Name: In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Aprenda a investigar a transição endotelial-mesenquimal da córnea in vitro e in vivo usando cultura primária de células endoteliais bovinas e modelo de criolesão em ratos. Este método auxilia no desenvolvimento de terapias para doenças corneanas.

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Agradecemos à equipe do Segundo Laboratório Principal, Departamento de Pesquisa Médica, Hospital Universitário Nacional de Taiwan por seu apoio técnico.

Todos os procedimentos seguidos neste estudo concedidas com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do National Taiwan University Hospital. 1. Isolamento, cultura Preparação Primária e imunocoloração de Bovinos PEC <ol><li> Adquirir olhos bovinos frescas de um matadouro local. </li><li> Desinfectar os olhos em um 10% w / v solução de povidona-iodo durante 3 min. Lavá-las com uma solução tamponada de fosfato salino (PBS). </li><li> Colheita do botão da córnea com um bisturi e tesouras sob condições estéreis. membrana de Descemet Descasque a com uma pinça sob um microscópio de dissecação (notar que, neste estudo, os olhos foram enucleados bovina por um matadouro local, portanto, o primeiro procedimento de pesquisa foi a desinfecção dos olhos preenucleated no laboratório). </li><li> Incubar a membrana de Descemet, em 1 ml de tentativapsin a 37 ° C durante 30 min. Recolher os CECs bovinos por centrifugação a 112 xg por 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de meio suplementado epitelial hormonal (SHEM) contendo volumes iguais de meio de HEPES-tamponizada de Dulbecco modificado por Eagle e meio F12 de Ham, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de epidérmico humano factor de crescimento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selénio, 1 nmol / l de toxina de cólera, 50 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg / ml de anfotericina B. </li><li> Semear as células (cerca de 1 x 10 5 células por olho) em um disco de 6 cm. Cultura-los no Sem. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 em ar. Mudar o meio de cultura a cada 3 dias. </li><li> Quando as células atingem a confluência, lavá-las em PBS e incubar em 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recolhe-los por centrifugação a 112 xg durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de SHEM. <ol&gt; <li> Contar as células num hemocitómetro. Semear as células sobre lâminas de cobertura a uma densidade de 1 x 10 4 por poço numa placa de 24 poços, e as células de cultura na SHEM. Para investigar o efeito de suprimir EnMT-marimastat, incubar as células em SHEM com 10 uM de marimastat adicionado para o meio de cultura, e mudar o meio de cultura a cada 3 dias. </li></ol></li><li> Fixar as células em um ponto de tempo indicado com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min. Bloco com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min. </li><li> Incubam-se as células com anticorpos primários contra activo beta-catenina (ABC), caracol, e lesma durante a noite a 4 ° C. A diluição dos anticorpos primários utilizados é de 1: 200. Os anticorpos são diluídos em diluente de anticorpo composta de PBS 10 mM, 1% w / v de albumina de soro de bovino, e 0,09% w / v de azida de sódio. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min, e incuba-se am, com o anticorpo conjugado com Alexa Fluor-secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h. </li><li> Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole, lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min, e montá-los com anti-desvanecimento solução de montagem. </li><li> Obter imagens de imunofluorescência nos comprimentos de onda de excitação de 405 e 488 nm usando um microscópio confocal de varredura a laser, com ampliação de 20x objetiva. </li></ol> 2. Rat Corneal endotélio criolesão modelo e injeção intracamerais <ol><li> Anestesiar ratos machos 12 semanas de idade, Sprague-Dawley machos com injecções intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) e mais tiletamina zolazepam (18 mg / kg). Suavemente comprimir a pele dos animais para confirmar a anestesia adequada na ausência de espasmos pele. </li><li> Instilar uma gota de cloridrato de proparacaína 0,5% no olho direito de cada rato para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar. instilarpomada de tetraciclina para o olho esquerdo para evitar o ressecamento da córnea. </li><li> Arrefece-se uma sonda de aço inoxidável (diâmetro = 3 mm) em azoto líquido. Aplicar a sonda de aço inoxidável para o centro da córnea do olho direito durante 30 seg. incutir frequentes PBS para o olho direito durante o procedimento para prevenir o ressecamento da córnea. </li><li> Instilar 0,1% atropina e 0,3% de sulfato de gentamicina imediatamente após criolesão e uma vez ao dia para aliviar a dor ocular resultante de espasmo ciliar e para prevenir a infecção. <ol><li> Após o procedimento, manter os ratos aquecer usando uma lâmpada de calor, e observar a sua recuperação a cada 15 minutos após a anestesia até que recuperar o controle motor. Além disso, aplique pomada de tetraciclina para o olho direito de prevenir o ressecamento da córnea durante o período de recuperação. </li></ol></li><li> Repita o criolesão córnea durante 3 dias consecutivos. </li><li> Para entregar o marimastat ou de bFGF na câmara anterior dos olhos de ratos, anestesiar os ratos, tal como descrito anteriormente. Instilar uma gotade 0,5% de cloridrato proparacaína no olho direito para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar. </li><li> Irrigar a superfície ocular com PBS estéril. Realizar paracentese da câmara anterior sob um microscópio de operação através da inserção de uma agulha de 30 G ligada a uma seringa de 1 ml na córnea clara paralimbal num plano acima e paralelo ao da íris. </li><li> Rode a agulha de bisel para cima, e ligeiramente deprimir o ferimento da córnea para drenar um pouco de humor aquoso e reduzir a pressão intra-ocular. Injectar 0,02 ml da droga intracamerally. Gentilmente comprimir o trato agulha com uma ponta de algodão durante a retirada da agulha. </li><li> Fotografar a parte externa do olho em um ponto de tempo indicado sob o microscópio cirúrgico. </li></ol> 3. Colheita do Rato Botão de córnea e imunocoloração <ol><li> A eutanásia os ratos, coloque-os em uma câmara de eutanásia e infundir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto. Manter CO 2 para uma infusãominuto adicional após a falta de respiração e cor dos olhos desapareceu. </li><li> Penetrar no olho do rato no limbo com uma lâmina afiada. Corte as córneas com uma tesoura ao longo da córnea do limbo. Achate as córneas em um slide. Fazer incisões radiais adicionais se as córneas enrolar. </li><li> Fixar as córneas com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, e bloquear com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min. </li><li> Incubar as córneas com anticorpos primários contra ABC durante a noite a 4 ° C com uma diluição de 1: 200 em diluente de anticorpo. Lavam-se as córneas, duas vezes com PBS durante 15 min, e incubar com o anticorpo secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h. Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole, e lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min. </li><li> Monte as córneas em anti-fading solução de montagem. obtain as imagens de imunofluorescência em comprimentos de onda de excitação de 405 e 561 nm com um microscópio confocal de varredura a laser com ampliação de 20x objetiva. </li></ol>

