampão MES para pratos de vidro. </li><li> Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não está apontado directamentena superfície. Lavar mais duas vezes com tampão MES. </li><li> Aplicar a solução ORL-se às superfícies para permitir a incubar. Adicionar 150 ul de solução de DSB por poço para 8 placas de poços. Adicionar 100 ul de solução de DSB por poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de solução de pratos DSB vidro. </li><li> Coloque as superfícies de vidro DSB cobertos em uma toalha de papel úmido dentro de uma placa de Petri. Cobrir e incubar em um 4 ° C geladeira por 18-24 horas. </li></ol> 3. Estreptavidina funcionalização <ol><li> Lavar cada superfície de vidro três vezes com 1 ml de 1,0 x tampão fosfato salino (PBS). Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Diluir a solução estreptavidina (SAv) estoque para 0,4 mg / ml (recomendado). NOTA: PBS é isotónica para que ele possa ser utilizado como um meio de diluição e de enxaguamento. PBS é utilizado como um solvente para o SAv, e, portanto, não afecta a capacidade do SAV para se ligar à superfície. </li><li> Aplicar 0,4 mg / ml de solução SAv uniformemente às superfícies de modo a que uma fina camada de formas na parte inferior do vidro, seleccionar a quantidade de solução base na superfície. Para 8 placas de poços, adicionar solução SAv 150 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para placas de 24 poços, adicionar solução SAv 100 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para pratos de vidro, adicione 1,1 ml 0,4 mg solução SAv / ml. </li><li> Cubra e mover as placas para uma 14 centímetros de Petri para reter a umidade. Incubar a placa de Petri na geladeira por 18-24 horas. NOTA: É essencial utilizar volumes consistentes de APTES, DSB, e SAv em cada superfície. </li><li> Lavar cada superfície de vidro três vezes com 150 ul de PBS para remover SAv. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. </li><li> Umedeça uma toalha de papel wom água deionizada e coloque a toalha de papel plana em 14 centímetros de Petri em torno das placas de reter a umidade nos poços. Cobrir a placa de Petri contendo os poços. Incubar a placa de Petri em um 4 ° C Nível de Biossegurança 1 (BSL-1) geladeira até ser necessário. </li></ol> 4. Captação celular and Release <ol><li> Comece com balão T175 (s) de células destinadas para a experiência. Aspirar a mídia do frasco (s). Lavar a mídia restante com 5 ml de temperatura ambiente PBS. Aspirar PBS do frasco (s). </li><li> Adicionam-se 10 ml de agente de elevação não-enzimática, tal como células de dissociação da solução, para o frasco T-175 de células. Colocar o frasco no incubador durante 6 min para permitir a elevação de células a partir do frasco. </li><li> Após 6 min, adicionar 10 ml de solução salina equilibrada fria de Hank (HBSS; Veja Lista de Materiais) para inactivar o agente de elevação. Retire 20 uL de células para contar o número de células em solução, utilizando um hemacitómetro. NOTA: Dependendo do funcsuperfícies utilizadas na experiência de captura tionalized, o número de células necessário varia. Para funcionalizados 8 placas de poços, usar 300.000 células por poço. Para pratos de vidro funcionalizadas, usar 1,1 milhões de células. Para funcionalizados placas de 24 poços, 125000 células são recomendados. Mais informações sobre a contagem de células é encontrada no suplemento. </li><li> Repita os passos 4.1- 4.3 para outro frasco de células, se menos células estão presentes do que o necessário para o experimento. Combinar as suspensões de células e as células contam à obter o número total de células em solução. </li><li> Girar suspensão de células numa centrífuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para obter um pellet de células concentradas. Localizar a quantidade apropriada de HBSS para adicionar à suspensão de células para obter uma concentração de 1 x 10 6 culas por ml, em seguida, aspirar o sobrenadante das células centrifugadas, e adicionar o volume calculado. Este volume pode ser calculada usando as equações no suplemento. </li><li> Pipeta cima e para baixo (triturado) para voltar a suspender the células em solução e reduzir a aglomeração celular na solução que pode reduzir a ligação do anticorpo. Dividir a solução celular no controle separado e soluções experimentais. Ver Arquivo Suplementar para componentes e cálculos. </li><li> Adicionar os anticorpos biotinilados às respectivas soluções de células como descrito no ficheiro suplementar. Incubar durante 30 min a 4 ° C num misturador de extremidade-sobre-extremidade. NOTA: Para as células MCF7GFP, 0,5 mg / ml de hlgG ou anticorpos / ml de HLA-ABC 0,5 mg são recomendados. Para macrófagos RAW, 1 mg / ml mCD11b são recomendados pela metade do volume para explicar as diferenças de diluição. No caso de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), 0,5 mg / ml de hCD31 é recomendado. </li><li> Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS. Para esta experiência, uma placa de 8 também é aconselhável. <ol><li> Adicionar 150 uL de HBSS a cada poço para 8 placas de poços. Lavar mais duas vezes usando HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço.Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Manter frio a 4 ° C. </li></ol></li><li> Adicionar soluções de células aos poços e esperar 45 minutos para as células a incubar em gelo no agitador. Adicione a solução de biotina em HBSS estéril usando volumes calculados como descrito no suplemento. </li><li> Remover a solução de células dos poços de vidro usando HBSS. <ol><li> Gentilmente pipeta 150 uL de HBSS a cada poço. Em seguida, pipetar a HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. </li><li> Repita mais duas vezes. Após lavagem, adiciona-se aos poços de HBSS para manter as células húmidas. </li></ol></li><li> Adicione 150 ml de solução de biotina 20 mM a cada liberação respectivo bem, e depois esperar 20 min para permitir a reação. </li><li> Recordar células não-especificamente ligados por lavagem com HBSS como indicado acima, e em seguida, se usando células marcadas por fluorescência, proceder a fluorescência das células imagem. Também imagem de células vivas em um recipiente de vidro (como um controlo, para comparar com as células no poço). Se utilizando células transfectadas verdes proteína fluorescente (GFP), a excitação vai ser 470 nm, e a emissão será 515 nm. </li></ol> 5. Anticorpo Optimization: Antibody Titulação <ol><li> Começar por levantar as células do frasco T75 T175 ou como explicado no passo 4.1- 4.3. NOTA: Estes volumes são calibrados para placas de 24 poços, mas pode ser alterado para se adequar a qualquer superfícies de vidro funcionalizadas através de testes heurística. Uma titulação de anticorpos representativo é mostrado na Figura 1. </li><li> Contagem de células usando o hemacitómetro, e depois girar a solução de células num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml, utilizando os cálculos descritos no suplemento. </li><li> Dividir a 1 milhões células por ml de solução em seis soluções diferentes de 500 ul em diferentes tubos de centrifugação para o anticorpo (Ab) soluções. <ol><li> Dilui-se a solução stock de anticorpo de 10 ug / mL, 1 ug / mL, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Criar os controles, utilizando 100 ul de tampão de coloração (PBS + 1% de azida de sódio + BSA a 1%), e 500 ul de células de controlo sem Ab nele. Para o controlo em branco (n AB e não células), utilizar uma solução de 300 ul de PBS. NOTA: CUIDADO: A azida de sódio é extremamente tóxico, explosivo e extremo cuidado deve ser tomado quando usá-lo. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) e usar o equipamento de segurança apropriado. </li></ol></li><li> Combinar e incubar as soluções ab com as soluções de células no misturador de extremidade-sobre-extremidade a 4 ° C durante 30 min. Lavar as placas de 24 poços funcionalizados com HBSS três vezes. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Segure o pipette num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. </li><li> Alíquotas de 125 ul de cada solução de amostra para os APTES apropriadas, DSB, e SAv funcionalizado bem. Incubar a 4 ° C ou sobre gelo durante 45 min sobre a superfície de vidro. Lavar a superfície com HBSS três vezes para remover as células não especificamente ligados. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Não lave a linha de fundo, como aqueles são os controles. </li><li> Adicionar 150 mL de HBSS a cada poço lavado, coloque as placas de 24 poços em gelo, e então usar um leitor de placas para medir a fluorescência das células GFP (excitação 485 nm / emissão de 528 nm). </li></ol> Optimization 6. celular: Titulação celular <ol><li> Levantar as células como mencionado nas etapas 4.1 -4,3. </li><li> Contagem de células utilizando um hemacitómetro. Spin down celular paralução num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml. NOTA: Para mais informações sobre a utilização do hemacitómetro pode ser encontrado no suplemento. </li><li> Pipeta de 1,6 ml da solução de células para o estoque de 1,6 milhões de células e coloque em um tubo cônico. Pipetar 800 ul de células a partir da solução de células para o estoque de 800.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 80 mL do estoque de células para o estoque de 80.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 8 mL do estoque de células imagens 8.000 células e coloque em um tubo cônico. NOTA: As concentrações são dadas por 8 medições de placa bem, replicar, conforme necessário. Um exemplo de saída da placa é mostrado na Figura 2. </li><li> Aqui as quatro soluções de reserva e girar num centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Re-suspender todas as soluções estoque em 400 mL de HBSS. </li><li> Adicionar 1,6 mL de anticorpo ng / ml 100 ao estoque de 1,6 milhões de células, 0,8 μl ao estoque de 800.000 células, e 0,5 l para todas as outras reservas. Incubar o anticorpo durante 30 min no misturador de extremidade-sobre-extremidade durante 30 minutos a 4 ° C. