Laser de Thulium de onda contínua para aquecimento de células cultivadas para investigar efeitos térmicos celulares

O objetivo geral deste procedimento é estudar as respostas biológicas celulares dependentes da dose térmica in vitro, aquecendo células cultivadas com controle preciso de temperatura e tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em campos que investigam as respostas celulares ou teciduais à hipertermia, como o estudo do tratamento com laser de retina. A principal vantagem desta técnica é um aquecimento rápido das células e um controle preciso sobre a duração do aquecimento, permitindo uma alta exposição térmica reprodutível durante os experimentos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre as respostas das células epiteliais pigmentares da retina cultivadas à irradiação térmica a laser, ele também pode ser aplicado a outros modelos, como células cancerígenas. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez ao aquecer células contendo melanina com luz laser visível. No entanto, isso resultou em perfis de temperatura variados devido a variações na pigmentação.

Para iniciar o procedimento, coloque uma placa quente em um suporte de laboratório de metal ajustável em uma bancada limpa. Defina a placa de aquecimento para 39 graus Celsius. Prenda uma fibra de 0.22 NA com um diâmetro de núcleo de 365 micrômetros ao braço horizontal do suporte.

Posicione o braço de metal sobre a placa de aquecimento e ajuste o suporte de forma que a ponta de fibra fique 12 centímetros acima da placa de aquecimento. Conecte um laser de túlio de 1,94 micrômetro e 20 watts com um feixe de mira de 365 nanômetros de um miliwatt à ponta da fibra. Coloque uma placa de cultura de 30 milímetros de diâmetro na placa quente.

Trace cuidadosamente a circunferência do prato na superfície da placa quente e, em seguida, remova o prato. Ligue o feixe de mira e ajuste o suporte até que o centro do ponto do feixe na placa de aquecimento corresponda ao círculo traçado. Em seguida, desligue o feixe de mira.

Para iniciar o procedimento de calibração de temperatura, aqueça a ponta de uma agulha de calibre 20 com um bico de Bunsen. Com a ponta da agulha aquecida, fure a placa de cultura de 30 milímetros de diâmetro perto do fundo em quatro pontos separados por 90 graus para fazer furos de cerca de 300 micrômetros de diâmetro. Coloque fita isolante sobre os orifícios.

Use uma agulha fina para perfurar um orifício de aproximadamente 200 micrômetros de diâmetro através da fita que cobre cada orifício. Na parte inferior do prato de cultura, desenhe uma linha entre cada par de orifícios separados por 180 graus. Começando na interseção das linhas, marque a cada três milímetros radialmente ao longo de cada linha para designar os 21 pontos de medição.

Em seguida, coloque exatamente 1,2 mililitros de meio de cultura fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius no prato. Cubra o prato e coloque-o no círculo traçado na placa quente. Conecte um termopar com um diâmetro de 200 micrômetros ao computador de controle do laser e abra o protocolo de calibração de temperatura.

Insira o termopar em um dos orifícios do prato de forma que a ponta fique no fundo do prato em um dos locais da marca. É muito importante verificar se a ponta do termopar está tocando o fundo do prato com a precisão medida, pois a temperatura pode variar de acordo com a profundidade. Aguarde até que o meio de cultura se estabilize a 37 graus Celsius.

Em seguida, ligue o laser de túlio e ajuste a potência do laser para o nível inicial desejado. Verifique se as durações de pré-aquecimento estão definidas para 140 e oito segundos e, em seguida, inicie a sequência de irradiação de pré-aquecimento. Após 140 segundos, conforme indicado por um bipe audível, remova imediatamente a tampa do prato de cultura.

Aguarde enquanto o pré-aquecimento termina e ocorre a irradiação de 10 segundos. Em seguida, cubra imediatamente o prato. Meça a temperatura nos locais de 21 marcas desta forma.

Execute este procedimento três vezes cada em intervalos de potência de três watts abrangendo a faixa de potência do laser. Quando terminar, desligue o laser de túlio. Exporte e analise os dados de temperatura.

