De alto rendimento Gene Tagging no Trypanosoma brucei
12 de agosto de 2016
A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.
O objetivo geral deste método é marcar proteínas em Trypansoma brucei de maneira de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo dos cinetoplácidos sobre a localização e a função potencial de grandes coortes de proteínas. A principal vantagem dessa técnica é que um grande número de proteínas pode ser rápida e facilmente marcado em paralelo.
Embora esse método possa fornecer informações sobre a localização, as interações de grandes coortes de proteínas também podem ser investigadas usando outras tags. Por exemplo, a tag BirA para um experimento de mapeamento de proximidade de bio-ID. Demonstrando o procedimento estará Ross Madden, assistente de pesquisa de nosso laboratório.
Antes de iniciar este procedimento, pré-congele um resfriador de PCR de 96 poços no freezer de 80 graus Celsius negativos. Prepare o Master Mix A combinando o seguinte em um tubo de 10 mililitros. 2, 100 microlitros de água destilada deionizada, 105 microlitros de DMSO de grau PCR, 105 microlitros de 10 dNTPs milimolares e 105 microlitros de modelo pPOT.
Despeje o Master Mix A em um reservatório de reagente e alíquota de 23 microlitros de Master Mix A em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Usando uma pipeta multicanal P20 de 12 canais, adicione dois microlitros de primers agrupados de 100 micromolares a cada poço carregado. Sele a placa com filme.
Coloque-o no refrigerador de PCR pré-resfriado e deixe-o congelar por no mínimo 20 minutos a menos 80 graus Celsius. O congelamento do PCR Master Mix A é fundamental para garantir uma reação eficiente de partida a quente, mesmo ao usar uma polimerase específica de partida a quente. Isso leva a uma amplificação reprodutível e de alto rendimento.
Enquanto a placa PCR estiver no freezer, prepare o Master Mix B. Combine o seguinte em um tubo de 10 mililitros. 2.048 microlitros de água destilada deionizada, 525 microlitros de tampão 10X e 52,5 microlitros de polimerase, para um volume total de 2.626 microlitros por placa. Remova a placa PCR e o resfriador PCR do freezer de 80 graus Celsius negativos.
Com a placa ainda no resfriador de PCR, adicione rapidamente 25 microlitros de Master Mix B em cima do Master Mix A congelado em cada poço para um volume total de reação de 50 microlitros. Isso é crítico em termos de tempo e deve ser concluído antes que o Master Mix A possa descongelar. Sele a placa com filme.
Defina o termociclador da seguinte forma. 94 graus Celsius por 10 minutos, depois, 30 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos, 65 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por dois minutos, seguidos por um período de extensão final de 72 graus Celsius por sete minutos. Depois que o bloco atingir 94 graus Celsius, carregue a placa PCR no termociclador e inicie o programa de amplificação.
Comece este procedimento preparando um grande gel de agarose a 1% em Tris-acetato EDTA ou tampão de corrida TAE, com quatro fileiras de poços. Carregue uma escada de DNA de um kb no primeiro e no 28º poços de cada linha. O próximo passo é transferir dois microlitros de produto de PCR diretamente, sem tampão de carga de DNA, para cada faixa do gel, seguindo o padrão mostrado aqui.
Por exemplo, os produtos de PCR das linhas A e B da placa de PCR são carregados nas pistas ímpares e pares da primeira linha do gel, respectivamente. Trabalhando rapidamente para reduzir a possibilidade de contaminação dos amplicons, carregue os produtos de PCR da linha A da placa de PCR nas pistas ímpares da primeira linha do gel. Em seguida, carregue os produtos de PCR da linha B da placa de PCR nas faixas pares da primeira linha do gel.
Carregue os produtos de PCR das linhas C e D da placa de PCR usando esse mesmo padrão, com a linha C nas pistas ímpares e a linha D nas pistas pares da segunda linha do gel. Continue este padrão de carregamento até que cada poço da placa de PCR seja carregado no gel. Coloque o gel no tanque de corrida e encha o tanque com tampão de corrida TAE até que o gel esteja submerso.
Funciona a 100 volts durante 30 minutos. Visualize usando um transiluminador UV. Aqui é mostrado um gel de agarose de validação de PCR representativo de 96 poços, onde 95 de 96 PCRs foram bem-sucedidos.
A PCR sem sucesso foi H11. Este procedimento utiliza Trypansoma brucei, forma pró-cíclica, linhagem celular SMOXP9. Cultive as células até a densidade apropriada, conforme descrito no texto do protocolo, e colha o número necessário de células por centrifugação a 800 vezes G por 10 minutos.
Comece a preparar a eletroporação enquanto as células estão sendo centrifugadas. Conecte o manipulador de placas ao eletroporador. Na unidade do eletroporador, defina a tensão para 1.500 volts, o comprimento do pulso para 100 microssegundos, o número de pulsos para 12 e o intervalo de pulso para 500 milissegundos.
