Name: Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a fabricar andaimes de cristal coloidal invertido de PEG para engenharia de tecidos hepáticos. Este método permite manter a função das células Huh-7.5 por mais tempo, melhorando testes de drogas e aplicações em medicina regenerativa.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio de um Research Foundation Fellowship Nacional (NRF -NRFF2011-01) e Competitiva Programa de Pesquisa (NRF-CRP10-2012-07).

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Andaimes de engenharia de tecidos estão a evoluir rapidamente para fornecer todas as pistas físicas e bioquímicas necessárias para regenerar, manter ou reparar tecidos para a aplicação da substituição de órgãos, estudando a doença, o desenvolvimento de drogas, e muitos outros 57. Na engenharia de tecidos do fígado, os hepatócitos primários humanos rapidamente perdem suas funções metabólicas uma vez isolados do corpo, criando uma grande necessidade de andaimes de engenharia e desenvolvimento de plataformas par...

O fígado é um órgão altamente vascularizado com uma multiplicidade de funções, incluindo a desintoxicação do sangue, metabolismo de xenobióticos, e a produção de proteínas séricas. O tecido de fígado tem uma microestrutura complexa tridimensional (3D), que compreende de vários tipos de células, canalículos biliares, sinusóides, e zonas de composição biomatriz diferente e diferentes concentrações de oxigénio. Dada esta estrutura elaborada, tem sido difícil criar um modelo de fígado adequada in vitro 1. No entanto, há uma crescente demanda por funcional em modelos in vitro hospedagem hepatócitos humanos como plataformas para ensaio da toxicidade da droga 2 e estudo de doenças associadas ao fígado 3. Plataformas de engenharia de tecidos de fígado actual simplificaram a complexidade do fígado através do isolamento de um, ou concentrando-se em alguns, dos parâmetros do fígado, isto é, a co-cultura de células de 4 composição, bioquímica da Zonal microambientes 5, dinâmica de fluxo de 6,7 e a configuração da Biomatriz 8. Configuração da biomatriz pode ser dividida em parâmetros, tais como materiais de andaime, a composição de proteínas da matriz extracelular (ECM), a rigidez da matriz, bem como da concepção e estrutura do andaime. Houve um aumento nos estudos de engenharia de tecidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenoglicol) (PEG) hidrogéis 9, dada a capacidade de ajustar as propriedades, bioactividade, e taxa de degradação mecânica do hidrogel. Em relação à investigação relacionada com o fígado, o hidrogel biocompatível foi aplicado para estudar a infecção pelo vírus da doença hepática 3. Como um projeto de plataforma de hepatócitos, numerosos estudos têm utilizado hepatócitos sanduíche culturas 10,11 e encapsulamento de células dentro de um hidrogel 12,13 para proporcionar o ambiente 3D e célula-ECM e interação célula-célula, que são essenciais para imitar no microambiente vivo. However, essas plataformas não possuem um alto grau de controle e organização espacial, levando a propriedades não uniformes através do andaime 14. O coloidal cristal invertido (ICC) 14 scaffold é um arcabouço 3D altamente organizada para cultura de células, que foi introduzido pela primeira vez no início de 2000. estrutura única do andaime pode ser atribuída ao processo de fabricação simples utilizando um cristal coloidal, uma estrutura ordenada de partículas coloidais de diâmetro variável. Resumidamente, para resumir o processo, as partículas são dispostas ordenadamente e recozidos usando o calor para formar uma rede. A lixiviação desta estrutura, por um solvente orgânico, em um polimerizados resultados de hidrogel em cavidades esféricas hexagonal embalados 15 com área de superfície elevada. Este andaime altamente ordenada tenha sido previamente feito com ambos os materiais sintéticos e naturais, incluindo, mas não limitados a poli (acrilamida) 16-21, poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno-glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, e quitosano 36-39. Andaimes ICC feitas de materiais não-incrustantes tendem a promover esferóides celulares no interior das cavidades 14,23,40. Vários tipos de células têm sido mostrados para proliferar com sucesso, diferenciação e função dentro desta configuração, incluindo condrócitos 41, células do estroma da medula óssea 42, e as células-tronco 43,44. Em relação hepatócito, estudos têm sido realizados com andaimes ICC feitas de Na 2 SiO 3 e poli (acrilamida), mas não PEG. Com estratégias bioconjugação simples (ou seja, o acoplamento de amina através EDC / NHS), scaffolds à base de PEG ECM proteínas conjugadas podem ser fabricados, que podem revelar-se locais de ligação mais celulares para ser um mais in vivo, como o ambiente e melhorar a função hepática. Neste manuscrito e o vídeo associado, detalhamos a fabricação do andaime ICCusando poli (etileno-glicol) diacrilato de hidrogel (PEGDA) e um látice de poliestireno microesfera, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7,5) cultura. Nós demonstrar as diferenças entre os nus andaimes ICC PEGDA geralmente não aderentes eo PEGDA ICC andaime revestido de colágeno em termos de topologia de andaime e desempenho celular. viabilidade e função celular são medidos qualitativa e quantitativamente avaliar o comportamento das células Huh-7.5.