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS três vezes. NOTA: A placa de funcionalizado 8 é recomendado para quantificação microscopia, enquanto que a placa de 24 poços funcionalizado é recomendado para quantificação leitor de placas. Concentração de anticorpo para estoque de células 8000 não foi reduzida para permitir que o factor limitante da superfície de captura para não ser a falta de anticorpos em solução, mas as propriedades de captura de superfície. </li><li> Aplicar 150 ul das soluções de amostra a cada poço. Aplicar o estoque de 1,6 milhões de célula para a primeira coluna de poços à esquerda. Aplicar o banco de 800.000 células para a segunda coluna a partir da esquerda. Aplicar o banco de células de 80.000 para a terceira coluna da esquerda. Finalmente, aplicar o estoque 8000 células para a última coluna. Incubar durante 45 min a 4 ° C num agitador. NOTA: O 1,6 milhãoda célula serve como a concentração mais alta a ser testada, e é o dobro da quantidade de células que é utilizado normalmente em experiências de separação de células (600.000 células por poço) O estoque 800000 célula serve como controlo para a experiência, uma vez que é a concentração celular típica que é usada em experiências de separação de células (3.000.000 células por poço). O estoque de 80000 células serve como uma diluição de dez vezes para testar para concentrações mais baixas para captura celular (30.000 células por poço). O estoque de células 8000 serve como uma diluição de cem vezes para usar como um teste para verificar o limite inferior da separação celular (3.000 células por cavidade). </li><li> Enxágüe com HBSS três vezes. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Colete todas as lavagens. </li><li> Imagem as células em um microscópio de fluorescência, se utilizando 8 pratos bem, tirar fotos de cada surrosto, e aplicam-se 150 ul a cada superfície biotina durante uma hora a 4 ° C num agitador. Após uma hora, lavar os poços de libertação de biotina com HBSS 3 vezes como antes. Recolha todas as lavagens de poços para contar com o hemocitômetro e da imagem dos poços de libertação. </li><li> Aplicar 150 mL de solução de biotina excesso de 20 mM a cavidades apropriadas de liberação de biotina, durante 1 hora, se estiver usando placas de 24 poços, e depois enxaguar esses poços 3 vezes com HBSS. Quantificar placas de 24 poços utilizando um leitor de placas. Usar um hemacitómetro para contar as células de todas as lavagens assim recolhidos. </li></ol> Análise 7. Imagem Nota: O pacote de software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) é recomendado para análise de imagem. Inicialmente, as imagens foram convertidas em imagem em tons de cinza, e então o brilho / contraste foi alterado para trazer para fora das células. <ol><li> Carregar a imagem, e converter em tons de cinza, clicando na guia imagem, em seguida, role para baixo até &quot;Type&quot; e clicando em4; 8 bit &quot;. </li><li> Aumentar o contraste da imagem clicando na guia de imagem e, em seguida, deslocando-se para &quot;Ajuste&quot;. Clique em &quot;Brilho e Contraste&quot; e use as barras de rolagem para fazer as células se destacam. Se estiver usando imagens de fluorescência, inverter as imagens para tornar as células mais definidos. </li><li> Carregar um plug-in para ImageJ chamado ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) para analisar as imagens. </li><li> Abrir ITCN. Quando uma caixa de diálogo que pede ao utilizador com vários parâmetros para estimar o tamanho da célula, defina a largura mínima da célula de interesse em primeiro lugar. Clique na opção &quot;Detectar escuras Peaks&quot; se a imagem é fluorescente e as células são escurecidas. </li><li> Defina o valor limite a 2, inicialmente, e, em seguida, apertar o botão de &quot;Contagem&quot;. A versão recém contados da imagem aparecerá com pontos vermelhos delineando onde as células foram contadas. </li><li> Ajuste o parâmetro de limite e largura para obter dados mais precisos celulares por defining do tamanho de uma &quot;célula&quot;. Nota: O número de células contadas será em uma caixa de diálogo à direita. alteração de parâmetros dará número diferente de células contadas. </li><li> Continuar a percorrer os parâmetros de limites e de largura até que uma boa estimativa é alcançado para o número de células. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Melhorias nas técnicas de isolamento de células promove estudos científicos em relações estrutura-função em neurociência 18, caule de programação celular em biologia regenerativa, e sinalização angiogênico em biologia vascular 19. De facto, a cultura de células primária 20 (por exemplo, células HUVEC) em biologia vascular é feito principalmente por meio do uso de técnicas de isolamento de células. Isolamento celular também foi usada recentemente para o fluxo quantitativo (qFlow)...

