Name: De alto rendimento Gene Tagging no Trypanosoma brucei (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Aprenda a marcar proteínas em Trypanosoma brucei com método de alto rendimento. Esta técnica permite estudar localização e função proteica em larga escala, acelerando pesquisas em biologia celular e genômica de cinetoplastídeos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SD foi apoiado por uma Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. Este trabalho foi financiado por doações do Wellcome Trust [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] ao professor Keith Gull. Gostaríamos de agradecer ao professor Keith Gull por conversas e insights úteis.

1. 96 poços longo iniciador de PCR <ol><li> Pré-congelação mais frio de 96 poços de PCR em -80 ° C congelador. </li><li> Num tubo de 10 ml, preparar a Mistura de PCR A: 2100 DDH ul H2O, 105 ul de PCR grau DMSO, 105 ul de dNTPs 10 mM, 105 ul de molde pPOT (25 ng / ul) 9, para um volume total de 2415 mL por placa . </li><li> Aliquota 23 uL em cada poço de uma placa de 96 poços de PCR. </li><li> Adicionar 2 ul de 100 uM reunidas iniciadores para cada uma carregada poço utilizando uma pipeta multicanal com P20 de 12 canais. Selar com filme, colocar a placa no sistema de arrefecimento por PCR pré-gelada e deixa-se congelar durante pelo menos 20 min a -80 ° C. </li><li> Num tubo de 10 ml, preparar a Mistura Principal B: 2048 ul de ddH2O, 525 ul de tampão 10X, 52,5 ul de polimerase para um volume total de 2626 mL por placa. </li><li> Remova a placa e refrigerador de PCR da -80 ° C congelador. </li><li> Com a placa ainda no sistema de arrefecimento de PCR, adicionar 25 ul de Mistura B em cima do congeloun mestre Mistura A para um volume total de reacção de 50 ul. Este é um tempo crítico, e deve ser concluída antes Mix A pode descongelar. Selar placa com película. </li><li> Definir termociclador como se segue: 94 ° C durante 10 min, depois 30 ciclos de 94 ° C durante 15 seg, 65 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 2 min, seguido por um período de extensão final de 72 ° C durante 7 min . </li><li> Coloque a placa de PCR após o bloco atingiu 94 ° C. </li></ol> 2. Validação de 96 poços longo Primer PCR <ol><li> Transmitir um grande 1% (w / v) em gel de agarose em Tris-Acetato EDTA (TAE) com tampão de corrida pentes 4 x 28 poços para dar um gel com 4 filas de poços. Alinhar dentes alternados do pente com a ponta de uma pipeta de canais múltiplos 12 de canal. Cuidadosamente submergir o gel em TAE de tampão de corrida após as pistas são carregados. </li><li> Carga escada de DNA 1 kb para o 1º e 28 de poço de cada linha. </li><li> Usando uma pipeta multicanal P20 12 canais, transferir 2 mL de dir produto de PCRrectamente para cada faixa do gel (Figura 1A). Fazer isso rapidamente para reduzir a possibilidade de contaminar os produtos de amplificação. <ol><li> Coloque os produtos de PCR de linha A da placa de PCR para as pistas numeradas ímpares da 1ª fila do gel (A1 - pista 3, A2 - pista 5 ...... A11 - pista 23, A12 - pista 25) e carregar os produtos de PCR da linha B da placa de PCR para as pistas pares do st linha 1 do gel (B1 - faixa 4, A2 - pista 6 ...... B11 - pista 24, B12 - pista 26). </li><li> Carregar os produtos de PCR a partir de linha C e D da placa de PCR, utilizando o mesmo padrão tal como descrito acima, com a linha C para a linha e pistas numeradas D estranho nas pistas de números pares. Continue este padrão de carga até que cada uma das cavidades da placa de PCR é carregado no gel. tampão de carga de ADN não é necessária para carregar este gel. </li></ol></li><li> Colocar o gel para o tanque de corrida e encher o depósito com tampão de corrida TAE até que o gel está submerso. Executar a 100 V durante 30 min evisualizar utilizando um transiluminador de UV. Ver Figura 1B para um gel de exemplo. Nota: Os produtos de PCR podem ser armazenadas a -20 ° C durante várias semanas antes da transfecção </li></ol> 3. A transfecção de 96 poços <ol><li> Use o T. linha brucei pró-cíclica de células forma SMOXP9 10 para este procedimento e crescer em SDM-79 meios contendo 10% FCS 10. </li><li> Use 1 x 10 7 células por transfecção (total de 1,1 x 10 9 células) ao etiquetar no terminal N da proteína e 2 x 10 7 células por transfecção (total de 2,2 x 10 9 células) ao etiquetar no terminal C de a proteína. Manter as células em mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 células / ml) durante vários dias antes da transfecção e colheita das células para transfecção a uma densidade de 5-8 x 10 6 culas / ml. </li><li> Permitir que os produtos de PCR para a transfecção congelados a descongelar à temperatura ambiente. </li><li> Contagem de células utilizando um hemeocytometer ou contador de células automático. </li><li> Pellet número necessário de células em vários tubos de 50 ml a 800 xg durante 10 min. </li><li> Após centrifugação o sobrenadante de descarte e ressuspender as células em 10 ml cytomix modificado (EGTA 0,8 mM, KCl 24 mM, CaCl 0,15 mM de 2, 10 mM de