Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

O objetivo geral deste processo de funcionalização da superfície do vidro é permitir a captura e liberação suaves das células de interesse. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da angiogênese tumoral, permitindo a triagem de biomarcadores celulares que indicam resistência a medicamentos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é totalmente personalizável, para praticamente qualquer tipo de célula de interesse.

Desde que haja um anticorpo específico para o tipo de célula, a superfície pode ser adaptada para sua captura. Embora esse método possa fornecer informações sobre a angiogênese do câncer, ele também pode ser aplicado a outras doenças, pois amostras purificadas são necessárias para o desenvolvimento de regimes de tratamento mais personalizados. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando estávamos tentando desenvolver um mecanismo de liberação reversível para capturar células, usando a interação entre a destiobionitina e a família das adivinas.

Depois de limpar uma superfície de vidro em uma máquina de plasma de oxigênio por cinco minutos de acordo com o protocolo de texto, prepare 2,5 mililitros de 3-aminopropil trietoxissilano reconstituído a 2%, ou solução APTES, combinando 50 microlitros de APTES e 2,45 mililitros de etanol em um tubo cônico. Pipete a solução APTES nas superfícies de vidro, cubra as superfícies e coloque-as em um agitador de plataforma em temperatura ambiente por 50 minutos para distribuir uniformemente a camada de APTES. Enquanto isso, pré-aqueça o forno a 55 graus Celsius para os pratos de oito e 24 poços, ou 90 graus Celsius para os pratos de vidro.

Depois de remover as placas do shaker, use etanol para enxaguar as superfícies de vidro de acordo com o protocolo de texto. Com 100% de gás nitrogênio, seque as superfícies. Em seguida, coloque os pratos de oito e 24 poços no forno por duas horas, ou os pratos de vidro no forno por uma hora.

Em seguida, prepare 2,5 mililitros de d-Destiobiotina, ou solução DSB, misturando 1,5 miligramas por mililitro de DSB em 37,5 microlitros de DMSO e adicionando cinco miligramas por mililitro de EDC a 2.462,5 microlitros de tampão MES 0,1 Molar, pH 6. Em seguida, combine as duas soluções. Após 15 minutos, adicione um microlitro de BME para extinguir a reação entre DSB e EDC.

Remova as superfícies de vidro funcionalizadas APTES quentes do forno e deixe-as esfriar por cinco a 10 minutos. Adicione tampão MES às superfícies de vidro para enxaguá-las, segurando a pipeta em um ângulo de 70 graus para que a ponta não fique diretamente apontada para a superfície. Em seguida, descarregue e retire o tampão de um ponto fixo, como o canto do poço.

Em seguida, use o tampão MES para enxaguar mais duas vezes. Aplique a solução DSB nas superfícies de vidro. Transfira-os para uma toalha de papel úmida dentro de uma placa de Petri, tampe o prato e incube na geladeira por 18 a 24 horas.

Após a incubação a quatro graus Celsius, use PBS para enxaguar cada superfície de vidro três vezes, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Em seguida, dilua a estreptavidina, ou solução estoque de SAV, a 0,4 miligramas por mililitro e aplique-a uniformemente nas superfícies de vidro para formar uma camada fina. Depois de incubar o vidro por 18 a 24 horas, use 150 microlitros de PBS para enxaguar cada superfície três vezes.

Em seguida, molhe uma toalha de papel com água deionizada e coloque-a plana em uma placa de Petri de 14 centímetros ao redor das placas para reter a umidade nos poços. Cubra a placa de Petri com as superfícies de vidro e coloque-a em uma geladeira de nível 1 de biossegurança de quatro graus Celsius até que seja necessário. Para realizar a captura de células, aspirar o meio de frascos T175 de células.

Em seguida, use PBS para enxaguar as células e aspirar o tampão. Adicione 10 mililitros de agente de elevação não enzimático, como solução de dissociação celular, ao frasco. Em seguida, incube a 37 graus Celsius por seis minutos.

Após seis minutos, adicione 10 mililitros de HBSS frio para diluir o agente de elevação. Em seguida, pipete 20 microlitros das células e use um hemocitômetro para contá-las. Centrifugar a suspensão celular a 500 x g, a quatro graus Celsius, durante cinco minutos.

E use HBSS para ressuspender as células para uma vezes 10 elevado a sexta células por mililitro. Pipete para cima e para baixo para ressuspender as células em solução e reduzir a aglomeração celular que pode reduzir a ligação de anticorpos. Em seguida, divida a suspensão celular em soluções experimentais e de controle separadas.

Adicione os anticorpos biotinilados às respectivas soluções celulares e incube em um misturador ponta a ponta a quatro graus Celsius por 30 minutos. Use 150 microlitros de HBSS para lavar o vidro funcionalizado em placas de oito poços três vezes, conforme demonstrado anteriormente no vídeo. Adicione a solução celular aos poços e incube no gelo na coqueteleira por 45 minutos.

Enquanto isso, prepare uma solução 20 milimolar de biotina em HBSS estéril. Em seguida, após a incubação, use suavemente 150 microlitros de HBSS para enxaguar a solução celular do vidro. Depois de repetir o enxágue mais duas vezes, adicione 150 microlitros da solução de biotina a cada poço de liberação respectivo e incube por 20 minutos para permitir que a reação prossiga.

Colete células ligadas não especificamente usando HBSS para lavar as células. Em seguida, prossiga para a imagem e análise de fluorescência de acordo com o protocolo de texto. Incluir imagens de células vivas num balão como controlo.

Neste experimento, MCF7GFP células foram expostas à superfície funcionalizada. 60% das células foram capturadas usando o anticorpo HLA-ABC. Após a exposição à biotina 20 milimolar, 80% das células capturadas foram liberadas.

Como mostrado aqui, quando as células MCF7GFP foram misturadas com células RAW 264.7, 50% dos macrófagos RAW foram capturados e a adição de 20 micromolares de biotina posteriormente liberou 80% das células RAW capturadas. Esta figura ilustra que os macrófagos RAW de controle positivo não exibem atividade de fluorescência. No entanto, o controle negativo MCF7GFP células é positivo para fluorescência de GFP.

Como o excesso de anticorpos pode diminuir a captura celular, a concentração de anticorpos foi otimizada titulando de zero a 10.000 nanogramas por mililitro de anticorpo HLA. Os resultados mostraram que a concentração ideal de anticorpos estava entre 100 e 1.000 nanogramas por mililitro. Além disso, experimentos de otimização celular determinaram que a concentração ideal de células que podem ser capturadas é entre uma vez 10 elevado à quinta e uma vez 10 elevado à sexta células, uma vez que quantidades abaixo desse número são menores que o fundo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias, com menos de seis horas de tempo experimental, sem incluir as incubações noturnas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de coletar as lavagens celulares durante os experimentos, pois elas podem fornecer informações vitais sobre a eficácia da superfície. Após este procedimento, outros métodos, como citometria de fluxo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais níveis de expressão do receptor as células de interesse podem ter.

Após seu desenvolvimento, a funcionalização da superfície abriu caminho para pesquisadores na área de biomateriais explorarem a integração biossegura de materiais, como implantes em pacientes para uma variedade de doenças e lesões. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como a superfície funcionaliza superfícies de vidro para capturar e liberar células de interesse, permitindo a análise a jusante. Não se esqueça de que trabalhar com células vivas em azida sódica pode ser extremamente perigoso, e precauções como treinamento adequado, EPI e descarte devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.