De bancada abordagens de separação de células atuais (por exemplo, de células activadas por fluorescência 1, captura a laser micro-dissecção 2, talão de separação imuno-magnética 1) pode levar várias horas de preparação e triagem. Estes grandes escalas de tempo podem afetar os níveis de resposta e expressão fisiológicos, resultando em análises que não são representativas da resposta fisiológica 3. São necessários sistemas que podem rapidamente e eficientemente isolar tipos de células específicas, sem perturbar os níveis de receptor de superfície celular a fim de melhorar o isolamento de células e de enriquecimento para aplicações biomédicas. Portanto, a justificativa para nossa abordagem é desenvolver uma abordagem suave para o isolamento de células. O &quot;laboratório em um chip&quot; conceito oferece a promessa de ordens de magnitude mais rápido isolamento de células (horas-a-minutos), e mais frequentemente envolve a captura de células em uma superfície e células ou conte intracelular liberandoNTS através física 4,5 ou métodos químicos 6. Embora estas abordagens oferecem algumas vantagens, tais como a identificação de expressão de proteína de 7,8, identificando a expressão do ARN de 9-11, ou mesmo proporcionar células para a cultura in vitro 12,13, muitas destas técnicas não pode ser traduzido para o diagnóstico, tais como perfis de receptor de células devido aos seus ambientes não-fisiológicos. Agentes de elevação enzimáticos, tais como colagenases podem também afectar essas quantidades de receptores de 14,15, ou seja, técnicas de quantificação receptor celular que usam esses agentes de elevação não irá gerar dados fisiológicos precisos. Lise celular impede a diferenciação entre os receptores de superfície nativas, bem como as que foram anteriormente internalizado 16. Este protocolo descreve uma abordagem rápida e suave para isolamento de células.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropil) trietoxissilano (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>Usado para fazer solução APTES a 2%</td></tr><tr><td>Plasma Cleaner Pico</td><td>Diener</td><td>Modelo 1</td><td>Limpa superfícies e permite a ligação de PDMS ao vidro</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Usado como mecanismo de liberação na superfície de captura celular.&nbsp;</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>British Drug Houses (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Dissolve o DSB em solução</td></tr><tr><td>1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>5g: 22980 25g: 22981</td><td>Ativa ácidos carboxílicos e permite a ligação de proteínas à superfície do vidro.</td></tr><tr><td>lâmina de cultura de 8 poços não revestida</td><td>BD Falcon</td><td>Caixa de 24: 354118 Caixa de 96: 354108</td><td>Usado em experimentos celulares envolvendo microscópio de fluorescência Zeiss, como experimentos iniciais de quantificação de captura e liberação</td></tr><tr><td>Placas de 24 poços com fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Usado em experimentos celulares envolvendo o leitor de placas, como experimentos de anticorpos e titulação celular</td></tr><tr><td>Mercaptoetanol</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>Usado para extinguir a reação entre EDC e DSB</td></tr><tr><td>Hidrato de ácido 4-morfolinoetanossulfônico (MES Hydrate 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>Usado para fazer 0,1 M MES Buffer para uso em reação EDC</td></tr><tr><td>Precision Oven</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>Usado na cura da camada PDMS e APTES.</td></tr><tr><td>Titramax 1000 Shaker</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>Usado para garantir a distribuição uniforme de APTES em superfícies.</td></tr><tr><td>1x Estreptavidina 5 mg [e7105-5mg]</td><td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Proteína de ligação à biotina. Pode causar irritação.</td></tr><tr><td>Prato de vidro de 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>Usado em estudos HUVEC, bem como em futuros estudos de perfil.</td></tr><tr><td>Placa de Petri de 14 cm com Tampa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>Utilizada para guardar amostras que estão sendo funcionalizadas e transportá-las.</td></tr><tr><td>Células MCF7-GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>Armazenado em nitrogênio líquido</td></tr><tr><td>RAW264.7 macrófagos de camundongo</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Presenteado a nós pelo laboratório Smith da Universidade de Illinois. Armazenado em nitrogênio líquido.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Armazenado em 100 ml à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Dulbecco' s modificado Eagle medium</td><td>Cell Media Facility na Escola de Ciências Químicas da UIUC</td><td>50003PC</td><td>Fornecedor: Corning</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Cell Media Facility na School of Chemical Sciences da UIUC</td><td>25-025-CI</td><td>Já adicionado ao DMEM pela instalação. Fornecedor: Corning.</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Pequeno 23 cm 50 pack</td></tr><tr><td>Solução de Dissociação Celular</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Usado para levantar células não enzimaticamente para uso em experimentos celulares</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Usado para contar células para quantificação de soluções celulares e efetividade de captura e liberação.</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Usado para liberar células da superfície.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Criado a partir da Receita</td><td>N/A</td><td>Usado para manter as células vivas em suspensão, bem como lavar superfícies de ligação não específica. Adaptado de Cold Spring Harbor Protocols: In 500&nbsp; ml, use 4&nbsp; g NaCl, 0,2&nbsp; g KCl, 0,0402&nbsp; g Na2PO4&#8226; 7H2O, 0,03&nbsp; g KH2PO4 e 0,5&nbsp; g de glicose. Adicione água DI para chegar a&nbsp; 500 ml, filtre e leve à geladeira.</td></tr><tr><td>Anticorpo HLA-ABC</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>Anticorpo usado para capturar células MCF7gfp</td></tr><tr><td>Anticorpo hIgG</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>Anticorpo usado para capturar células MCF7gfp</td></tr><tr><td>Células MCF7 GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>Linha de câncer de mama luminal que foi transfectada com proteína fluorescente verde.</td></tr><tr><td>Cônicas Sortidas</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>50/15 ml cônicas de plástico para armazenar soluções e alíquotas.</td></tr><tr><td>Rotadores de mini-tubo (misturador de ponta a ponta)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Usado para incubar anticorpos e misturar outras soluções celulares para misturar</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (Microscópio de Fluorescência)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Zeiss Axiovert 200 M microscópio de florescência invertida.</td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização Zeba</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Usado para purificar anticorpos recém-biotinilados após o uso do Kit de Biotinilação. Instruções fornecidas em: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Kit de Biotinilação de Baixo Peso</td><td></td><td>Termocientífico</td><td>Usado para biotinilar anticorpos para permitir que eles se integrem com a superfície de captura</td></tr><tr><td>Leitor de Placas</td> Leitor Multimodo <td>BioTek</td><td>Synergy HTX</td><td>Usado para medir quantitativamente a intensidade fluorescente nos experimentos de titulação.</td></tr></tbody></table>

