Name: Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Aprenda a fabricar andaimes de cristal coloidal invertido de PEG para engenharia de tecidos hepáticos. Este método permite manter a função das células Huh-7.5 por mais tempo, melhorando testes de drogas e aplicações em medicina regenerativa.

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Os autores gostariam de agradecer o apoio de um Research Foundation Fellowship Nacional (NRF -NRFF2011-01) e Competitiva Programa de Pesquisa (NRF-CRP10-2012-07).

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Andaimes de engenharia de tecidos estão a evoluir rapidamente para fornecer todas as pistas físicas e bioquímicas necessárias para regenerar, manter ou reparar tecidos para a aplicação da substituição de órgãos, estudando a doença, o desenvolvimento de drogas, e muitos outros 57. Na engenharia de tecidos do fígado, os hepatócitos primários humanos rapidamente perdem suas funções metabólicas uma vez isolados do corpo, criando uma grande necessidade de andaimes de engenharia e desenvolvimento de plataformas par...

O fígado é um órgão altamente vascularizado com uma multiplicidade de funções, incluindo a desintoxicação do sangue, metabolismo de xenobióticos, e a produção de proteínas séricas. O tecido de fígado tem uma microestrutura complexa tridimensional (3D), que compreende de vários tipos de células, canalículos biliares, sinusóides, e zonas de composição biomatriz diferente e diferentes concentrações de oxigénio. Dada esta estrutura elaborada, tem sido difícil criar um modelo de fígado adequada in vitro 1. No entanto, há uma crescente demanda por funcional em modelos in vitro hospedagem hepatócitos humanos como plataformas para ensaio da toxicidade da droga 2 e estudo de doenças associadas ao fígado 3. Plataformas de engenharia de tecidos de fígado actual simplificaram a complexidade do fígado através do isolamento de um, ou concentrando-se em alguns, dos parâmetros do fígado, isto é, a co-cultura de células de 4 composição, bioquímica da Zonal microambientes 5, dinâmica de fluxo de 6,7 e a configuração da Biomatriz 8. Configuração da biomatriz pode ser dividida em parâmetros, tais como materiais de andaime, a composição de proteínas da matriz extracelular (ECM), a rigidez da matriz, bem como da concepção e estrutura do andaime. Houve um aumento nos estudos de engenharia de tecidos utilizando hidrogeles sintéticos, especialmente poli (etilenoglicol) (PEG) hidrogéis 9, dada a capacidade de ajustar as propriedades, bioactividade, e taxa de degradação mecânica do hidrogel. Em relação à investigação relacionada com o fígado, o hidrogel biocompatível foi aplicado para estudar a infecção pelo vírus da doença hepática 3. Como um projeto de plataforma de hepatócitos, numerosos estudos têm utilizado hepatócitos sanduíche culturas 10,11 e encapsulamento de células dentro de um hidrogel 12,13 para proporcionar o ambiente 3D e célula-ECM e interação célula-célula, que são essenciais para imitar no microambiente vivo. However, essas plataformas não possuem um alto grau de controle e organização espacial, levando a propriedades não uniformes através do andaime 14. O coloidal cristal invertido (ICC) 14 scaffold é um arcabouço 3D altamente organizada para cultura de células, que foi introduzido pela primeira vez no início de 2000. estrutura única do andaime pode ser atribuída ao processo de fabricação simples utilizando um cristal coloidal, uma estrutura ordenada de partículas coloidais de diâmetro variável. Resumidamente, para resumir o processo, as partículas são dispostas ordenadamente e recozidos usando o calor para formar uma rede. A lixiviação desta estrutura, por um solvente orgânico, em um polimerizados resultados de hidrogel em cavidades esféricas hexagonal embalados 15 com área de superfície elevada. Este andaime altamente ordenada tenha sido previamente feito com ambos os materiais sintéticos e naturais, incluindo, mas não limitados a poli (acrilamida) 16-21, poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) 15,22-30, Poli (etileno-glicol) 31,32, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) 21,33-35, e quitosano 36-39. Andaimes ICC feitas de materiais não-incrustantes tendem a promover esferóides celulares no interior das cavidades 14,23,40. Vários tipos de células têm sido mostrados para proliferar com sucesso, diferenciação e função dentro desta configuração, incluindo condrócitos 41, células do estroma da medula óssea 42, e as células-tronco 43,44. Em relação hepatócito, estudos têm sido realizados com andaimes ICC feitas de Na 2 SiO 3 e poli (acrilamida), mas não PEG. Com estratégias bioconjugação simples (ou seja, o acoplamento de amina através EDC / NHS), scaffolds à base de PEG ECM proteínas conjugadas podem ser fabricados, que podem revelar-se locais de ligação mais celulares para ser um mais in vivo, como o ambiente e melhorar a função hepática. Neste manuscrito e o vídeo associado, detalhamos a fabricação do andaime ICCusando poli (etileno-glicol) diacrilato de hidrogel (PEGDA) e um látice de poliestireno microesfera, optimizado para hepatocarcinoma (Huh-7,5) cultura. Nós demonstrar as diferenças entre os nus andaimes ICC PEGDA geralmente não aderentes eo PEGDA ICC andaime revestido de colágeno em termos de topologia de andaime e desempenho celular. viabilidade e função celular são medidos qualitativa e quantitativamente avaliar o comportamento das células Huh-7.5.