tampão de fosfato de potássio pH 7,6, 25 mM de HEPES-KOH pH 7,6, 2,6 mM de MgCl2, 0,5% (w / v) de glucose, 100 ug / ml de BSA, 1 mM de hipoxantina, sacarose 144 mM) por tubo. Transferir todas as soluções de células a um único tubo e girar novamente a 800 xg durante 10 min. </li><li> Após centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 23 ml de cytomix modificado para uma concentração final de 5 x 10 7 células / ml. </li><li> Enquanto as células estão girando, adicionar 1 ml de SDM-79 media a cada poço de placas de cultura de tecidos de 4 x 24 poços. Rotular as placas AD e desenhar um anel em torno de bem A1 em cada placa no marcador permanente para ajudar a orientação placa. </li><li> Ligue o manipulador de placa para a electroporator. No electroporaTor unidade definir a tensão de 1.500 V, a duração do pulso de 100 ms e o número de impulsos de 12 e o intervalo de pulso de 500 ms. No processador de chapa, defina a contagem de impulsos para 1. Isto assegura que electroporador que vai aplicar um único impulso para cada uma das 12 colunas da placa electroporação. </li><li> Usando uma pipeta multicanal canal P200 12, transferir as reacções de PCR a partir da placa de PCR para as placas de 96 poços de electroporação descartável, lacuna de 4 mm. </li><li> Quando as células foram fiadas e são ressuspensos a uma concentração final de 5 x 10 7 células / ml (Passo 3.7), transferidos para um reservatório de reagente. Pipete 200 pi da solução de células em cada poço da placa de electroporação utilizando um canal de pipeta multicanal P200 12, misturar com o produto de PCR por pipetagem. </li><li> Utilizando tecido remover quaisquer gotas a partir do topo da placa para evitar curto-circuitos. </li><li> Aplicar a película de vedação proporcionada na embalagem placa para o topo da placa de electroporação, positioning-lo de modo a deixar os furos para os eléctrodos descobertos na parte superior e inferior de cada coluna. Evite cobrir os pontos levantados usados ​​para guiar o filme. </li><li> Coloque a placa de eletroporação para o manipulador de placa e feche a tampa. Pressione &#39;Pulso&#39; na unidade electroporator. </li><li> Após a electroporação, transferir rapidamente as células a partir da placa de electroporação de 96 poços para as placas de cultura de tecidos de 4 x 24 poços. Para transferir as células, usar um canal de pipeta multicanal P200 12 com cada outra ponta ausente de tal modo que as restantes 6 pontas alinham com as 6 linhas sobre uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Transferir as células electroporadas em electroporações as placas de 96 poços em teste padrão pré-definido para as placas de cultura de tecidos de 24 poços (Figura 2A). </li><li> Prepare as pontas de pipeta P200 - para cada transfecção de 96 poços preparar 2 caixas de 96 pontas com cada outra coluna removido. <ol><li> poços de transferência de A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 na placa eletroporação de 96 poços paraplaca seguido uma das placas de cultura de 24 poços de tecido, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 na fileira B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 na linha C e D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 em fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 cavidades para a placa de 24 poços, os poços da placa de 96 poços são então lavadas com meio dos poços correspondentes na 24- bem placa e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li><li> poços de transferência E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 na placa de electroporação de 96 poços a 24-well plate B linha A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 para a linha B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 na linha C e H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 na fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, os poços no 96 -bem placa são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li><li> Transferência de poços A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 na placa electroporação de 96 poços a 24-well plate C fila A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 na fileira B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 na linha C e D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 na fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços a partir do 96 -bem placa para a placa de 24 poços, os poços da placa de 96 poços são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li><li> poços de transferência E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 na placa de electroporação de 96 poços a 24-well plate D linha A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 para a linha B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 em linha C e H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 em fileira D. Após a transferência de cada conjunto de 6 poços da placa de 96 cavidades para a placa de 24 poços, os poços no 96 -bem placa são então lavadas com meio dos poços correspondentes na placa de 24 