um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Um dos fatores limitantes para a adoção e avanço da medicina personalizada é a incapacidade de desenvolver ferramentas de diagnóstico para sondar nuances individuais na expressão de paciente para paciente. As metodologias atuais que tentam separar as células para preencher esse nicho resultam na interrupção da expressão fisiológica, tornando a técnica de separação inútil como ferramenta diagnóstica. Neste protocolo, descrevemos a funcionalização e otimização de uma superfície para a captura e liberação celular. Esta superfície funcionalizada integra anticorpos biotinilados com uma superfície de vidro funcionalizada com um aminosilano (APTES), destiobietina e estreptavidina. A liberação celular é facilitada pela introdução de biotina, permitindo a coleta e purificação das células capturadas pela superfície. Essa liberação é feita por meio do direcionamento da porção secundária destiobiotina, o que resulta em um paradigma de liberação muito mais suave. Essa redução nos reagentes agressivos e nas forças de cisalhamento reduz as mudanças na expressão celular. A superfície funcionalizada captura até 80% das células em uma mistura de células únicas e demonstrou 50% de captura em uma mistura de células duplas. Aplicações desta tecnologia em xenoenxertos e estudos de separação de câncer são investigadas. Técnicas de quantificação para verificação de superfície, como leitor de placas e análises ImageJ, também são descritas.