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<li>Zhu, Y. T., Chen, H. C., Chen, S. Y., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+p120+catenin+unlocks+mitotic+block+of+contact-inhibited+human+corneal+endothelial+monolayers+without+disrupting+adherent+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Nuclear p120 catenin unlocks mitotic block of contact-inhibited human corneal endothelial monolayers without disrupting adherent junctions.</a> J Cell Sci. 125 (15), 3636-3648 (2012).</li>
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<li>Mannermaa, E., Vellonen, K. S., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+in+corneal+epithelium+and+blood-retina+barrier%3A+emerging+role+of+transporters+in+ocular+pharmacokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Drug transport in corneal epithelium and blood-retina barrier: emerging role of transporters in ocular pharmacokinetics.</a> Adv Drug Deliv Rev. 58 (11), 1136-1163 (2006).</li>
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Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a declarar.

PEC são conhecidos pela sua propensão para sofrer EnMT durante a proliferação celular. Para desenvolver estratégias para suprimir o processo EnMT para fins terapêuticos, uma profunda compreensão do mecanismo EnMT é necessário. Nós descrevemos 2 modelos para investigar EnMT, ou seja, a CEC bovina em modelo de cultura in vitro e rato modelo criolesão endotélio corneano. Os nossos resultados demonstram o processo EnMT em ambos os modelos. Além disso, o efeito de supressão de EnMT marimastat foi reproduzid...

As células endoteliais da córnea (CECs) desempenham um papel vital na manutenção da clareza da córnea e, portanto, da acuidade visual, regulando o estado de hidratação do estroma da córnea por meio do bombeamento ativo1. Devido ao potencial proliferativo limitado das CECs humanas, o número de células diminui com a idade, e o reparo de feridas endoteliais da córnea após lesão geralmente é alcançado por meio de aumento e migração celular, em vez de mitose celular2. Quando a contagem de CEC diminui abaixo de um limite de aproximadamente 500 células/mm2, o estado de desidratação do estroma corneano não pode ser mantido, levando a ceratopatia bolhosa e deficiência visual3,4.
O potencial proliferativo limitado das CECs humanas tem sido atribuído a vários fatores, incluindo expressão reduzida do fator de crescimento epidérmico e seu receptor em células envelhecidas5, TGFβ2 antiproliferativo no humor aquoso6 e inibição de contato2,7. Embora alguns fatores de crescimento, como o fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), possam aumentar a proliferação em um endotélio corneano humano cultivado, a eficiência da cultura permanece limitada8,9. Além disso, os CCEs podem sofrer uma alteração fenotípica durante a expansão ex vivo, assemelhando-se à transição epitelial-mesenquimal (EMT)10-13. A transição endotelial-mesenquimal (EnMT) é caracterizada por desestabilização da junção celular, perda de polaridade apical-basal, rearranjo do citoesqueleto, expressão de actina de músculo liso alfa e secreção de colágeno tipo I14. Todas essas características podem anular a função normal dos CCEs, dificultando o uso de CCEs cultivados ex vivo na engenharia de tecidos. Além disso, a EnMT tem sido associada à patogênese de várias doenças endoteliais da córnea, incluindo distrofia endotelial da córnea de Fuchs e formação de membrana retrocorneana15,16. Portanto, entender o mecanismo da EnMT pode ajudar a manipular o processo da EnMT e facilitar a regeneração dos CECs para permitir a função competente. 
Neste estudo, descrevemos um método para isolar CECs bovinos do botão da córnea. Na cultura primária in vitro, foi observado o processo EnMT, incluindo uma alteração fenotípica, a translocação nuclear de β-catenina e os reguladores EMT caracol e lesma. Descrevemos ainda um método para demonstrar EnMT in vivo usando um modelo de criolesão de endotélio de córnea de rato. Usando esses 2 modelos, demonstramos que o marimastat, um inibidor da metaloproteinase da matriz de amplo espectro (MMP), pode suprimir o processo EnMT. Os protocolos descritos facilitam a análise detalhada do mecanismo EnMT e o desenvolvimento de estratégias para manipular o processo EnMT para posterior aplicação clínica.