<table><tbody><tr><td>Tubo de PCR de 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td> Cola de gorila <td>à prova de fervura</td></tr><tr><td></td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Depende do fornecedor. Isso foi comprado em uma loja local.</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Dimensões: 24&vezes; Esferas de poliestireno de 60 mm2</td></tr><tr><td>Poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Diâmetro = 140 &micro; m; 3x104 partículas por mililitro e distribuição de tamanho de 1,4%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>absoluto para análise EMSURE; Dilua a 70% com Milli-Q água</td></tr><tr><td>Ultrassônica Banho</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Furnace</td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>200 &micro; l ponta de pipeta</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; a acrilação dos monômeros PEG e a purificação do precipitado resultante produzem um macrómero PEGDA com Mw = 4.6&nbsp; </td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>kDa Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Acrilato-Poli (Etilenoglicol) - Valerato de Succinimidil</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-hidroxi-4'- (2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Parafina Filme</td><td>Parafilme M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Mantido em 9" com intensidade permitida de 10,84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Bluewave 200 Refletor UV</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td> <td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>agitador orbital</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>De rato. 1x, sem CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V AQ. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Freezone 4.5 liofilizador</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Revestidor por pulverização catódica</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>de Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse anticorpos primários contra Colágeno tipo I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo anti-camundongo secundário conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Placa, Cultura de Tecidos 24 Poços, Fundo Plano (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) 2,5 g / L Glicose com L-Gln</td><td>Soro Fetal Bovino Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td> <td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P / S)</td> <td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning pratos de cultura não tratados</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Equipamento; 37&nbsp; &deg; C, 5% de Umidade</td></tr><tr><td>Forma Ciclo Esterilizado CO2 Incubadoras</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Hemacitômetro de Fase Bright-Line</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Vivo/Morto para células de mamíferos</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Ensaio</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Reagente de sal monossódico (MSR)</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Infinite 200 PRO&nbsp;</td><td>Kit ELISA</td> de albumina humana Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Abcam ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários anti-camundongo (contra CYP3A4, albumina)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 marcado com faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC água</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Espectrofotômetro 2000c</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcrição Reversa Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR selecionam Master Mix para CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primers (a serem escolhidos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Tempo Real CFX96, Termociclador de Toque C-1000</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) andaime: uma plataforma cultura celular tridimensional para liver engenharia de tecidos

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

A capacidade para manter a função de hepatócitos in vitro, com a finalidade de testar a citotoxicidade &#39;xenobióticos, estudar a infecção por vírus e o desenvolvimento de drogas orientadas para o fígado, exige uma plataforma em que as células recebem sinais bioquímicos e mecânicos adequados. sistemas recentes de engenharia de tecidos do fígado têm empregado tridimensionais andaimes (3D) compostas de hidrogéis sintéticas ou naturais, dada a sua alta capacidade de retenção de água e sua capacidade de fornecer os estímulos mecânicos necessários pelas células. Tem havido um interesse crescente no andaime invertida cristal coloidal (ICC), um desenvolvimento recente, que permite alta organização espacial, homotï¿½ica e interação célula heterotípica, bem como matriz (ECM) interação célula-extracelular. Aqui, nós descrevemos um protocolo para fabricar o andaime ICC usando poli diacrilato (etileno glicol) (PEGDA) eo método de partículas de lixiviação. Resumidamente, uma estrutura é feita a partir de partículas de microsferas, após o qual uma pré-polymesolução R é adicionada, adequadamente polimerizadas, e as partículas são, então, removido, ou lixiviado, utilizando um solvente orgânico (por exemplo, tetra-hidrofurano). A dissolução dos resultados grades de um andaime altamente porosa com tamanhos de poro controlado e interconnectivities que permitem que os meios para a obtenção de células mais facilmente. Esta estrutura única permite que a área de superfície elevada para as células a aderir bem como a comunicação fácil entre poros, e a capacidade para revestir o andaime ICC PEGDA com proteínas também mostra um efeito significativo no desempenho da célula. Analisamos a morfologia do suporte, bem como a célula hepatocarcinoma comportamento (Huh-7,5), em termos de viabilidade e função para explorar o efeito da estrutura ICC e revestimentos de ECM. No geral, este artigo fornece um protocolo detalhado de um andaime emergente que tem larga aplicação em engenharia de tecidos, especialmente no fígado engenharia de tecidos.