Usando este protocolo que mostram captação celular (Figura 3A) e a libertação de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, bem como controlos de células vivas (Figura 4). Foram quantificados a captura celular como 60% e 80% foram liberados (Figura 3C). Quando estendido esta abordagem a uma mistura de RAW 264.7 de macrófagos e células MCF7GFP, 50% de macrófagos RAW foram capturados (Fig. 3D) e 80% de macróf...

Este protocolo descreve a funcionalização de superfície personalizável do sistema de destiobiotina, estreptavidina e APTES para isolar tipos específicos de células de interesse. Além disso, este manuscrito cobre as aplicações, otimização e verificação desse processo.

Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

O objetivo geral desse processo de funcionalização de superfície de vidro é permitir a captura e liberação suave de células de interesse. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de angiogênese tumoral, possibilitando a triagem de biomarcadores celulares que indiquem resistência a fármacos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é totalmente personalizável, para praticamente qualquer tipo celular de interesse.Desde que exista um anticorpo específico para o tipo celular, a superfície pode ser adaptada para sua captura. Embora este método possa fornecer informações sobre a angiogênese no câncer, ele também pode ser aplicado a outras doenças, já que amostras purificadas são necessárias para o desenvolvimento de tratamentos mais personalizados. Tivemos a ideia inicial deste método ao tentar desenvolver um mecanismo reversível de liberação para captura de células, utilizando a interação entre desthiobiotina e a família avidina.Após limpar uma superfície de vidro em uma máquina de plasma de oxigênio por cinco minutos de acordo com o protocolo descrito, prepare 2,5 mililitros de uma solução de 3-Aminopropil trietoxissilano (APTES) reconstituído a 2%, combinando 50 microlitros de APTES e 2,45 mililitros de etanol em um tubo cônico. Pipete a solução de APTES sobre as superfícies de vidro, cubra-as e coloque-as em um agitador orbital à temperatura ambiente por 50 minutos para distribuir uniformemente a camada de APTES. Enquanto isso, preaqueça o forno a 55 graus Celsius para as placas de oito e 24 poços, ou a 90 graus Celsius para as placas de vidro.Após remover as placas do agitador, use etanol para enxaguar as superfícies de vidro de acordo com o protocolo descrito no texto. Com gás nitrogênio a 100%, seque as superfícies. Em seguida, coloque as placas de oito e 24 poços no forno por duas horas, ou as placas de vidro no forno por uma hora.Em seguida, prepare 2,5 mililitros de d-Desthiobiotina, ou solução de DSB, misturando 1,5 miligramas por mililitro de DSB em 37,5 microlitros de DMSO, e adicionando cinco miligramas por mililitro de EDC a 2.462,5 microlitros de tampão MES 0,1 Molar, pH 6. Em seguida, combine as duas soluções. Após 15 minutos, adicione um microlitro de BME para interromper a reação entre DSB e EDC.Retire as superfícies de vidro funcionalizadas com APTES quentes do forno e deixe-as esfriar por cinco a dez minutos. Adicione tampão MES às superfícies de vidro para lavá-las, segurando a pipeta em um ângulo de 70 graus, de modo que a ponta não fique diretamente apontada para a superfície. Em seguida, descarregue e aspire o tampão de um ponto fixo, como o canto do poço.Em seguida, use o tampão MES para lavar mais duas vezes. Aplique a solução DSB nas superfícies de vidro. Transfira-as para uma toalha de papel úmida dentro de uma placa de Petri, cubra a placa e incube na geladeira por 18 a 24 horas.Após a incubação a quatro graus Celsius, use PBS para lavar cada superfície de vidro três vezes, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, dilua a estreptavidina, ou solução estoque de SAV, até 0,4 miligramas por mililitro e aplique-a uniformemente sobre as superfícies de vidro de modo que se forme uma camada fina. Após a incubação do vidro por 18 a 24 horas, use 150 microlitros de PBS para lavar cada superfície três vezes.Em seguida, umedeça uma toalha de papel com água desionizada e coloque-a plana em uma placa de Petri de 14 centímetros ao redor das placas para reter a umidade nas cavidades. Cubra a placa de Petri com as superfícies de vidro e coloque-a em uma