Antes do experimento, cultive células epiteliais de pigmento de aluguel em placas de cultura de 30 diâmetros. Mantenha as culturas de células a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono e verifique-as usando um sistema de imagem de células vivas. Uma hora antes da irradiação, substitua o meio de cultura em cada placa por exatamente 1,2 mililitros de meio de cultura fresco.

Devolva as culturas à incubadora. Verifique se a estação de irradiação está pronta e se a placa de aquecimento está ajustada para 39 graus Celsius. Quando estiver pronto para iniciar a irradiação, inicie o laser de túlio na potência desejada.

Abra o protocolo de experimento e verifique se as durações de pré-aquecimento estão definidas como 140 e oito segundos. Colocar uma cultura de células de EPR numa placa fechada na posição marcada na placa de aquecimento e iniciar imediatamente a sequência de irradiação de pré-aquecimento de 140 e oito segundos. Remova a tampa da louça após 140 segundos de pré-aquecimento.

Aguarde enquanto o pré-aquecimento termina e ocorre a irradiação de 10 segundos. Cubra imediatamente o prato, aguarde sete segundos e retorne o prato à incubadora. Irradie amostras adicionais em níveis crescentes de potência do laser.

Quando terminar, desligue o laser de túlio. Para iniciar a avaliação da viabilidade celular, lave as células irradiadas com PBS. Obtenha um kit capaz de diferenciar células apoptóticas e necróticas vivas.

Em seguida, com pouca luz, combine 500 microlitros de tampão de ligação com 25 microlitros de homodímero de etídio-3, anexina FITC e Hoechst 33342. Incube as células nesta solução de coloração à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, lave as células com tampão de ligação 1X duas vezes.

Substitua o tampão de ligação por PBS e coloque a célula no estágio de um microscópio de fluorescência que tenha filtros DAPI, FITC e TRITC. Defina o caminho da luz do microscópio para a lente ocular e selecione o filtro DAPI. Ligue a luz de iluminação e encontre o plano de foco com uma lente objetiva 4X.

Defina o caminho da luz para a câmera do microscópio. Use o software de imagem do microscópio para centralizar e focar a imagem. Defina os parâmetros para aquisição de imagem usando o filtro DAPI.

Repita o processo de focagem e a configuração de aquisição de imagem com os filtros FITC e TRITC. Em seguida, use o software de imagem para adquirir várias imagens com três conjuntos de filtros em toda a placa e combiná-las em uma única imagem de toda a placa de cultura. Use software analítico para determinar os limites de temperatura para apoptose e morte celular.

A relação proporcional entre o aumento máximo de temperatura no centro de uma placa de cultura de células e a potência do laser foi determinada pelo procedimento de calibração térmica descrito. A distribuição máxima de temperatura através da placa de cultura de células foi então ajustada a uma função gaussiana. Três padrões de coloração foram observados após a irradiação.

Nenhuma mudança de viabilidade foi observada em culturas submetidas a temperaturas iguais ou inferiores a 43 graus Celsius. A apoptose foi observada pela primeira vez três horas após a irradiação a 47 graus Celsius. A morte celular foi observada mais de três horas após 51 graus Celsius ou mais.

As temperaturas limite médias para apoptose e morte celular foram então determinadas pela aplicação da média dos raios medidos das áreas mortas e apoptóticas à função gaussiana que descreve a distribuição da temperatura. Após este procedimento, as irradiações podem ser realizadas sob muitas condições diferentes, como diferentes perfis de laser, tamanhos de pontos e tempos de irradiação. Isso pode ajudar a entender e investigar questões relacionadas às causas individuais da temperatura cronometrada no nível celular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como aquecer a cultura de células com bom controle sobre a temperatura e o tempo. Isso pode depender das possibilidades de estudar as respostas biológicas a diferentes condições de irradiação térmica. Não se esqueça de que trabalhar com lasers pode ser muito perigoso para os olhos e a pele.

Mantenha-se informado sobre o treinamento de segurança de irradiação a laser. Sempre use óculos de segurança, jaleco e luvas apropriados ao realizar este procedimento.