Name: Laser de Thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a aquecer células cultivadas com laser de thulium de onda contínua para investigar respostas biológicas a exposições térmicas controladas. Este método permite estudos precisos de efeitos térmicos em células epiteliais pigmentadas da retina e outros modelos celulares.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa do Ministério Federal da Educação e Pesquisa (BMBF) (concessão nº 13GW0043C) e de um Escritório Europeu de Pesquisa e Desenvolvimento Aeroespacial (EOARD, concessão nº FA9550-15-1-0443)

1. Cultura celular RPE <ol><li> Isolamento de células RPE de olhos porcinos <ol><li> Obtenha os olhos porcinos recém-enucleados do matadouro local. Mantenha-os frescos (4 ° C) e em um ambiente escuro. </li><li> Remova os tecidos extracelulares com tesoura e remova os olhos em uma solução anti-séptica durante 5 min. </li><li> Coloque os olhos em solução salina tamponada com fosfato esterilizado sem cálcio e magnésio (PBS (-)) até o uso. </li><li> Usando um bisturi, penetre na esclerótica em cerca de 5 mm posterior ao limbo corneano. Respeite toda a parte anterior do olho cortando com tesoura todo o caminho, paralelo ao limbo corneano. </li><li> Remova a parte anterior do olho ( isto é, a córnea e a lente) e o vítreo. Adicione 1 mL de PBS (-) e remova suavemente a retina neural. NOTA: Este "copo de olho", composto pela esclerótica, coróide e RPE, está pronto. </li><li> Adicionar pré-aquecida (37 ° C) 0,25% de tripsina em PBS (-) para o copo do olho. Ajuste o volume de modo que cerca de 80% do copo de olho seja preenchido com esta solução de tripsina. </li><li> Incubar o copo de olho com a solução de tripsina em uma incubadora de CO 2 a 5% a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Retire o copo de olho da incubadora e substitua a solução de tripsina a 0,25% por uma solução de PBS (-) com 0,05% de tripsina + 0,2% de sal de tetrasodio de ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA 4N). Incube o copo do olho na incubadora por 45 minutos. NOTA: Após 45 min, as células RPE serão ligadas apenas à membrana do Bruch ou já estão destacadas e flutuando na solução tripsina-EDTA. </li><li> Recolher as células RPE por pipetagem suave. Recolher as células e a solução em um tubo cônico preenchido com 10 mL de meio de cultura (DMEM com alto teor de glicose com L-glutamina), incluindo 10% de soro porcino, antibiótico / antimicótico e piruvato de sódio (1 mM). NOTA: O soro pode neutralizar o efeito da tripsina. </li><li> Centrifugar oSuspensão celular a 400 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remova o sobrenadante e adicione 10 mL de meio fresco. Centrifugue novamente nas mesmas condições durante 5 min. </li><li> Remova o sobrenadante e adicione novo meio, de modo que a concentração celular resulte em 5 x 10 5 células / mL (determinada pela contagem das células usando um hemocitómetro). Misture bem por pipetagem suave. </li><li> Distribua a suspensão celular em pratos de cultura celular. Use 3 mL por placa de cultura de 60 mm de diâmetro. NOTA: Esta cultura é chamada passagem zero (P0). </li><li> Manter as células em uma incubadora a 5% de CO 2 a 37 ° C. Mude a metade do meio condicionado para o meio fresco a cada segundo dia. </li><li> Subcultura (passo 1.2) se se tornar confluente. </li></ol></li><li> Subcultura da cultura de células RPE <ol><li> Remova o meio de cultura e enxágue as células duas vezes com PBS (-). </li><li> Incubar as células com solução de PBS (-) com 0,05% de tripsina + 0,2% de EDTA iNa 5% de incubadora de CO 2 a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Destaque as células RPE por pipetagem suave e colecione a suspensão celular em um tubo cônico preenchido com 10 mL de meio de cultura, incluindo 10% de soro porcino. </li><li> Centrifugar a suspensão celular a 400 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Remova o sobrenadante e adicione novo meio de cultura, tornando a concentração celular 5 x 10 5 células / mL (determinada por contagem do número de células com um hemocitómetro). Distribua as células em novos pratos de cultura de 60 mm de diâmetro, como descrito no passo 1.1.13. NOTA: A cultura celular é agora passagem 1 (P1). </li><li> Após a confluência é alcançada, subcultura a cultura P1 para P2, utilizando o mesmo procedimento descrito nos passos 1.2.1-1.2.5. A partir da cultura P2, semeie as células em pratos de cultura menores (diâmetro interno de 30 mm) em vez de pratos de cultura de 60 mm de diâmetro. </li><li> Para as experiências, use culturas P2 ou P3. </li></ol></li></ol> 