<table><tbody><tr><td>Tubo de PCR de 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td> Cola de gorila <td>à prova de fervura</td></tr><tr><td></td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Depende do fornecedor. Isso foi comprado em uma loja local.</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Dimensões: 24&vezes; Esferas de poliestireno de 60 mm2</td></tr><tr><td>Poliestireno</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Diâmetro = 140 &micro; m; 3x104 partículas por mililitro e distribuição de tamanho de 1,4%</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>absoluto para análise EMSURE; Dilua a 70% com Milli-Q água</td></tr><tr><td>Ultrassônica Banho</td><td>Elma</td><td>S10H</td><td>Equiment</td></tr><tr><td>Furnace</td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>200 &micro; l ponta de pipeta</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; a acrilação dos monômeros PEG e a purificação do precipitado resultante produzem um macrómero PEGDA com Mw = 4.6&nbsp; </td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>kDa Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Acrilato-Poli (Etilenoglicol) - Valerato de Succinimidil</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-hidroxi-4'- (2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr><td>Parafina Filme</td><td>Parafilme M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Mantido em 9" com intensidade permitida de 10,84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Bluewave 200 Refletor UV</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF)</td> <td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>agitador orbital</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno Tipo I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>De rato. 1x, sem CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% W/V AQ. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Freezone 4.5 liofilizador</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Revestidor por pulverização catódica</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>de Microscópio Eletrônico de Varredura</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse anticorpos primários contra Colágeno tipo I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Anti-camundongo anti-camundongo secundário conjugado com Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Placa, Cultura de Tecidos 24 Poços, Fundo Plano (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) 2,5 g / L Glicose com L-Gln</td><td>Soro Fetal Bovino Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td> <td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P / S)</td> <td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning pratos de cultura não tratados</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Equipamento; 37&nbsp; &deg; C, 5% de Umidade</td></tr><tr><td>Forma Ciclo Esterilizado CO2 Incubadoras</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Hemacitômetro de Fase Bright-Line</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Viabilidade/Citotoxicidade Vivo/Morto para células de mamíferos</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Ensaio</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Reagente de sal monossódico (MSR)</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas Infinite 200 PRO&nbsp;</td><td>Kit ELISA</td> de albumina humana Tecan <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Abcam ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos primários anti-camundongo (contra CYP3A4, albumina)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 marcado com faloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC água</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Espectrofotômetro 2000c</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Transcrição Reversa Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR selecionam Master Mix para CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primers (a serem escolhidos)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Tempo Real CFX96, Termociclador de Toque C-1000</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) andaime: uma plataforma cultura celular tridimensional para liver engenharia de tecidos

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

A capacidade para manter a função de hepatócitos in vitro, com a finalidade de testar a citotoxicidade &#39;xenobióticos, estudar a infecção por vírus e o desenvolvimento de drogas orientadas para o fígado, exige uma plataforma em que as células recebem sinais bioquímicos e mecânicos adequados. sistemas recentes de engenharia de tecidos do fígado têm empregado tridimensionais andaimes (3D) compostas de hidrogéis sintéticas ou naturais, dada a sua alta capacidade de retenção de água e sua capacidade de fornecer os estímulos mecânicos necessários pelas células. Tem havido um interesse crescente no andaime invertida cristal coloidal (ICC), um desenvolvimento recente, que permite alta organização espacial, homotï¿½ica e interação célula heterotípica, bem como matriz (ECM) interação célula-extracelular. Aqui, nós descrevemos um protocolo para fabricar o andaime ICC usando poli diacrilato (etileno glicol) (PEGDA) eo método de partículas de lixiviação. Resumidamente, uma estrutura é feita a partir de partículas de microsferas, após o qual uma pré-polymesolução R é adicionada, adequadamente polimerizadas, e as partículas são, então, removido, ou lixiviado, utilizando um solvente orgânico (por exemplo, tetra-hidrofurano). A dissolução dos resultados grades de um andaime altamente porosa com tamanhos de poro controlado e interconnectivities que permitem que os meios para a obtenção de células mais facilmente. Esta estrutura única permite que a área de superfície elevada para as células a aderir bem como a comunicação fácil entre poros, e a capacidade para revestir o andaime ICC PEGDA com proteínas também mostra um efeito significativo no desempenho da célula. Analisamos a morfologia do suporte, bem como a célula hepatocarcinoma comportamento (Huh-7,5), em termos de viabilidade e função para explorar o efeito da estrutura ICC e revestimentos de ECM. No geral, este artigo fornece um protocolo detalhado de um andaime emergente que tem larga aplicação em engenharia de tecidos, especialmente no fígado engenharia de tecidos.

