De alto rendimento Gene Tagging no
12 de agosto de 2016
A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.
O objetivo geral deste método é marcar proteínas em Trypansoma brucei de maneira de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da cinetoplastidíase sobre a localização e a função potencial de grandes grupos de proteínas. A principal vantagem desta técnica é que grandes quantidades de proteínas podem ser marcadas rapidamente e facilmente em paralelo.
Embora este método possa fornecer informações sobre a localização, as interações de grandes coortes de proteínas também podem ser investigadas utilizando outras marcas. Por exemplo, a marca BirA para um experimento de mapeamento de proximidade bio-ID. O procedimento será demonstrado por Ross Madden, um assistente de pesquisa do nosso laboratório.
Antes de iniciar este procedimento, pré-congele um refrigerador para PCR de 96 poços no congelador a menos 80 graus Celsius. Prepare a Mistura Mestra A combinando os seguintes componentes em um tubo de 10 mililitros: 2, 100 microlitros de água destilada desionizada, 105 microlitros de DMSO grau PCR, 105 microlitros de dNTPs 10 milimolares e 105 microlitros do molde pPOT.
Despeje o Master Mix A em um reservatório de reagente e distribua 23 microlitros do Master Mix A em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Usando uma pipeta multicanal de 12 canais P20, adicione dois microlitros de iniciadores em pool a 100 micromolar a cada poço carregado. Sobreponha a placa com filme vedante.
Coloque-o no refrigerador de PCR previamente resfriado e deixe congelar por um mínimo de 20 minutos a menos 80 graus Celsius. O congelamento da Mistura Mestra de PCR A é essencial para garantir uma reação de início quente eficiente, mesmo ao usar uma polimerase específica de início quente. Isso resulta em uma amplificação reprodutível e com alto rendimento.
Enquanto a placa de PCR estiver no congelador, prepare o Mix Mestre B. Combine o seguinte em um tubo de 10 mililitros: 2.048 microlitros de água destilada desionizada, 525 microlitros de tampão 10X e 52,5 microlitros de polimerase, obtendo um volume total de 2.626 microlitros por placa. Retire a placa de PCR e o resfriador de PCR do congelador a menos 80 graus Celsius.
Com a placa ainda no resfriador de PCR, adicione rapidamente 25 microlitros da Mistura Mestra B sobre a Mistura Mestra A congelada em cada poço, obtendo um volume final de reação de 50 microlitros. Este passo é crítico no tempo e deve ser concluído antes que a Mistura Mestra A descongele. Sobreponha a placa com filme adesivo.
Configure o termociclador da seguinte maneira: 94 graus Celsius por 10 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos, 65 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por dois minutos, seguidos por um período final de alongamento de 72 graus Celsius por sete minutos. Após o bloco atingir 94 graus Celsius, coloque a placa de PCR no termociclador e inicie o programa de amplificação.
Inicie este procedimento preparando um grande gel de agarose a 1% em tampão de corrida Tris-acetato-EDTA ou TAE, com quatro linhas de poços. Carregue um marcador de DNA de um kb nos primeiros e 28º poços de cada linha. O próximo passo é transferir dois microlitros do produto de PCR diretamente, sem tampão de carregamento de DNA, para cada poço do gel, seguindo o padrão mostrado aqui.
Por exemplo, os produtos de PCR das linhas A e B da placa de PCR são carregados nas alças ímpares e pares da primeira linha do gel, respectivamente. Trabalhando rapidamente para reduzir a possibilidade de contaminar os amplicons, carregue os produtos de PCR da linha A da placa de PCR nas alças ímpares da primeira linha do gel. Em seguida, carregue os produtos de PCR da linha B da placa de PCR nas alças pares da primeira linha do gel.
Carregue os produtos de PCR das linhas C e D da placa de PCR usando esse mesmo padrão, com a linha C nas canais ímpares e a linha D nas canais pares da segunda fileira do gel. Continue esse padrão de carregamento até que cada poço da placa de PCR seja carregado no gel. Coloque o gel no tanque de eletroforese e encha o tanque com tampão de corrida TAE até que o gel esteja submerso.
Execute a 100 volts por 30 minutos. Visualize utilizando um transiluminador UV. É mostrado aqui um gel de agarose representativo de validação de PCR em placa de 96 poços, no qual 95 dos 96 PCRs foram bem-sucedidos.
O PCR malsucedido foi o H11. Este procedimento utiliza a linhagem celular SMOXP9 da forma procíclica de Trypansoma brucei. Cultive as células até a densidade apropriada conforme descrito no texto do protocolo e recolha o número necessário de células por centrifugação a 800 vezes G durante 10 minutos.
Comece a preparar a eletroporação enquanto as células estão sendo centrifugadas. Conecte o manipulador de placas ao eletroporador. Na unidade do eletroporador, ajuste a voltagem para 1.500 volts, a duração do pulso para 100 microssegundos, o número de pulsos para 12 e o intervalo entre pulsos para 500 milissegundos.