2. ThulIrradiação a laser <ol><li> Construção da estação de irradiação <ol><li> Conecte um dispositivo a laser thulium (1.94 μm, faixa de potência: 0-20 W) a uma fibra de diâmetro de núcleo de 0,22-NA, 365 μm. </li><li> Repara mecanicamente a ponta da fibra ao braço metálico que é fixado horizontalmente ao poste de metal vertical da estação de irradiação. Coloque a posição vertical de modo que a ponta da fibra laser esteja localizada acima da placa quente em que o prato de cultura celular deve ser colocado durante a irradiação. </li><li> Coloque um papel branco na placa quente e gire o feixe de mira em (λ = 635 nm, max = 1 mW, diâmetro no nível do papel ≈ 30 mm). Marque a circunferência do feixe de mira no papel branco, de modo que a posição em que o prato de cultura deve ser colocado durante a irradiação é conhecida. NOTA: O plano z da ponta da fibra pode ser mutável. Sem qualquer óptica de imagem adicional, o diâmetro do ponto do laser no plano da cultura celular, colocado a 12 cm abaixo da ponta da fibra, iS cerca de 30 mm, o que é quase equivalente ao diâmetro interno do prato de cultura de células. Um desenho esquemático da configuração é mostrado na Figura 1 . </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg"> Figura 1: Imagem esquemática da Estação de Irradiação a Laser Thulium. Um prato de cultura é colocado na placa de aquecimento. As células são colocadas a 12 cm abaixo da ponta da fibra de laser de thulium, de modo que o tamanho do feixe é quase idêntico ao diâmetro interno da placa de cultura (cerca de 30 mm). O procedimento de irradiação a laser é controlado por uma rotina controlada por tempo da plataforma de design de sistemas customizada. A configuração de energia deve ser determinada antes do início do programa de irradiação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <olstart> Laser irradiação da cultura celular <ol><li> 1 h antes da irradiação, substitua completamente o meio de cultura por 1,2 ml de meio fresco. NOTA: Este é um PASSO CRÍTICO e deve ser rigorosamente seguido. </li><li> Coloque a estação de irradiação ( ou seja, a placa quente e a posição com a qual fixar a fibra a laser) em um banco limpo. </li><li> Retire o prato de cultura celular da incubadora e coloque-o na posição marcada na placa quente (passo 2.1.3). </li><li> Use óculos de proteção. Ligue o laser Thulium. Ajuste o poder conforme desejado no dispositivo laser (ajustável de 0 a 20 W). Ativar a emissão. </li><li> Inicie uma plataforma de design do sistema que controle o protocolo de irradiação laser e temporização (arquivo suplementar). </li><li> Imediatamente após colocar o prato de cultura na placa quente, clique no "tempo de pré-aquecimento" para iniciar o temporizador durante 140 s ("tempo de pré-aquecimento 1"); Isso manterá a temperatura média da cultura às 37 ° C antes da irradiação. NOTA: Após 140 s, um sinal sonoro será ativado e o próximo temporizador ("tempo de pré-aquecimento 2") começará a contar automaticamente 8 s. Durante este período de 8 s, o examinador pode abrir o prato de cultura. Após 148 s de pré-aquecimento, uma irradiação com laser de 10 s de comprimento na cultura celular será conduzida automaticamente. Em caso de emergência, equipar o dispositivo laser com um botão forçar-sair para parar o laser imediatamente. Este é um PASSO CRÍTICO e deve ser rigorosamente seguido. Um ponto especial de precaução refere-se à abertura da cobertura do prato imediatamente antes da irradiação, no início do tempo de pré-aquecimento de 8 s. Abrir a tampa pode esfriar a superfície média muito rapidamente. </li><li> Após a irradiação, coloque novamente a tampa no prato de cultura, deixe o prato de cultura na placa quente por mais 7 s e coloque-o novamente na incubadora a 5% de CO 2 a 37 ° C. </li></ol><li> Medição da distribuição de temperatura noNível celular (calibração de temperatura) <ol><li> Faça pequenos orifícios (cerca de 300 μm de diâmetro) perto do fundo em quatro lados (a cada 90 °) de um prato de cultura de 30 mm de diâmetro (sem células); Use a ponta de uma agulha (20G) aquecida com um queimador de Bunsen. Selar os furos com fita de isolamento elétrico do lado de fora e fazer um pequeno orifício com uma agulha fina de modo que apenas um termopar fino (200 um de diâmetro) possa ser inserido através deste orifício em condições estanques. </li><li> Na parte externa do fundo do prato de cultura, desenhe 2 diâmetros perpendiculares e defina o ponto de cruzamento ( ou seja, o centro do lado inferior) como a coordenada zero (0). Marque cada 3 mm radialmente para o exterior do prato ( ou seja, 0, 3, 6, 9, 12 e 15 