poços e a lavagem é então transferida para os poços da placa de 24 poços. </li></ol></li><li> Usando um microscópio de contraste de fase invertida, examine um bem de cada coluna para verificar as células. Haverá uma mistura de células vivas e mortas com umquantidade substancial de restos de células. As células vivas pode ser distinguido a partir de células mortas porque eles serão brilhante sob microscopia de contraste de fase e serão em movimento. </li><li> Colocar as placas de 24 poços numa caixa limpa, de plástico com uma tampa que forma uma vedação estanque. Coloque a caixa em um 28 ° C incubadora. </li><li> Entre 6-8 h mais tarde, adicionar 1 ml de SDM-79 com FCS a 10% contendo antibiótico selectivo 2x a cada poço. Na nossa experiência, linhas celulares onde os genes são codificados na extremidade N-terminal são resistentes a concentrações mais elevadas de droga selectiva. Portanto, utilizando blasticidina como um exemplo, a marcação na extremidade N-terminal requer uma concentração final de 20 ug / ml de blasticidina e marcação no terminal C exige uma concentração final de 10 ug / ml de blasticidina. Nota: linhas de células transgênicas se tornarão visíveis 9-10 dias após a transfecção. </li><li> Passagem, pelo menos, duas vezes em droga fresca e meios de comunicação antes da análise. A Figura 2B mostra os resultados de uma transfe típico de 96 poçoscção para colocação de etiquetas 96 proteínas diferentes na terminação N. Avaliar cada poço por microscopia de contraste de fase para determinar se ele contém as células saudáveis, resistentes a drogas. Um bem saudável contém predominantemente (&lt;95%), as células altamente ativos que são brilhantes em microscopia de contraste de fase. Análise subsequente por microscopia de epifluorescência ou western blot é necessário para determinar se a proteína foi marcado com sucesso. </li></ol>

<ol><li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei%3A+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).</li>
<li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li>
<li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li>
<li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+%3A+Abstract+Nature+Biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+enabling+efficient%2C+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197(2015).</li>
<li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037(2012).</li>
<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li>
<li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

melhorias dramáticas na sensibilidade da proteômica e métodos transcriptômica nos últimos 5-10 anos forneceu dados valiosos em milhares de genes e seus produtos. No entanto, as ferramentas para lidar com a função destas proteínas não mantiveram o ritmo. Marcação de uma proteína facilita numerosos experimentos para determinar a sua função. Por exemplo, uma proteína podem ser fundidos com uma proteína fluorescente em uma variedade de cores diferentes para facilitar estudos de localização e de co-localização. Etiquetas desenvolvido para microscopia eletrônica, tais como APEX2 ou miniSOG 11,12, permitir a localização ultra-estrutural da proteína marcada. Marcações de bioquímica, tais como a etiqueta TAP, e ProtC-TEV-Prota (PTP) etiquetar 7,13 permitir a purificação de complexos associados com a proteína para a identificação de parceiros de ligação ou em ensaios bioquímicos in vitro. Os passos específicos que são críticos para o sucesso da PROTOCol são: a incorporação de DMSO para a PCR master mix 1, congelação da PCR master mix 1 antes da adição da Mistura Principal 2, a utilização da polimerase comercial na Master Mix 2 e a modificação do tampão cytomix electroporação. Em nossa experiência, é necessário utilizar o dobro do número de células para C transfections terminal de marcação como for N transfections terminal de marcação, a fim de alcançar uma proporção semelhante de poços positivos. Portanto, todos os passos devem ser realizados tal como descrito. Esta técnica só é susceptível de ser bem sucedida quando a transfecção o inseto pró-cíclica forma tripanossoma. Formas corrente sanguínea tem uma menor eficiência de transfecção 14, além disso eles são propensos a morrer durante a selecção devido a toxicidade dependente de densidade que não está relacionada com a droga seletiva. Portanto, o nosso protocolo anterior representa a melhor tecnologia atual para marcar de forma sanguínea tripanossomas 9. É também provável que o transeficiência de infecção variará dependendo do isolado tripanossoma específica. Este protocolo foi otimizado usando 927 SMOX as formas procíclica - outras estirpes pode exigir otimização adicional. As medidas que podem aumentar a probabilidade de sucesso incluem: o aumento da quantidade do fragmento amplificado por PCR, o aumento do número de células incluídas na transfecção. Apresenta-se um método em que centenas de proteínas pode ser marcado em paralelo. Isso irá facilitar estudos de larga escala sobre a localização e interação, complementando conjuntos