No manipulador de placas, defina a contagem de pulsos como um. Usando uma pipeta multicanal P200 de 12 canais, transfira as reações de PCR da placa de PCR para uma placa de eletroporação descartável de 96 poços. Lave as células em 10 mililitros de citomix modificado e centrifugue novamente a 800 vezes G por 10 minutos.
Ressuspenda as células em 23 mililitros de citomix modificado para uma concentração final de cinco vezes 10 elevado à sétima célula por mililitro. Transferir a suspensão da célula para um reservatório de reagente. Pipete 200 microlitros da solução celular em cada poço da placa de eletroporação e misture com o produto de PCR por pipetagem.
Use um lenço de papel para remover quaisquer gotículas da parte superior da placa para evitar curtos-circuitos. Aplique filme de vedação na parte superior da placa de eletroporação, posicionando-a de forma a deixar os orifícios para os eletrodos descobertos na parte superior e inferior de cada coluna. Evite cobrir os pontos elevados usados para guiar o filme.
Carregue a placa de eletroporação no manipulador de placas e feche a tampa. Pressione o pulso" na unidade do eletroporador. Após a eletroporação, as células devem ser transferidas rapidamente para quatro placas de cultura de tecidos de 24 poços que contêm um mililitro de meio SDM-79 por poço para recuperação.
Use uma pipeta multicanal P200 de 12 canais com todas as outras pontas faltando, de modo que as seis pontas restantes se alinhem com as seis fileiras em uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Depois que as células forem transferidas da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, lave os poços na placa de 96 poços com mídia dos poços correspondentes na placa de 24 poços. Em seguida, transfira a lavagem de volta para os poços na placa de 24 poços.
Transfira as células eletroporadas da placa de eletroporação de 96 poços para as placas de cultura de tecidos de 24 poços no padrão predefinido mostrado aqui. Por exemplo, as células dos poços ímpares da Linha A da placa de 96 poços são transferidas para a Linha A da Placa A, enquanto as células dos poços pares da Linha A da placa de 96 poços são transferidas para a Linha A da Placa C. Lave os poços na placa de 96 poços com meio da linha correspondente da placa de 24 poços. Em seguida, transfira a lavagem de volta para a placa de 24 poços.
A transferência de células para as placas de 24 poços é confusa, mas você deve ser capaz de rastrear as linhagens celulares resultantes para o gene correto ID.It é fundamental fazer essa etapa rapidamente para manter as células saudáveis. Depois que todas as células eletroporadas tiverem sido transferidas para as quatro placas de 24 poços, coloque as placas de 24 poços em uma caixa plástica limpa com uma tampa que forme uma vedação hermética. Coloque a caixa em uma incubadora de 28 graus Celsius.
Entre seis a oito horas depois, adicione a cada poço um mililitro de SDM-79 com 10% FCS contendo antibiótico seletivo. Incube a 28 graus Celsius por nove a 10 dias até que as linhas celulares transgênicas se tornem visíveis. Após uma transfecção de 96 poços para marcar 96 proteínas diferentes no terminal final, as células são transferidas para placas de cultura de tecidos de 24 poços para recuperação e seleção.
Cada poço é então avaliado para determinar se contém células saudáveis e resistentes a medicamentos. Um poço saudável contém predominantemente células altamente ativas que são brilhantes na microscopia de contraste de fase. Neste exemplo esquemático, verde representa um poço com transfecção bem-sucedida e cinza representa um poço apenas com células mortas.
88 de 96, ou 92% dos poços, contêm parasitas transfectados com sucesso após 15 dias de seleção. Uma vez dominado, levará aproximadamente uma hora desde a contagem das células até o revestimento após a eletroporação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar os medicamentos seletivos seis a oito horas após a transfecção.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como marcar grandes coortes de proteínas em Trypansoma brucei.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método de alto rendimento para marcação de proteínas em Trypanosoma brucei, permitindo o estudo da localização e função proteica. O protocolo permite a marcação paralela de centenas de proteínas, facilitando estudos genômicos em larga escala.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Genômica
Antecedentes
- A marcação de proteínas é essencial para compreender a função proteica.
- Trypanosoma brucei é um organismo modelo para o estudo dos quinetoplastídeos.
- As técnicas de alto rendimento aumentam a eficiência dos estudos de proteínas.
- A marcação pode revelar a localização e a dinâmica de interação das proteínas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para marcação endógena de proteínas em T. brucei.
- Facilitar a investigação da localização e função de proteínas.
- Permitir a marcação genômica em larga escala para estudos abrangentes.
Métodos Utilizados
- Preparação de Misturas Mestras de PCR para amplificação.
- Eletrroporação de células de T. brucei com construtos marcados.
- Validação de produtos de PCR utilizando eletroforese em gel de agarose.
- Uso de marcadores específicos para estudos de interação proteica.
Resultados Principais
- Marcação bem-sucedida de uma grande coorte de proteínas de T. brucei.