Os resultados representativos para a caracterização estrutural do andaime ICC ea comparação da eficácia de cada condição de andaime ICC em cultura de hepatócitos são mostrados e explicados abaixo. As condições ICC andaime utilizados nestes resultados são revestimentos de colagénio de 0 ug / ml (sem isolamento), 20 ug / ml (colágeno 20), 200 ug / ml (colágeno 200), e 400 ug / ml (colágeno 400) e o inicial huh-7.5 número de semeadura de células é 1x10 6. <p class="jove_conte...

Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a fabricação de uma plataforma emergente de cultura de hepatócitos tridimensionais, o andaime de cristal coloidal invertido e as técnicas concomitantes para avaliar o comportamento dos hepatócitos. Os poros controláveis por tamanho, a interconectividade e a capacidade de conjugar proteínas da matriz extracelular ao andaime de poli (etilenoglicol) (PEG) aumentam o desempenho das células Huh-7.5.

Fabricação de Inverted coloidal de cristal poli (etileno-glicol) Andaime: Uma Plataforma Cultura celular tridimensional para Liver Engenharia de Tecidos

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar estruturas tridimensionais de cristais coloidais invertidos à base de PEG com uma matriz extracelular codificada para aplicações em engenharia de tecidos hepáticos. A engenharia de tecidos hepáticos é um campo promissor na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa. Estamos criando uma estrutura tridimensional que permite às células hepáticas manterem sua função por longos períodos.As implicações dessa técnica estendem-se para testes de medicamentos, pois células hepáticas cultivadas com este sistema podem manter sua função por mais tempo e apresentar melhor resposta ao fármaco. Embora este método possa fornecer informações sobre engenharia de tecidos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como aqueles que utilizam células-tronco. O procedimento será demonstrado por Hitomi, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório.Para preparar os moldes de microesferas, primeiro corte as pontas de tubos microcentrífugos resistentes à fervura de 0,2 mililitro no nível de 40 microlitros. Use cola impermeável para aderir as partes superiores dos tubos cortados a lamínulas de vidro para microscopia e, em seguida, cole ao redor dos moldes. Em seguida, substitua a água em um frasco de microesferas de poliestireno por etanol 70%.Coloque a solução de esferas em um banho ultrassônico e sonique a mistura a 30 watts por três minutos para soltar as esferas agregadas. Uma vez que as microesferas tenham sido preparadas, pipete 100 microlitros de etanol para dentro de cada um dos moldes. Em seguida, corte quatro milímetros do topo de uma ponteira de pipeta de 200 microlitros e use-a para pipetar 25 microlitros das microesferas de poliestireno no molde duas vezes.Coloque as moldes em um agitador rotativo e ajuste para 120 RPM. Deixe as amostras em agitação durante a noite. No dia seguinte, posicione as moldes sob um microscópio e verifique se as esferas estão organizadas em arranjo hexagonal.Deixe o etanol evaporar à temperatura ambiente por duas noites. Nesse momento, coloque cuidadosamente o molde e o complexo de microesferas em uma estufa a 130 graus Celsius por seis horas para recozer as microesferas de poliestireno e formar a negativa do andarilho 3D. Primeiro, sintetize macromeros de diacrilato de polietileno glicol utilizando protocolos estabelecidos, conforme descrito nessas duas referências.Em seguida, prepare uma solução a 50% de PEGDA em água desionizada e centrifugue a mistura até que esteja completamente dissolvida. Para scaffolds conjugados com matriz extracelular, adicione mais 10% de óleo de krill PEG NHS à solução de PEGDA a 50%. Em seguida, prepare uma solução estoque a 20% do fotoiniciador em etanol a 70%.Adicione 50 microlitros da solução de fotoiniciador para cada mililitro da mistura de PEGDA. Em seguida, vortexe a mistura por um minuto. Depois, retire cuidadosamente os moldes das lâminas de vidro, empurre as estruturas com cuidado usando uma espátula e coloque-as em tubos de centrífuga separados de 1,5 mililitro.Pipete 300 microlitros da solução de PEGDA em cada tubo e, em seguida, centrifugue os tubos para permitir que a solução de PEGDA infiltre na rede de poliestireno. Em seguida, remova a rede do tubo usando