mm) em cada direção ao longo das linhas ( Figura 2 , pontos azuis); O número de pontos deve ser 21 no total. </li><li> Encha o prato de cultura de células com 1,2 mL de novo meio de cultura. Coloque a cultura dIsh em uma placa quente a 37 ° C, insira um termopar fino (200 um de diâmetro) no orifício lateral e coloque a ponta sensível em uma posição marcada a ser medida. </li><li> Use óculos de proteção. Ligue o laser Thulium e ajuste manualmente a potência (entre 0 e 20 W, em incrementos de 0,1 W) do dispositivo laser. NOTA: Para calibração de temperatura, as medições com potência em incrementos de 3 W devem ser suficientes. </li><li> Ative a plataforma de design do sistema e clique no botão "Iniciar Temp. Aquisição" (arquivo suplementar) para iniciar a medição de temperatura. </li><li> Conduzir o mesmo procedimento que no passo 2.2.6. NOTA: O programa de controle mede a temperatura do termopar inserido a cada 100 ms e mostra a progressão da temperatura durante a irradiação na GUI. </li><li> Conduza estes procedimentos para todos os 21 pontos de medição e em diferentes configurações de energia. Repita todo o procedimento três vezes para todos os pontos e para todos os ajustes de energiaGs para obter dados confiáveis. </li><li> Exporte dados de temperatura como dados csv, que eventualmente podem ser convertidos em uma planilha. Média a temperatura máxima no final da irradiação para as medidas em triplicado em cada ponto. Média os valores dos pontos no mesmo círculo (4 pontos no total, exceto o ponto central). </li><li> Trace a temperatura máxima média obtida em um gráfico, fazendo a distância do centro do prato (mm) como o eixo dos x e a temperatura aumenta (ΔT, ° C) como o eixo y. Use a função de ajuste de um programa de software matemático para se ajustar a um modelo gaussiano aos dados brutos. Crie uma distribuição de temperatura gaussiana. </li></ol></li><img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg"> Figura 2: Os pontos para a calibração da temperatura em um prato de cultura celular. Os dados de temperatura foram medidos no centro e às 5Pontos radiais em 4 ângulos diferentes (pontos azuis). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> 3. Avaliações biológicas para respostas celulares após diferentes irradiações térmicas <ol><li> Avaliação da viabilidade celular ( ie, viva, apoptótica e morta) após diferentes configurações de energia e determinação do limite de morte celular <ol><li> Nos pontos de tempo indicados ( ou seja, 3, 24 e 48 h após a irradiação), lave as células com PBS (-) e use um kit comercialmente disponível para avaliar a viabilidade celular ( isto é, vital, apoptótico, morto) de acordo com o fabricante protocolo. </li><li> Prepare uma solução de coloração adicionando 5 μL de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -annexina V, 5 μL de homodímero III de etidio e 5 μL de Hoechst 33342 a 100 μL de 1x tampão de ligação (todos são kitComponentes). Prepare uma solução de coloração suficiente para cobrir as células. Incube as células por 15 min. </li><li> Lave a cultura celular com o buffer de ligação duas vezes, substitua o tampão de ligação com PBS (-) e ajuste a cultura no estágio de um microscópio de fluorescência. </li><li> Mude o caminho da luz para a lente ocular, selecione o filtro 4 ', 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI), ative a luz de iluminação e encontre o plano focado com o objetivo 4x. </li><li> Altere o caminho da luz para a câmera, encontre a imagem na tela do computador no software de imagem do microscópio e ajuste o foco. </li><li> Use a função de ponto ( ou seja, a função para gravar várias imagens no prato e, em seguida, crie uma imagem única e grande) do software específico do microscópio para obter a imagem de fluorescência do prato de cultura de células inteiras. Use 3 conjuntos de filtros diferentes - DAPI, FITC e tetrametilrhodamina (TRITC) - para imagem Hoechst 33342-células positivas (todos os núcleos celulares), FITC-anexina V-positiCélulas ve (células apoptóticas) e homodímero de etidio III (células mortas), respectivamente. </li><li> Medir o raio (mm) da região morta (ethidium homodimer III-positivo) e o raio externo / interno da região da forma de banda apoptótica (anexina V-positiva) nas culturas de células coradas. Aplique esses raios na função gaussiana ajustada da distribuição de temperatura para a configuração de energia correspondente. Calcule a temperatura exata na borda da região morta ou apoptótica para esclarecer as temperaturas de limiar para morte celular e alteração apoptótica. </li></ol></li></ol></olstart>