- Alto rendimento e reprodutibilidade da amplificação por PCR.
- Viabilidade demonstrada de estudos de proteínas em alto rendimento.
- Validação do método por meio de resultados bem-sucedidos de PCR.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido permite a marcação eficiente de proteínas em T. brucei.
- Este método pode avançar significativamente a pesquisa na área dos cinetoplastídeos.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para obter insights mais profundos sobre as funções das proteínas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A marcação de proteínas em alto rendimento permite a anotação funcional sistemática de proteomas de patógenos, auxiliando na redução de riscos de alvos na descoberta precoce de fármacos antiparasitários. Ao gerar bibliotecas marcadas a partir de loci endógenos, este método fornece dados quantitativos de localização e interação essenciais para priorizar alvos farmacológicos em pipelines de doenças negligenciadas. A escalabilidade da abordagem está alinhada com iniciativas de triagem em todo o genoma, acelerando os ciclos de hipótese à validação nos fluxos de trabalho de validação de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da marcação endógena de proteínas de patógenos para mapeamento de localização e interações.
- Valor Operacional: Facilita a marcação paralela de dezenas a centenas de candidatos, aumentando a produtividade para triagem de alvos e acompanhamento de triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao gerar dados reprodutíveis de localização subcelular e co-imunoprecipitação em grandes coortes de genes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Produz linhagens celulares validadas que expressam proteínas marcadas, permitindo ensaios padronizados para análise de ligação, localização ou leituras funcionais.
- Valor Operacional: A eletroporação em formato de placa de 96 poços permite a entrega consistente de construtos de DNA, melhorando a reprodutibilidade em plataformas de triagem baseadas em transfeção.
- Escalabilidade: A recuperação em placas de 24 poços favorece o isolamento e seleção clonal, criando um recurso renovável para campanhas de validação de alvos em etapas subsequentes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Linhagens de proteínas marcadas permitem a correlação entre fenótipos moleculares e sensibilidade a fármacos, apoiando modelos pré-clínicos alinhados a biomarcadores.
- Conhecimento Mecanístico: Facilita a identificação de complexos proteicos e vias metabólicas, auxiliando na compreensão do mecanismo de ação e de mecanismos de resistência.
- Confiança no Alvo: A marcação endógena preserva os níveis nativos de expressão, reduzindo artefatos e melhorando o valor preditivo para avaliações da essencialidade do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere na fase de biologia de descoberta, na qual a marcação em alto rendimento apoia a identificação e validação de alvos antes da otimização de compostos líderes. Ele permite a geração de linhagens celulares prontas para uso em ensaios bioquímicos e baseados em células, conectando acertos genômicos à validação funcional. Resultados como padrões de localização e redes de interação orientam decisões de prosseguir ou não na priorização de alvos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da identificação da localização subcelular e de parceiros de interação de genes candidatos provenientes de telas genômicas.
- Telamento: Permite a preparação de linhagens celulares padronizadas e marcadas para o desenvolvimento reprodutível de ensaios em cascatas de validação de alvos.
- Análises: Gera amostras adequadas para imagem quantitativa e proteômica, permitindo comparar localização, expressão e estados de interação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a validação de alvos moleculares a desfechos fenotípicos por meio de linhagens marcadas utilizáveis em estudos de resposta e resistência a fármacos.
- Reutilização Empresarial: O sistema de plasmídeos e iniciadores é adaptável a diferentes conjuntos de genes, permitindo reutilização em múltiplos projetos sem a necessidade de reengenharia dos componentes principais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio de marcação endógena e paralela que preserva o contexto e a função nativos da proteína.
- Valor Operacional: O fluxo de trabalho padronizado de eletroporação e seleção em placas de 96 poços melhora a reprodutibilidade e reduz o tempo de manipulação por alvo.
- Valor Estratégico: Permite a ampliação rápida dos esforços de validação de alvos, melhorando a eficiência do capital na fase inicial de descoberta ao reduzir a eliminação tardia devido a alvos mal validados.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço ajustado ao risco ao fornecer dados multivariados (localização, interações, expressão) para classificação informada de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer conhecimento especializado em biologia molecular em design de iniciadores para PCR, clonagem e técnicas de cultivo de tripanossomos.
- Depende do acesso a sistemas de eletroporação compatíveis com manipuladores de placas de 96 poços e parâmetros de pulso padronizados.
- Necessita protocolos padronizados de seleção com antibióticos e recuperação para garantir recuperação consistente de linhagens transgênicas em diferentes placas.
- A adaptação a outros tipos de marcadores (por exemplo, fluorescentes, de afinidade, de proximidade) requer validação da funcionalidade do marcador e compatibilidade com ensaios subsequentes.
- O sucesso depende do acompanhamento cuidadoso do mapeamento de poço para gene durante as etapas de transferência, a fim de manter a ligação genótipo-fenótipo.