Os resultados representativos para a caracterização estrutural do andaime ICC ea comparação da eficácia de cada condição de andaime ICC em cultura de hepatócitos são mostrados e explicados abaixo. As condições ICC andaime utilizados nestes resultados são revestimentos de colagénio de 0 ug / ml (sem isolamento), 20 ug / ml (colágeno 20), 200 ug / ml (colágeno 200), e 400 ug / ml (colágeno 400) e o inicial huh-7.5 número de semeadura de células é 1x10 6. <p class="jove_conte...

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a fabricação de uma plataforma emergente de cultura de hepatócitos tridimensionais, o andaime de cristal coloidal invertido e as técnicas concomitantes para avaliar o comportamento dos hepatócitos. Os poros controláveis por tamanho, a interconectividade e a capacidade de conjugar proteínas da matriz extracelular ao andaime de poli (etilenoglicol) (PEG) aumentam o desempenho das células Huh-7.5.

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar estruturas tridimensionais de cristais coloidais invertidos à base de PEG com uma matriz extracelular codificada para aplicações em engenharia de tecidos hepáticos. A engenharia de tecidos hepáticos é um campo promissor na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa. Estamos criando uma estrutura tridimensional que permite às células hepáticas manterem sua função por longos períodos.As implicações dessa técnica estendem-se para testes de medicamentos, pois células hepáticas cultivadas com este sistema podem manter sua função por mais tempo e apresentar melhor resposta ao fármaco. Embora este método possa fornecer informações sobre engenharia de tecidos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como aqueles que utilizam células-tronco. O procedimento será demonstrado por Hitomi, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para preparar os moldes de microesferas, primeiro corte as pontas de tubos microcentrífugos resistentes à fervura de 0,2 mililitro no nível de 40 microlitros. Use cola impermeável para aderir as partes superiores dos tubos cortados a lamínulas de vidro para microscopia e, em seguida, cole ao redor dos

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.

Chip baseado em Cultura de Células tridimensional em perfundidos Micro-biorreatores

Para a criação de estruturas altamente organizadas de tecidos complexos, deve-se montar vários tipos de materiais e células em um composto integrado.  Este projeto combinatório incorpora folhas de células em camadas específicas de órgãos com dois materiais distintos derivados biologicamente contendo uma forte base de matriz fibrosa e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos.

Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Este protocolo descreve a fabricação de microcryogels elástica 3D se integrando microfabrication com tecnologia cryogelation. Durante o carregamento com células, microtissues 3D são gerados, que pode ser facilmente injetado em vivo para facilitar a terapia regenerativa ou montadas em matrizes para em vitro triagem de drogas de alto rendimento.

Microtissues 3D para terapia regenerativa injetável e triagem de drogas de alto rendimento

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Este protocolo apresenta um modelo biomimético 3D com compartimento estrommal fibroso que acompanha. Preparado com hidrogéis fisiologicamente relevantes em proporções que imitam as propriedades biofísicas da matriz extracelular estrominal, mediador ativo de interações celulares, crescimento tumoral e metástase.

Um modelo biomimético para câncer de fígado para estudar interações tumorais-estroma em um ambiente 3D com propriedades biofísicos incapazes

Doenças hepáticas são induzidas por muitas causas que promovem fibrose ou cirrose. O transplante é a única opção para recuperar a saúde. No entanto, dada a escassez de órgãos transplantáveis, alternativas devem ser exploradas. Nossa pesquisa propõe a implantação de andaimes de colágeno no tecido hepático a partir de um modelo animal.

Implantação de andaimes de matriz de colágeno tridimensional como estratégia de regeneração hepática

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Os organoides revolucionam a modelagem personalizada de tecidos para desenvolvimento de órgãos, descoberta de medicamentos e pesquisa de doenças. A engenharia organoide avança na criação de tecidos sintéticos intrincados. O objetivo é integrar morfogênese, tecnologia de assembloides e biomatrizes para avançar na engenharia de tecidos. Este protocolo auxilia na modelagem da organogênese hepática e no estabelecimento de diretrizes para a construção de tecidos sintéticos.

Técnicas de cultivo in vitro para modelar a organogênese hepática, construir assembleides,

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a fabricar andaimes de cristal coloidal invertido de PEG para engenharia de tecidos hepáticos. Este método permite manter a função das células Huh-7.5 por mais tempo, melhorando testes de drogas e aplicações em medicina regenerativa.

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal

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