<ol><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+pure+yellow+%28577-nm%29+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+%28561-577-nm%29+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+retina+therapy+%28SRT%29+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li>
<li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).</li>
<li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li>
<li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li>
<li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li>
<li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li>
<li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Optics%22%5BJournal%5D)">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li>
<li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Ao discutir as respostas celulares biológicas relacionadas à temperatura, não só a temperatura, mas também a duração do tempo do aumento da temperatura, é importante, uma vez que a maioria dos processos bioquímicos dependem do tempo. Particularmente no campo da hipertermia induzida por laser em oftalmologia, devido ao curto intervalo de tempo, de milissegundos a segundos, é difícil investigar os efeitos térmicos celulares com um controle preciso da temperatura. Portanto, é desejável uma instalação de irradiação a laser ...

Compreender respostas biológicas de células dependentes da temperatura é de grande importância para tratamentos de hipertermia com sucesso. A fotocoagulação a laser retinal com um laser térmico, usado em oftalmologia, é um dos tratamentos a laser mais estabelecidos em medicina. A luz visível, principalmente de comprimentos de onda verde para amarelo, é utilizada no tratamento com laser retiniano. A luz é altamente absorvida pela melanina nas células epiteliais do pigmento da retina (RPE), que formam a monocamada celular mais externa da retina. Houve um interesse recente entre médicos e pesquisadores em irradiação térmica muito leve (fotocoagulação sub-visível) como uma nova estratégia terapêutica para diferentes tipos de distúrbios retinianos 1 , 2 . Seguindo essa tendência, nosso interesse é subalternamente aquecer células RPE sob controle preciso de temperatura, uma técnica chamada terapia fototérmica controlada por temperatura (TC-PTT). Opção recenteA tecnologia acústica do nosso instituto permitiu a medição em tempo real dos aumentos de temperatura em locais irradiados na retina. Isso permite o controle sobre o aumento da temperatura durante a irradiação 3 . No entanto, uma vez que a hipertermia sub-letal na retina, causada pelo aquecimento de células RPE sub-letal, não foi previamente considerada devido à impossibilidade de medir e controlar a temperatura, as respostas celulares dependentes da temperatura de células RPE após irradiação laser térmica Foi estudado muito pouco até à data. Além disso, não só a diferença de temperatura não foi discutida em detalhes, mas também a diferença no comportamento celular das células sobreviventes após irradiação sub-letal e letal. Portanto, para reunir evidências científicas sobre tratamentos baseados em TC-PTT, buscamos elucidar as respostas biológicas das células RPE dependentes da temperatura e seus mecanismos usando configurações experimentais in vitro . Para tSeu propósito, é necessário estabelecer uma instalação de aquecimento celular que atenda às seguintes condições: 1) uma possibilidade de aumento rápido da temperatura, 2) um tempo e temperatura precisamente controlados, e 3) um número relativamente alto de células examinadas para experiências biológicas . Quanto ao método de aquecimento, um laser clínico, como um laser Nd.YAG com freqüência de dupla (532 nm), infelizmente não é adequado para o aquecimento da cultura celular. Isto é devido ao número fortemente reduzido de melanosomas em células RPE cultivadas. A absorção da luz laser pode ser não homogênea, e o aumento da temperatura no nível celular é variável entre experiências, mesmo quando irradiado com a mesma potência de radiação. Vários estudos anteriores relataram o uso de papel preto abaixo do fundo do prato durante a irradiação 4 ou o uso de melanosomas adicionais que são fagocitadas pelas células da cultura antes das experiências 5 , 6 . MuitosOs estudos biológicos in vitro para avaliar as respostas celulares induzidas pela hipertermia foram realizados usando uma placa quente, um banho de água ou uma incubadora de CO 2 com um ajuste de temperatura 7 . Estes métodos requerem um longo período de aquecimento porque leva algum tempo ( ou seja, vários minutos) para atingir a temperatura desejada. Além disso, usando esses métodos, é difícil obter um