<table><tbody><tr><td>tripsina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s meio Eagle modificado e meio Ham's F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>soro fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido Sigma</td><td>D2650</td><td></td>fator de <td></td></tr><tr><td>crescimento epidérmico humano</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>insulina, transferrina, selênio&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>toxina da cólera</td><td>Sigma</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>anfotericina B</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica</td><td>Ciências 111219</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>marimastat</td><td>Sigma</td><td>M2699-25MG</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-catenina beta-ativa</td><td>Millpore</td><td>05-665</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-caracol</td><td>Santa cruz</td><td>sc28199</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-lesma</td><td>Santa cruz</td><td>sc15391</td><td></td></tr><tr><td>cabra anti-rato IgG (H+L) secundário anticorpo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>para coloração de ABC de CECs bovinos</td></tr><tr><td>cabra anti-camundongo IgG (H + L) anticorpo secundário</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11003</td><td>para coloração de ABC de endotélio de córnea</td></tr><tr><td>de rato cabra anticorpo secundário IgG (H + L)</td> de cabra <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>para coloração de caracol e lesma de CECs bovinos</td></tr><tr><td>diluente de anticorpos</td><td>Genemed Biotechnologies</td><td>10-0001</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>meio de montagem</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal de varredura a laser</td><td>ZEISS</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>xilazina&nbsp;</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>tiletamina mais zolazepam</td><td>Virbac</td><td>N/A</td><td>medicamento veterinário</td></tr><tr><td>cloridrato de proparacaína solução oftálmica</td><td>Alcon</td><td>N/A</td><td>medicamento veterinário</td></tr><tr><td>0,1% atropina</td><td>Wu-Fu Laboratories Co., Ltd</td><td>N/A</td><td>medicamento clínico&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina a 0,3%</td><td>Sinphar Grupo</td><td>N/A</td><td>medicamento clínico&nbsp;</td></tr><tr><td>fator básico de crescimento de fibroblastos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0024</td><td>medicamento clínico&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo em modelos para o estudo de transição da córnea endotelial-mesenquimal

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

As células endoteliais da córnea (CECs) desempenham um papel crucial na manutenção da clareza da córnea por meio do bombeamento ativo. Uma contagem reduzida de CEC pode levar a edema da córnea e diminuição da acuidade visual. No entanto, os CECs humanos são propensos a comprometer o potencial proliferativo. Além disso, a estimulação do crescimento celular é frequentemente complicada pela transição endotelial-mesenquimal gradual (EnMT). Portanto, entender o mecanismo da EnMT é necessário para facilitar a regeneração de CECs com função competente. Neste estudo, preparamos uma cultura primária de CECs bovinas descascando as CECs com membrana de Descemet do botão corneano e demonstramos que as CECs bovinas exibiram o processo EnMT, incluindo alteração fenotípica, translocação nuclear de β-catenina e reguladores EMT caracol e lesma, na cultura in vitro. Além disso, usamos um modelo de criolesão de endotélio de córnea de rato para demonstrar o processo EnMT in vivo. Coletivamente, a cultura primária in vitro de CECs bovinos e modelos de criolesão de endotélio corneano de rato in vivo oferece plataformas úteis para investigar o mecanismo de EnMT.

Após o isolamento de PEC bovina, as células foram cultivadas in vitro. A Figura 1 apresenta as imagens de contraste de fase do PEC bovina. A forma hexagonal das células em confluência indicaram que as células não foram contaminadas pelos fibroblastos do estroma da córnea durante o isolamento de células. A Figura 2 mostra a imunocoloração que foi realizada utilizando anticorpos contra ABC, caracol, e lesma em um ponto de tempo indicado. Para além...

