Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

O objetivo geral deste procedimento é fabricar estruturas tridimensionais de cristais coloidais invertidos à base de PEG com uma matriz extracelular codificada para aplicações em engenharia de tecidos hepáticos. A engenharia de tecidos hepáticos é um campo promissor na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa. Estamos criando uma estrutura tridimensional que permite às células hepáticas manterem sua função por longos períodos.

As implicações dessa técnica estendem-se para testes de medicamentos, pois células hepáticas cultivadas com este sistema podem manter sua função por mais tempo e apresentar melhor resposta ao fármaco. Embora este método possa fornecer informações sobre engenharia de tecidos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como aqueles que utilizam células-tronco. O procedimento será demonstrado por Hitomi, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.

Para preparar os moldes de microesferas, primeiro corte as pontas de tubos microcentrífugos resistentes à fervura de 0,2 mililitro no nível de 40 microlitros. Use cola impermeável para aderir as partes superiores dos tubos cortados a lamínulas de vidro para microscopia e, em seguida, cole ao redor dos moldes. Em seguida, substitua a água em um frasco de microesferas de poliestireno por etanol 70%.

Coloque a solução de esferas em um banho ultrassônico e sonique a mistura a 30 watts por três minutos para soltar as esferas agregadas. Uma vez que as microesferas tenham sido preparadas, pipete 100 microlitros de etanol para dentro de cada um dos moldes. Em seguida, corte quatro milímetros do topo de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e use-a para pipetar 25 microlitros das microesferas de poliestireno no molde duas vezes.

Coloque as moldes em um agitador rotativo e ajuste para 120 RPM. Deixe as amostras em agitação durante a noite. No dia seguinte, posicione as moldes sob um microscópio e verifique se as esferas estão organizadas em arranjo hexagonal.

Deixe o etanol evaporar à temperatura ambiente por duas noites. Nesse momento, coloque cuidadosamente o molde e o complexo de microesferas em uma estufa a 130 graus Celsius por seis horas para recozer as microesferas de poliestireno e formar a negativa do andarilho 3D. Primeiro, sintetize macromeros de diacrilato de polietileno glicol utilizando protocolos estabelecidos, conforme descrito nessas duas referências.

Em seguida, prepare uma solução a 50% de PEGDA em água desionizada e centrifugue a mistura até que esteja completamente dissolvida. Para scaffolds conjugados com matriz extracelular, adicione mais 10% de óleo de krill PEG NHS à solução de PEGDA a 50%. Em seguida, prepare uma solução estoque a 20% do fotoiniciador em etanol a 70%.

Adicione 50 microlitros da solução de fotoiniciador para cada mililitro da mistura de PEGDA. Em seguida, vortexe a mistura por um minuto. Depois, retire cuidadosamente os moldes das lâminas de vidro, empurre as estruturas com cuidado usando uma espátula e coloque-as em tubos de centrífuga separados de 1,5 mililitro.

Pipete 300 microlitros da solução de PEGDA em cada tubo e, em seguida, centrifugue os tubos para permitir que a solução de PEGDA infiltre na rede de poliestireno. Em seguida, remova a rede do tubo usando pinças e absorva cuidadosamente o excesso de solução de PEGDA da superfície. Coloque a rede sobre uma película de parafina recobrindo um vidro, com a superfície plana e circular voltada para cima.

Em seguida, exponha o andame à luz ultravioleta de 365 nanômetros por cinco minutos usando uma lâmpada de luz UV focalizada. Coloque cerca de dez redes cristalinas polimerizadas de PEGDA em um novo frasco e adicione 20 mililitros de THF. Agite os frascos em um agitador orbital a 300 RPM por seis horas.

Retire o frasco a cada uma ou duas horas e substitua o solvente contendo o polímero por THF fresco. Após a última lavagem, adicione água à solução de THF usada para verificar se as esferas de PS foram completamente dissolvidas. Se a solução ficar branca, realize lavagens adicionais até que a solução fique transparente.

Para esterilizar os suportes, prepare um tubo de microcentrífuga de 50 mililitros com dois mililitros de etanol 70% por suporte e coloque os suportes no tubo usando uma espátula. Deixe os suportes embebidos em etanol por uma hora. Após uma hora, despeje cuidadosamente o etanol e substitua-o por um volume igual de PBS estéril.

Em seguida, centrifugue os scaffolds para remover quaisquer bolhas. Armazene os scaffolds centrifugados a quatro graus Celsius e retire-os a cada uma a duas horas para substituir a solução por PBS fresco. Após várias trocas em PBS, remova os scaffolds que serão revestidos com colágeno e coloque-os em um tubo contendo um mililitro de colágeno tipo um por scaffold a ser revestido.

Em seguida, centrifugue o tubo como anteriormente e, então, agite as estruturas em um agitador orbital a 400 RPM por 30 minutos. Armazene as estruturas durante a noite a quatro graus Celsius. Cultive células de hepatocarcinoma em placas de cultura celular de 100 milímetros com 10 mililitros de meio de cultura.

Troque o meio a cada três dias até que a densidade celular atinja 75 a 80% da superfície de cultura. Quando as células estiverem prontas, coloque cuidadosamente os scaffolds com a superfície plana voltada para cima em uma placa de 24 poços. Em seguida, lave cada scaffold com dois mililitros de PBS.

Aspire o PBS e adicione dois mililitros de meio de crescimento aos andamios. Após 30 minutos, remova o meio e deixe o andamio secar por uma hora. Em seguida, colete as células de hepatocarcinoma utilizando o método de digestão com tripsina.

Após centrifugar as células, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet de modo que haja um milhão de células por 25 microlitros. Pipete lentamente 25 microlitros da suspensão celular diretamente sobre cada scaffold. Em seguida, cubra a placa e coloque-a no incubador durante a noite.

Em seguida, transfira cuidadosamente os andamios para uma nova placa de 24 poços e pipete dois mililitros de meio em cada poço antes de devolver a placa ao incubador. Um microscópio eletrônico de varredura do andamio é mostrado aqui. Ele é composto por uma disposição hexagonal compacta de poros com diâmetro médio entre 100 e 105 micrômetros, formando interconexões com os poros vizinhos, cujo diâmetro varia principalmente entre 35 e 40 micrômetros.

Quando semeadas com células de hepatocarcinoma, as células crescem e proliferam sobre as estruturas previamente revestidas com colágeno tipo um, mas não aumentam em número nas estruturas descobertas. Além disso, as células de hepatocarcinoma nas estruturas revestidas com colágeno apresentaram maior função celular de maneira dependente da concentração. No dia 14, as células de hepatocarcinoma cultivadas nas estruturas ICC revestidas com 400 microgramas por mililitro secretaram mais de três vezes a quantidade de albumina em comparação com aquelas cultivadas na estrutura descoberta.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar se as esferas de poliestireno na rede estão adequadamente organizadas. Uma má organização levará a uma fraca interconectividade, o que pode afetar negativamente a atividade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar scaffolds de cristais coloidais invertidos à base de PEG ciliados com um revestimento.

Não se esqueça de que trabalhar com tetra-hidrofurano pode ser perigoso e precauções, como operar em uma capela de exaustão e usar luvas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.