histórico térmico detalhado ( isto é, temperatura multiplicada pelo tempo) no nível celular. Além disso, a temperatura entre as células em diferentes posições em um prato de cultura pode diferir devido à difusão de temperatura variável. Na maioria dos casos, esta informação de temperatura temporal e espacial durante a hipertermia não foi levada em consideração para análises biológicas, mesmo que a resposta das células biológicas possa ser afetada criticamente pela temperatura e pela duração do tempo de aumento da temperatura. Para superar esses problemas, um contiO laser de thulium de onda nu foi usado aqui para aquecer as células. A radiação do laser de túlio (λ = 1,94 μm) é fortemente absorvida pela água 8 e as células no fundo do prato de cultura são estimuladas termicamente apenas através da difusão térmica. A fibra laser com um diâmetro de 365 um é ajustada a cerca de 12 cm acima da placa de cultura, sem qualquer óptica no meio. O diâmetro do feixe laser diverge de modo que é quase equivalente ao diâmetro interno do prato de cultura (30 mm) na superfície do meio de cultura. Com uma quantidade consistente de meio de cultura, é possível irradiar as células com o aumento de temperatura De alta repetibilidade. As configurações de potência variável permitem a irradiação com até 20 W e a temperatura média no nível celular pode ser aumentada até ΔT ≈ 26 ° C em 10 s. Ao modificar as condições de irradiação, também é possível alterar o perfil do raio laser para variar a distribuição de temperaturaEm um prato de cultura. Por exemplo, é possível investigar com uma distribuição de temperatura Gaussiana, como no estudo atual, ou com uma distribuição de temperatura homogênea. Este último pode ser vantajoso para investigar os efeitos das respostas celulares dependentes da temperatura mais especificamente para aumentos de temperatura sub-letais, mas não para estresse da morte celular ou para respostas de cicatrização de feridas. No total, a irradiação com laser de thulium pode permitir a investigação de diferentes tipos de fatores biológicos, como a expressão de genes / proteínas, cinética de morte celular, proliferação celular e desenvolvimento de funcionalidade celular, após diferentes exposições térmicas.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Glicose média - alta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>Adicione (2)-(4) antes de usar. Quente em 37 > C banho-maria antes de usar.</td></tr><tr><td>Solução antibiótica antibiótica (100 &vezes;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td>Contendo 10.000 unidades de penicilina, 10 mg de estreptomicina e 25 &mu; g Anfotericina B em 1mL. Adicione 5,5 ml em frasco médio de 500 ml (1) antes de usar.</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td>Adicionar 5,5 mL em frasco médio de 500 mL (1) antes de usar (concentração final: 1 mM)</td></tr><tr><td>Soro suíno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C-500ML</td><td>Adicionar 50 mL em 500 mL de garrafa média (1) antes de usar (final: 10%)</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina do pâncreas suíno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kit ELISA de quanticina VEGF humano</td><td>R& D System</td><td>DVE00</td><td></td></tr><tr><td>Oxiselect Kit de Ensaio de Glutationa Total</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>STA-312</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Detecção de Células Apoptóticas/Necróticas/Saudáveis</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA707-30018</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número do Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>EquipamentosLaser de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>túlio</td><td>Starmedtec GmbH</td><td>Protótipo</td><td>0-20 W</td></tr><tr><td>365 mm de diâmetro do núcleo de fibra</td><td>COMPONENTES DO LASER Alemanha</td><td>CF01493-52</td><td></td></tr><tr><td>Termopar</td><td>Omega Engineering Inc</td><td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td><td></td></tr><tr><td>Placa de aquecimento</td><td>MEDAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas ( espectrofluorômetro)</td> <td>Dispositivo molecular</td> Homogeneizador de células <td>Spectramax M4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>QIAGEN</td><td>TissueLyser LT</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti</td><td></td></tr><tr><td>programa de software matemático</td><td>The Mathworks. Inc</td><td>MATLAB Release 2015b</td><td></td></tr><tr><td>plataforma de design de sistema</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td></tr></tbody></table>