de dados grandes existentes e fornecendo informações valiosas para a comunidade. modelos de primers estão disponíveis mediante solicitação e uma lista de modelos de plasmídeos está disponível em: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei é um parasita protozoário que causa trypanosomasis Africano humana e nagana em bovinos. T. brucei é um organismo ideal para a análise da função da proteína, devido à combinação de um genoma de alta qualidade, numerosos conjuntos de dados e proteómica transcriptômica e ferramentas moleculares bem desenvolvidos 1-3. Avanços na proteômica e sequenciamento resultaram em grandes conjuntos de dados que destacam potencialmente genes interessantes 4-6; no entanto, muitos genes têm o mínimo de informação que lhes estão associados nas bases de dados existentes. Existe portanto uma necessidade de um método de alto rendimento para ajudar a caracterização funcional de proteínas. A expressão de uma proteína com a etiqueta pode dar uma multiplicidade de perspectivas sobre a função de uma proteína. Por exemplo, uma proteína etiquetada com um epitopo ou a proteína fluorescente pode estar localizada por microscopia de fluorescência, que dá informações sobre o onde ProtEin pode ser exercer o seu efeito biológico. Alternativamente, uma proteína marcado com um TAP 7, 8 ou HaloTag Sua marca pode ser purificado para ensaios bioquímicos e identificação dos seus parceiros de interação. Recentemente, desenvolveu uma metodologia de marcação robusta para T. brucei 9. Este utilizado longo de iniciadores de PCR para gerar o ADN para transfecção e deixada a marcação de dezenas de proteínas em paralelo - uma grande melhoria com os protocolos existentes. Temos agora melhorou a escalabilidade deste protocolo em formas pró-cíclicos por uma ordem de magnitude. Aqui, apresentamos o nosso método em que realizar a PCR e transfecção em placas de 96 poços, com a recuperação e seleção ocorrendo em placas de 24 poços. Enquanto centenas de proteínas podem agora ser marcado em paralelo este método fornece um método rentável e viável para marcar o genoma inteiro tripanossoma.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotídeo</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>dessalinização apenas (não use purificação adicional)</td></tr> <tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Incluído com o pacote Expand HiFi</td><td>Deve ser grau PCR</td></tr><tr><td>dNTP</td> qualquer polimerase Expand HiFi <td>respeitável</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>Manipulador de placas HT-200</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Manipula as eletroplacas de 96 poços</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Galvanização para eletroporação de 96 poços</td></tr><tr><td>Cloridrato de Blasticidina S</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Higromicina b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Fleomicina</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>Frasco TC de 225 cm, pescoço inclinado, tampa fenólica</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 24 poços</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; Resfriador PCR, sistema de armazenamento a frio sem gelo para placas de 96 poços e tubos de PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Multiplicação de 96 poços&reg; Placa PCR com saia lateral</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

de alto rendimento gene tagging no<em&gt; trypanosoma brucei</em

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Melhorias na espectrometria de massa, sequenciamento e bioinformática geraram grandes conjuntos de dados de genes potencialmente interessantes. A marcação dessas proteínas pode fornecer informações sobre sua função, determinando sua localização dentro da célula e permitindo a identificação do parceiro de interação. Recentemente, publicamos um método rápido e escalável para gerar linhagens celulares de Trypanosoma brucei que expressam uma proteína marcada do locus endógeno. O método foi baseado em um plasmídeo que geramos que, quando acoplado a PCR de primer longo, pode ser usado para modificar um gene para codificar uma proteína marcada em qualquer terminal. Isso permite a marcação de dezenas de proteínas tripanossomas em paralelo, facilitando a validação em larga escala de genes candidatos de interesse. Este sistema pode ser usado para marcar proteínas para localização (usando uma proteína fluorescente, etiqueta de epítopo ou etiqueta de microscopia eletrônica) ou bioquímica (usando etiquetas para purificação, como a etiqueta TAP (purificação de afinidade em tandem)). Aqui, descrevemos um protocolo para realizar a PCR de primer longo e a eletroporação em placas de 96 poços, com a recuperação e seleção de tripanossomas transgênicos ocorrendo em placas de 24 poços. Com esse fluxo de trabalho, centenas de proteínas podem ser marcadas em paralelo; Esta é uma melhoria de ordem de magnitude em relação ao nosso protocolo anterior e a marcação em escala de genoma agora é possível.