geladeira de nível de biossegurança 1 a quatro graus Celsius até o momento do uso. Para realizar a captura celular, aspire o meio dos frascos T175 de células.Em seguida, use PBS para lavar as células e aspire o tampão. Adicione 10 mililitros de um agente de desanexação não enzimático, como a Solução de Dissociação Celular, ao frasco. Incube então a 37 graus Celsius por seis minutos.Após seis minutos, adicione 10 mililitros de HBSS frio para diluir o agente de desanexação. Em seguida, pipete 20 microlitros das células e utilize um hemocitômetro para contá-las. Centrifugue a suspensão celular a 500 × g, a quatro graus Celsius, por cinco minutos.E utilize HBSS para ressuspender as células em uma concentração de um vezes 10 à sexta células por mililitro. Pipete para cima e para baixo para ressuspender completamente as células na solução e reduzir a formação de agregados celulares, que pode diminuir a ligação do anticorpo. Em seguida, divida a suspensão celular em soluções separadas de controle e experimental.Adicione os anticorpos biotinilados às soluções respectivas de células e incube em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 30 minutos. Utilize 150 microlitros de HBSS para lavar o vidro funcionalizado em placas de oito poços três vezes, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Adicione a solução celular aos poços e incube em gelo no agitador por 45 minutos.Enquanto isso, prepare uma solução de 20 milimolar de biotina em HBSS estéril. Em seguida, após a incubação, use suavemente 150 microlitros de HBSS para lavar a solução celular do vidro. Após repetir a lavagem mais duas vezes, adicione 150 microlitros da solução de biotina a cada poço de liberação correspondente e incube por 20 minutos para permitir que a reação prossiga.Recupere as células ligadas de forma não específica utilizando HBSS para lavar as células. Em seguida, prossiga para a imagem e análise de fluorescência conforme o protocolo descrito no texto. Inclua imagens de células vivas em um frasco como controle.Neste experimento, células MCF7GFP foram expostas à superfície funcionalizada. 60% das células foram capturadas utilizando o anticorpo HLA-ABC. Após exposição a 20 milimolares de biotina, 80% das células capturadas foram liberadas.Como mostrado aqui, quando as células MCF7GFP foram misturadas com as células RAW 264,7, 50% dos macrófagos RAW foram capturados, e a adição de 20 micromolar de biotina liberou posteriormente 80% das células RAW capturadas. Esta figura ilustra que os macrófagos RAW do controle positivo não apresentam atividade fluorescente. No entanto, as células MCF7GFP do controle negativo são positivas para fluorescência GFP.Como o excesso de anticorpo pode reduzir a captura celular, a concentração de anticorpo foi otimizada por meio de titulação de zero a 10.000 nanogramas por mililitro de anticorpo HLA. Os resultados mostraram que a concentração ideal de anticorpo estava entre 100 e 1.000 nanogramas por mililitro. Além disso, experimentos de otimização celular determinaram que a concentração ideal de células que podem ser capturadas está entre um vezes 10 à quinta e um vezes 10 à sexta células, já que quantidades abaixo desse número são inferiores ao fundo.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três dias, com menos de seis horas de tempo experimental, sem incluir as incubações noturnas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de coletar as lavagens celulares durante os experimentos, pois elas podem fornecer informações vitais sobre a eficácia da superfície. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como os níveis de expressão de receptores que as células de interesse possam ter.Após seu desenvolvimento, a funcionalização de superfícies abriu caminho para pesquisadores na área de biomateriais explorarem a integração biossegura de materiais, como implantes em pacientes para diversas doenças e lesões. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como funcionalizar quimicamente superfícies de vidro para capturar e liberar células de interesse, permitindo análises posteriores. Não se esqueça de que trabalhar com células vivas em azida de sódio pode ser extremamente perigoso, e precauções como treinamento adequado, EPIs e descarte correto devem sempre ser adotadas ao realizar este procedimento.