laser de thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Um método original para o aquecimento de células cultivadas usando um laser de túlio de onda contínua de 1,94 μm para avaliação biológica é introduzido aqui. A radiação do laser de Thulium é fortemente absorvida pela água, e as células no fundo do prato de cultura são aquecidas através da difusão térmica. Uma fibra a laser com um diâmetro de 365 μm é ajustada a cerca de 12 cm acima da placa de cultura, sem qualquer óptica, de modo que o diâmetro do feixe laser seja quase equivalente ao diâmetro interno da placa de cultura (30 mm). Ao manter uma quantidade consistente de meio de cultura em cada experiência, é possível irradiar as células com um aumento de temperatura altamente reprodutível. Para calibrar o aumento de temperatura e sua distribuição em um prato de cultura de células para cada ajuste de potência, a temperatura foi medida durante 10 s de irradiação em diferentes posições e no nível celular. A distribuição de temperatura foi representada usando um software de gráficos matemáticosPrograma, e seu padrão no prato de cultura estava em forma Gaussiana. Após irradiação a laser, diferentes experiências biológicas podem ser realizadas para avaliar as respostas celulares dependentes da temperatura. Neste manuscrito, é introduzida a coloração da viabilidade ( isto é, distinguindo células vivas, apoptóticas e mortas) para ajudar a determinar as temperaturas limiares para apoptose celular e morte após diferentes pontos no tempo. As vantagens deste método são a precisão da temperatura e do tempo de aquecimento, bem como a sua alta eficiência no aquecimento de células em um conjunto de cultura de células inteiras. Além disso, permite estudar com uma grande variedade de temperaturas e durações do tempo, que podem ser bem controladas por um sistema operacional computadorizado.