No manipulador de placas, defina a contagem de pulsos para um. Usando uma pipeta multicanal de 12 canais P200, transfira as reações de PCR da placa de PCR para uma placa descartável de eletroporação de 96 poços. Lave as células em 10 mililitros de citomix modificado e centrifugue novamente a 800 vezes G por 10 minutos.
Resuspenda as células em 23 mililitros de citomix modificado para uma concentração final de cinco vezes 10 à sétima células por mililitro. Transfira a suspensão celular para um reservatório de reagentes. Pipete 200 microlitros da solução celular em cada poço da placa de eletroporação e misture com o produto de PCR por pipetagem.
Use um tecido para remover qualquer gota da parte superior da placa para evitar curtos-circuitos. Aplique uma película selante na parte superior da placa de eletroporação, posicionando-a de forma a deixar os orifícios para os eletrodos descobertos na parte superior e inferior de cada coluna. Evite cobrir os pontos elevados usados para guiar a película.
Carregue a placa de eletroporação no manipulador de placas e feche a tampa. Pressione o pulso"na unidade de eletroporação. Após a eletroporação, as células devem ser transferidas rapidamente para quatro placas de cultura tecidual de 24 poços que contêm um mililitro de meio SDM-79 por poço para recuperação.
Utilize uma pipeta multicanal de 12 canais P200 com metade das ponteiras ausentes, de modo que as seis ponteiras restantes se alinhem com as seis fileiras de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Após a transferência das células da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, lave os poços da placa de 96 poços com o meio proveniente dos poços correspondentes da placa de 24 poços. Em seguida, transfira o lavado de volta para os poços da placa de 24 poços.
Transfira as células eletroporadas da placa de eletroporação de 96 poços para as placas de cultura de tecidos de 24 poços, seguindo o padrão predefinido mostrado aqui. Por exemplo, as células dos poços de numeração ímpar da Linha A da placa de 96 poços são transferidas para a Linha A da Placa A, enquanto as células dos poços de numeração par da Linha A da placa de 96 poços são transferidas para a Linha A da Placa C. Após cada transferência das células da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, lave os poços da placa de 96 poços com o meio da linha correspondente da placa de 24 poços. Em seguida, transfira a lavagem de volta para a placa de 24 poços.
Transferir as células para as placas de 24 poços é confuso, mas você deve ser capaz de rastrear as linhagens celulares resultantes até o ID gênico correto. É fundamental realizar este passo rapidamente para manter as células saudáveis. Depois que todas as células eletroporadas tiverem sido transferidas para as quatro placas de 24 poços, coloque as placas de 24 poços em uma caixa plástica limpa com tampa que forme um selo hermético. Coloque a caixa em um incubador a 28 graus Celsius.
Entre seis a oito horas depois, adicione a cada poço um mililitro de SDM-79 com 10% de FCS contendo antibiótico seletivo. Incube a 28 graus Celsius por nove a 10 dias até que linhagens celulares transgênicas se tornem visíveis. Após uma transfeção em placa de 96 poços para marcação de 96 proteínas diferentes na extremidade C-terminal, as células são transferidas para placas de cultura de tecidos de 24 poços para recuperação e seleção.
Cada poço é então avaliado para determinar se contém células saudáveis e resistentes ao fármaco. Um poço saudável contém predominantemente células altamente ativas que aparecem brilhantes na microscopia de contraste de fase. Neste esquema de exemplo, o verde representa um poço com transfeção bem-sucedida, e o cinza representa um poço com apenas células mortas.
88 de 96, ou 92% dos poços, contêm parasitas transfectados com sucesso após 15 dias de seleção. Após dominar a técnica, levará aproximadamente uma hora desde a contagem das células até o seu plaqueamento após a eletroporação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar as drogas seletivas entre seis e oito horas após a transfeção.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar grandes coortes de proteínas em Trypansoma brucei.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método de alto rendimento para marcação de proteínas em Trypanosoma brucei, permitindo o estudo da localização e função proteica. O protocolo permite a marcação paralela de centenas de proteínas, facilitando estudos genômicos em larga escala.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genômica
Antecedentes
- A marcação de proteínas é essencial para compreender a função proteica.
- Trypanosoma brucei é um organismo modelo para o estudo dos quinetoplastídeos.
- As técnicas de alto rendimento aumentam a eficiência dos estudos de proteínas.
- A marcação pode revelar a localização e a dinâmica de interação das proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para marcação endógena de proteínas em T. brucei.
- Facilitar a investigação da localização e função de proteínas.
- Permitir a marcação genômica em larga escala para estudos abrangentes.
Métodos Utilizados
- Preparação de Misturas Mestras de PCR para amplificação.
- Eletrroporação de células de T. brucei com construtos marcados.
- Validação de produtos de PCR utilizando eletroforese em gel de agarose.