A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar o mecanismo da Transição Mesenquimal Endotelial da Córnea In Vitro e In Vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas sobre a Transição Mesenquimal Endotelial da Córnea na área de regeneração endotelial da córnea. A vantagem desta técnica é que ela pode ser aplicada tanto a modelos In Vitro quanto In Vivo.E é fácil de manipular. As implicações dessa técnica tendem para a terapia de doenças relacionadas à Transição Mesenquimal Endotelial da Córnea. Como a formação, porque os modelos podem ser usados para selecionar substâncias que inibem o processo de Transição Mesenquimal Endotelial da Córnea.O procedimento será realizado por Jung-Shen Chang, um técnico de laboratório. Para iniciar este procedimento, desinfete olhos bovinos frescos em uma solução de poviodona-iodo a 10% peso por volume por três minutos. Em seguida, lave-os com PBS.Colete o botão corneano com bisturi e tesoura e lave-o com PBS. Sob um microscópio estereoscópico, desprenda a membrana de Descemet com pinça. Em seguida, incube a membrana de Descemet em um mililitro de tripsina a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois, colete as CECs bovinas por centrifugação a 112 vezes g durante cinco minutos.Após a centrifugação, re-suspenda as células em um mililitro de SHEM. Semee as células em uma placa de seis centímetros e cultive-as em SHEM. Posteriormente, incube as células a 37 graus Celsius em 5%CO2 e troque o meio de cultura a cada três dias.Quando as células atingirem confluência, lave-as em PBS. Em seguida, incube-as em um milímetro de tripsina a 37 graus Celsius por cinco minutos. Colete-as por centrifugação a 112 ×g por cinco minutos.Após cinco minutos, re-suspenda o pellet celular em um milímetro de SHEM. Em seguida, conte as células em um hemocitômetro. Depois disso, semeie as células em lamínulas em uma placa de 24 poços e cultive as células em SHEM.Para investigar o efeito supressor de Maramastat sobre a ENMT, incube as células em SHEM com 10 micromolar de Maramastat no meio de cultura e troque o meio de cultura a cada três dias. Em seguida, fixe as células em um ponto de tempo indicado com 250 microlitros de paraformaldeído 4% por 30 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, permeabilize-as com 250 microlitros de Triton X-100 0,5% por cinco minutos.E bloqueie-os com BSA 10% por 30 minutos. Posteriormente, incube as células com anticorpos primários contra ABC, snail e slug durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, lave as células duas vezes com PBS por 15 minutos cada vez.E incube-os com o anticorpo secundário conjugado com Alexa Fluor à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, contraclare o núcleo celular cobrindo as células com DAPI a dois microgramas por mililitro. Lave as células duas vezes com PBS, durante 15 minutos cada vez.E monte-os com solução de montagem antidesvanecimento antes de obter as imagens de imunofluorescência. Após anestesiar uma rata SD macho de 12 semanas, pinçe suavemente a pele do animal para confirmar a anestesia adequada na ausência de contração cutânea. Em seguida, aplique uma gota de cloridrato de proparacaína 0,5% no olho direito do rato para minimizar a dor e o reflexo de piscar.Em seguida, aplique pomada de tetraciclina no olho esquerdo para prevenir a dessecação corneana. A seguir, resfrie uma sonda de aço inoxidável em nitrogênio líquido. Aplique a sonda de aço inoxidável na córnea central do olho direito por 30 segundos.Instile frequentemente PBS no olho direito durante o procedimento para prevenir a dessecação da córnea e aplique Atropina 0,1% e Sulfato de Gentamicina 0,3% imediatamente após a criolesão, uma vez ao dia, para aliviar a dor ocular resultante do espasmo ciliar e prevenir infecções. Após o procedimento, mantenha o rato aquecido utilizando uma lâmpada de calor e observe sua recuperação até que recupere o controle motor. Aplique pomada de Tetraciclina no olho direito para prevenir a dessecação da córnea durante o período de recuperação e repita o procedimento de criolesão da córnea por três dias consecutivos.Para administrar Maramastat ou FGF básico na câmara anterior dos olhos de rato, aplique uma gota de cloridrato de proparcaína 0,5% no olho direito do rato anestesiado para minimizar a dor e o reflexo de piscar. Em seguida, irrigue a superfície ocular com PBS estéril. Sob microscópio cirúrgico, realize paracentese da câmara anterior inserindo uma agulha de calibre 30 acoplada a uma seringa de um mililitro na córnea clara paralimbal, em um plano acima e paralelo à íris. Em seguida, vire a bisel da agulha para cima e pressione levemente a ferida corneana para drenar um pouco do humor aquoso e reduzir a pressão intraocular.Injete 0,02 mililitros da droga por via intracameral e comprima suavemente o trajeto da agulha com uma ponta de algodão durante a retirada da agulha. Esta figura apresenta as imagens de contraste de fase das CECs bovinas e de culturas. O formato hexagonal das células em confluência indica que as células não foram contaminadas por fibroblastos estromais da córnea durante o isolamento celular.Durante o cultivo in vitro de CECs bovinos, a translocação nuclear de ABC, snail e slug foi detectada até o dia 14. Esta figura ilustra o efeito do Maramastat, um inibidor amplo de MMP, no processo de ENMT de CECs bovinos cultivados in vitro. Aqui estão as fotografias externas do olho de ratos após criolesão, seguidas por injeção intracameral.As fotografias mostram edema corneano reduzido após injeção de FGF básico. Enquanto o Maramastat reduziu ainda mais o edema corneano em comparação com FGF básico isolado. E esta figura mostra a imunomarcação do botão corneano de rato utilizando anticorpo contra ABC após criolesão seguida de injeção intracameral.A translocação nuclear da ABC é observada no grupo PBS e aumenta significativamente no grupo com FGF básico, indicando a ativação da sinalização Wnt Beta-catenina e do processo de ENMT. Após injeção intracameral de FGF básico seguida por Maramastat, a marcação nuclear da ABC é reduzida, sugerindo o efeito inibidor do Maramastat sobre a ENMT. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de Transição Mesenquimal Endotelial da Córnea, In Vitro e In Vivo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células endoteliais corneanas bovinas e realizar criolesão corneana, bem como injeção intracameral.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos.