pinças e absorva cuidadosamente o excesso de solução de PEGDA da superfície. Coloque a rede sobre uma película de parafina recobrindo um vidro, com a superfície plana e circular voltada para cima.Em seguida, exponha o andame à luz ultravioleta de 365 nanômetros por cinco minutos usando uma lâmpada de luz UV focalizada. Coloque cerca de dez redes cristalinas polimerizadas de PEGDA em um novo frasco e adicione 20 mililitros de THF. Agite os frascos em um agitador orbital a 300 RPM por seis horas.Retire o frasco a cada uma ou duas horas e substitua o solvente contendo o polímero por THF fresco. Após a última lavagem, adicione água à solução de THF usada para verificar se as esferas de PS foram completamente dissolvidas. Se a solução ficar branca, realize lavagens adicionais até que a solução fique transparente.Para esterilizar os suportes, prepare um tubo de microcentrífuga de 50 mililitros com dois mililitros de etanol 70% por suporte e coloque os suportes no tubo usando uma espátula. Deixe os suportes embebidos em etanol por uma hora. Após uma hora, despeje cuidadosamente o etanol e substitua-o por um volume igual de PBS estéril.Em seguida, centrifugue os scaffolds para remover quaisquer bolhas. Armazene os scaffolds centrifugados a quatro graus Celsius e retire-os a cada uma a duas horas para substituir a solução por PBS fresco. Após várias trocas em PBS, remova os scaffolds que serão revestidos com colágeno e coloque-os em um tubo contendo um mililitro de colágeno tipo um por scaffold a ser revestido.Em seguida, centrifugue o tubo como anteriormente e, então, agite as estruturas em um agitador orbital a 400 RPM por 30 minutos. Armazene as estruturas durante a noite a quatro graus Celsius. Cultive células de hepatocarcinoma em placas de cultura celular de 100 milímetros com 10 mililitros de meio de cultura.Troque o meio a cada três dias até que a densidade celular atinja 75 a 80% da superfície de cultura. Quando as células estiverem prontas, coloque cuidadosamente os scaffolds com a superfície plana voltada para cima em uma placa de 24 poços. Em seguida, lave cada scaffold com dois mililitros de PBS.Aspire o PBS e adicione dois mililitros de meio de crescimento aos andamios. Após 30 minutos, remova o meio e deixe o andamio secar por uma hora. Em seguida, colete as células de hepatocarcinoma utilizando o método de digestão com tripsina.Após centrifugar as células, remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet de modo que haja um milhão de células por 25 microlitros. Pipete lentamente 25 microlitros da suspensão celular diretamente sobre cada scaffold. Em seguida, cubra a placa e coloque-a no incubador durante a noite.Em seguida, transfira cuidadosamente os andamios para uma nova placa de 24 poços e pipete dois mililitros de meio em cada poço antes de devolver a placa ao incubador. Um microscópio eletrônico de varredura do andamio é mostrado aqui. Ele é composto por uma disposição hexagonal compacta de poros com diâmetro médio entre 100 e 105 micrômetros, formando interconexões com os poros vizinhos, cujo diâmetro varia principalmente entre 35 e 40 micrômetros.Quando semeadas com células de hepatocarcinoma, as células crescem e proliferam sobre as estruturas previamente revestidas com colágeno tipo um, mas não aumentam em número nas estruturas descobertas. Além disso, as células de hepatocarcinoma nas estruturas revestidas com colágeno apresentaram maior função celular de maneira dependente da concentração. No dia 14, as células de hepatocarcinoma cultivadas nas estruturas ICC revestidas com 400 microgramas por mililitro secretaram mais de três vezes a quantidade de albumina em comparação com aquelas cultivadas na estrutura descoberta.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de verificar se as esferas de poliestireno na rede estão adequadamente organizadas. Uma má organização levará a uma fraca interconectividade, o que pode afetar negativamente a atividade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar scaffolds de cristais coloidais invertidos à base de PEG ciliados com um revestimento.Não se esqueça de que trabalhar com tetra-hidrofurano pode ser perigoso e precauções, como operar em uma capela de exaustão e usar luvas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Bioengineering

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