- Uso de marcadores específicos para estudos de interação proteica.
Resultados Principais
- Marcação bem-sucedida de uma grande coorte de proteínas de T. brucei.
- Alto rendimento e reprodutibilidade da amplificação por PCR.
- Viabilidade demonstrada de estudos de proteínas em alto rendimento.
- Validação do método por meio de resultados bem-sucedidos de PCR.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido permite a marcação eficiente de proteínas em T. brucei.
- Este método pode avançar significativamente a pesquisa na área dos cinetoplastídeos.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para obter insights mais profundos sobre as funções das proteínas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação de proteínas em alto rendimento permite a anotação funcional sistemática de proteomas de patógenos, auxiliando na redução de riscos de alvos na descoberta precoce de fármacos antiparasitários. Ao gerar bibliotecas marcadas a partir de loci endógenos, este método fornece dados quantitativos de localização e interação essenciais para priorizar alvos farmacológicos em pipelines de doenças negligenciadas. A escalabilidade da abordagem está alinhada com iniciativas de triagem em todo o genoma, acelerando os ciclos de hipótese à validação nos fluxos de trabalho de validação de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da marcação endógena de proteínas de patógenos para mapeamento de localização e interações.
- Valor Operacional: Facilita a marcação paralela de dezenas a centenas de candidatos, aumentando a produtividade para triagem de alvos e acompanhamento de triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao gerar dados reprodutíveis de localização subcelular e co-imunoprecipitação em grandes coortes de genes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz linhagens celulares validadas que expressam proteínas marcadas, permitindo ensaios padronizados para análise de ligação, localização ou leituras funcionais.
- Valor Operacional: A eletroporação em formato de placa de 96 poços permite a entrega consistente de construtos de DNA, melhorando a reprodutibilidade em plataformas de triagem baseadas em transfeção.
- Escalabilidade: A recuperação em placas de 24 poços favorece o isolamento e seleção clonal, criando um recurso renovável para campanhas de validação de alvos em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Linhagens de proteínas marcadas permitem a correlação entre fenótipos moleculares e sensibilidade a fármacos, apoiando modelos pré-clínicos alinhados a biomarcadores.
- Conhecimento Mecanístico: Facilita a identificação de complexos proteicos e vias metabólicas, auxiliando na compreensão do mecanismo de ação e de mecanismos de resistência.
- Confiança no Alvo: A marcação endógena preserva os níveis nativos de expressão, reduzindo artefatos e melhorando o valor preditivo para avaliações da essencialidade do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase de biologia de descoberta, na qual a marcação em alto rendimento apoia a identificação e validação de alvos antes da otimização de compostos líderes. Ele permite a geração de linhagens celulares prontas para uso em ensaios bioquímicos e baseados em células, conectando acertos genômicos à validação funcional. Resultados como padrões de localização e redes de interação orientam decisões de prosseguir ou não na priorização de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da identificação da localização subcelular e de parceiros de interação de genes candidatos provenientes de telas genômicas.
- Telamento: Permite a preparação de linhagens celulares padronizadas e marcadas para o desenvolvimento reprodutível de ensaios em cascatas de validação de alvos.
- Análises: Gera amostras adequadas para imagem quantitativa e proteômica, permitindo comparar localização, expressão e estados de interação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a validação de alvos moleculares a desfechos fenotípicos por meio de linhagens marcadas utilizáveis em estudos de resposta e resistência a fármacos.
- Reutilização Empresarial: O sistema de plasmídeos e iniciadores é adaptável a diferentes conjuntos de genes, permitindo reutilização em múltiplos projetos sem a necessidade de reengenharia dos componentes principais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio de marcação endógena e paralela que preserva o contexto e a função nativos da proteína.
- Valor Operacional: O fluxo de trabalho padronizado de eletroporação e seleção em placas de 96 poços melhora a reprodutibilidade e reduz o tempo de manipulação por alvo.
- Valor Estratégico: Permite a ampliação rápida dos esforços de validação de alvos, melhorando a eficiência do capital na fase inicial de descoberta ao reduzir a eliminação tardia devido a alvos mal validados.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados multivariados (localização, interações, expressão) para classificação informada de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento especializado em biologia molecular em design de iniciadores para PCR, clonagem e técnicas de cultivo de tripanossomos.
- Depende do acesso a sistemas de eletroporação compatíveis com manipuladores de placas de 96 poços e parâmetros de pulso padronizados.
- Necessita protocolos padronizados de seleção com antibióticos e recuperação para garantir recuperação consistente de linhagens transgênicas em diferentes placas.
- A adaptação a outros tipos de marcadores (por exemplo, fluorescentes, de afinidade, de proximidade) requer validação da funcionalidade do marcador e compatibilidade com ensaios subsequentes.
- O sucesso depende do acompanhamento cuidadoso do mapeamento de poço para gene durante as etapas de transferência, a fim de manter a ligação genótipo-fenótipo.