a-method-targeted-cell-isolation-via-glass-surface

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Fonte: Fattahi, N., et al. Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias. J. Vis. Exp. (2021).Este vídeo demonstra a extração de colônias bacterianas de um hidrogel fotodegradável usando luz UV. Uma colônia específica é selecionada e uma exposição à luz padronizada é projetada para iniciar a degradação localizada do hidrogel. Após ajustar a intensidade e a duração da luz, a luz UV é aplicada, liberando a colônia. A colônia é então aspirada através de...

Isolamento de colônias bacterianas direcionadas usando degradação de hidrogel com padrão de luz

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células epiteliais de câncer que expressam EpCAM a partir de amostras de sangue periférico. A técnica envolve o uso de um fio de grau médico funcionalizado com anticorpos EpCAM para capturar as células-alvo. As células capturadas são então posteriormente extraídas para uma solução tampão.

Isolamento de células-alvo baseado em fio funcionalizado: uma técnica ex vivo para isolar células cancerígenas do sangue periférico enriquecido

Dieletroforese Contactless (CDEP) alcança a classificação e enriquecimento de partículas através de suas propriedades dielétricas intrínsecas. Canais de eletrodos fluídicos substituir os eletrodos metálicos tradicionais para DEP, adequando CDEP para não danificar caracterização estéril e classificação de partículas biológicas. Demonstramos como preparar um microdispositivo CDEP e realizar a caracterização das células e experimentos de classificação.

Isolamento livre-Label e enriquecimento de células através de contato dieletroforese

As técnicas tradicionais para a fabricação de poliacrilamida (PA) géis contendo sondas fluorescentes envolvem imprensando um gel entre uma superfície aderente e uma lâmina de vidro. Aqui, mostramos que este revestimento de lâmina com poli-D-lisina (PDL) e sondas fluorescentes localiza as sondas para dentro de 1,6 pM a partir da superfície do gel.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

O uso de hidrogéis fotodegradáveis para isolar células bacterianas utilizando uma ferramenta de pattering de luz de alta resolução é relatado. Procedimentos experimentais essenciais, resultados e vantagens do processo são revistos. O método permite o isolamento rápido e barato de bactérias-alvo que mostram funções raras ou únicas de comunidades ou populações heterogêneas.

Interfaces de hidrogel fotodegradável para triagem, seleção e isolamento de bactérias

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Aprenda um método de funcionalização de superfície de vidro para isolamento celular suave usando destiobiotina e estreptavidina. Esta técnica personalizável permite capturar e liberar células específicas, auxiliando no estudo da angiogênese tumoral e resistência a medicamentos.

Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

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