A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye

Os camundongos têm sido usados como modelo para estudar muitas formas de transplante, incluindo o transplante de córnea.  Descrevemos neste relato um modelo murino para transplante de córnea agudo e tardio.

Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

A transição epitelial para mesenquimal (EMT) permite que os cânceres se tornem invasivos. Para investigar a EMT, é descrito um modelo in vitro baseado em células-tronco neurais (NSC) desprovido de soro e enzimas. Este sistema padronizado permite a avaliação quantitativa e qualitativa da migração celular, expressão gênica e proteica. O modelo é adequado para a descoberta de medicamentos.

Um Modelo de enzimas e Cultura de Células-Tronco Neural Serum-livre para EMT Investigation Adequado para Drug Discovery

Este protocolo descreve um romance tridimensional em vitro modelo, onde as células do estroma corneana e diferenciada de células neuronais são cultivadas juntos para ajudar na análise e compreensão das interações dos tipos de célula de dois.

Engenharia de tecido corneal: Um em Vitro modelo das interações nervo-estromal da córnea humana

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Aqui, um protocolo passo a passo para a preparação e o cultivo de botões córneos rachados suínos é apresentado. Como este modelo organo-tipicamente cultivado da cultura do órgão mostra taxas de morte da pilha dentro de 15 dias, comparável às córneas doadoras humanas, representa o primeiro modelo permitindo o cultivo a longo prazo de córneas não-humanas sem adicionar o Dextran tóxico.

Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Este protocolo descreve os passos críticos necessários para estabelecer e cultivar culturas de células endoteliais da córnea a partir de explantas de tecido humano ou ovino. Também é apresentado um método para subculindo células endoteliais córneas em biomateriais membranrosas.

Crescimento de Camadas de Células Endoteliais De Córnea Humana e Ovelha em Membranas Biomateriais

Descrevemos métodos para investigar o EndMT induzido pelo TGF-β2 em células endoteliais observando alterações de morfologia celular e examinando as alterações de marcadores relacionadas ao EndMT usando a coloração da imunofluorescência. A edição de genes CRISPR/Cas9 foi descrita e usada para esgotar o caracol de codificação genética para investigar seu papel no EndMT induzido pelo TGF-β2.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Aprenda a investigar a transição endotelial-mesenquimal da córnea in vitro e in vivo usando cultura primária de células endoteliais bovinas e modelo de criolesão em ratos. Este método auxilia no desenvolvimento de terapias para doenças corneanas.

In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

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