Distribuição de temperatura após diferentes configurações de energia Todos os desenvolvimentos de temperatura para cada irradiação única foram monitorados na calibração de temperatura. A partir destes dados, a temperatura máxima no ponto medido foi obtida e definida como T max (° C). Conforme mostrado na Figura 3A , o programa foi executado no ponto de tempo em que o prato de cultura foi c...

Uma configuração experimental original para células de aquecimento em um prato de cultura usando radiação laser de onda contínua de 1,94 μm é introduzida aqui. Utilizando este método, as respostas biológicas das células epiteliais do pigmento da retina (RPE) após diferentes exposições térmicas podem ser investigadas.

Laser de Thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar as respostas biológicas celulares dependentes da dose térmica in vitro, aquecendo células cultivadas com controle preciso de temperatura e tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em campos que investigam as respostas celulares ou teciduais à hipertermia, como o estudo do tratamento com laser de retina. A principal vantagem desta técnica é um aquecimento rápido das células e um controle preciso sobre a duração do aquecimento, permitindo uma alta exposição térmica reprodutível durante os experimentos.Embora esse método possa fornecer informações sobre as respostas das células epiteliais pigmentares da retina cultivadas à irradiação térmica a laser, ele também pode ser aplicado a outros modelos, como células cancerígenas. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez ao aquecer células contendo melanina com luz laser visível. No entanto, isso resultou em perfis de temperatura variados devido a variações na pigmentação.Para iniciar o procedimento, coloque uma placa quente em um suporte de laboratório de metal ajustável em uma bancada limpa. Defina a placa de aquecimento para 39 graus Celsius. Prenda uma fibra de 0.22 NA

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós desenvolvemos novas nanovesículas multifuncionais intrínsecas chamados porphysomes, que têm dependentes de estrutura fluorescência auto-têmpera e propriedades fototérmicos únicas, assim funcionando agentes terapia fototérmica como potentes. Formulamos porphysomes utilizando extrusão de alta pressão e investigou sua eficácia terapia fototérmica em um modelo de tumor xenoenxerto.

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal ablação tumoral Usando Porphysomes, Intrínseca Multifuncional nanovesículas

As ondas de choque nos dias de hoje são bem conhecidos por seus efeitos regenerativos. Portanto experimentos in vitro são de interesse crescente. Por isso, desenvolvemos um modelo in vitro para estudos de ondas de choque (IVSWT) que nos permite simular as condições in vivo, evitando assim efeitos físicos distracção.

Choque aplicação de ondas de culturas de células

Aparelho de aquecimento de uma ressonância magnética compatível customizado à base de laser tem sido desenvolvido para proporcionar aquecimento local dos tumores subcutâneos, a fim de activar os agentes de libertação de lipossomas termossensíveis especificamente na região do tumor.

Customizado aparelho de aquecimento à base de laser para lançamento acionado de cisplatina de termossensível lipossomas com Ressonância Magnética Orientação Imagem

thenoyltrifluoroacetonate európio (EuTFC) tem uma linha de luminescência óptica a 612 nm, cuja eficiência de activação diminui fortemente com a temperatura. Se uma amostra revestida com uma película fina desse material é micro-fotografada, a 612 nm, a intensidade da resposta luminescente pode ser convertido em um mapa directa da temperatura da superfície da amostra.

High-resolution Micro-imagem térmica Usando európio quelato luminescentes Coatings

Este método tem como objetivo a localização de defeitos de subsuperfície verticais. Aqui, acoplamos um laser com um modulador de luz espacial e disparamos a sua entrada de vídeo para aquecer uma superfície de amostra deterministicamente com duas linhas moduladas anti-fase enquanto adquirimos imagens térmicas altamente resolvidas. A posição de defeito é recuperada da avaliação dos mínimos de interferência de ondas térmicas.

Localização de Defeitos Subsuperficiais por Aquecimento Estruturado usando a Termografia Fototérmica Projetada a Laser

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de microbolhas com nanopartículas de óxido de ferro (NSMs) através de auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação fototérmica.

Microbolhas magnéticas, acústicas e óptica-tripla-responsivas para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação pothototérmica

Este protocolo apresenta técnicas e metodologia necessárias para terapia hipertérmica direcionada em modelos de tumores sólidos. A abordagem aproveita a conversão fototérmica da luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro injetados intratumoralmente para induzir o aquecimento localizado dentro do microambiente tumoral.

Induzindo hipertermia leve direcionada em modelos de tumores murinos por meio da conversão fototérmica de luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro intratumorais

Este artigo apresenta a técnica de Termorreflectância no Domínio da Frequência (FDTR) para caracterização e imagem térmica local não destrutiva.

A Técnica de Termorreflectância no Domínio da Frequência para Medições de Propriedades Térmicas

O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser...

Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis

Neste vídeo, usamos um adenovírus carregando o gene Cre recombinase para infectar fibroblastos de rato principal embrionárias carregando um alelo Rac1 floxed.

Adenovírus mediada por remoção genética das moléculas de sinalização em fibroblastos de rato cultivadas Primária embrionárias

Aprenda a aquecer células cultivadas com laser de thulium de onda contínua para investigar respostas biológicas a exposições térmicas controladas. Este método permite estudos precisos de efeitos térmicos em células epiteliais pigmentadas da retina e outros modelos celulares.

Laser de Thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares

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