Neste transfecção representativa, os iniciadores foram desenhados utilizando o script TagIt perl 9 e sintetizado comercialmente. A 96 poços de PCR foi realizada como descrito e validado (Figura 1A); Neste exemplo, 95/96 PCRs foram bem sucedidos (Figura 1B). Em nossa experiência, repetindo reacções falhadas quer com os iniciadores originais ou iniciadores sintetizados-re não resulta em um PCR bem sucedido. Os fragmentos amplificados foram transferidos para placas de 96 poços de electroporação para electroporação (Figura 2A) e, em seguida, transferidos para placas de cultura de 24 poços para a recuperação e selecção. Depois de tempo suficiente para permitir a selecção de ocorrer, os poços foram marcados para a sobrevivência antes de posterior análise. Neste exemplo, 88/96 cavidades (92%) foram positivos após 15 dias de selecção. <img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1: Validação da longa iniciador de PCR (A) padrão para a transferência de produtos de PCR a partir de placa de 96 poços de PCR para o gel de agarose para a validação de PCR.. (B) de 96 poços de gel representativa validação de PCR para etiquetar 95 genes na extremidade N-terminal, e um fragmento amplificado contendo não &quot;homologia segmentar 5 para actuar como um controlo negativo na transfecção. As amostras são carregados em um 1% (w / v) em gel de agarose e resolvidos a 100 V durante 30 minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figura 2: 96 poços electroporação e selecção (a) o padrão para a transferência de células electroporadas a partir de 96 poços plat electroporação.E para placas de 24 poços de cultura de tecidos. (B) um esquema que mostra uma pontuação ao vivo / morto típico após 15 dias de selecção em placas de 24 poços. Verde representa uma transfecção bem sucedida, cinzento representa um poço com apenas células mortas. Neste exemplo, 88/96 (92%) de poços continham parasitas transfectadas com sucesso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

O objetivo geral deste método é marcar proteínas em Trypansoma brucei de maneira de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área da cinetoplastidíase sobre a localização e a função potencial de grandes grupos de proteínas. A principal vantagem desta técnica é que grandes quantidades de proteínas podem ser marcadas rapidamente e facilmente em paralelo.Embora este método possa fornecer informações sobre a localização, as interações de grandes coortes de proteínas também podem ser investigadas utilizando outras marcas. Por exemplo, a marca BirA para um experimento de mapeamento de proximidade bio-ID. O procedimento será demonstrado por Ross Madden, um assistente de pesquisa do nosso laboratório.Antes de iniciar este procedimento, pré-congele um refrigerador para PCR de 96 poços no congelador a menos 80 graus Celsius. Prepare a Mistura Mestra A combinando os seguintes componentes em um tubo de 10 mililitros: 2, 100 microlitros de água destilada desionizada, 105 microlitros de DMSO grau PCR, 105 microlitros de dNTPs 10 milimolares e 105 microlitros do molde pPOT.Despeje o Master Mix A em um reservatório de reagente e distribua 23 microlitros do Master Mix A em cada poço de uma placa de PCR de 96 poços. Usando uma pipeta multicanal de 12 canais P20, adicione dois microlitros de iniciadores em pool a 100 micromolar a cada poço carregado. Sobreponha a placa com filme vedante.Coloque-o no refrigerador de PCR previamente resfriado e deixe congelar por um mínimo de 20 minutos a menos 80 graus Celsius. O congelamento da Mistura Mestra de PCR A é essencial para garantir uma reação de início quente eficiente, mesmo ao usar uma polimerase específica de início quente. Isso resulta em uma amplificação reprodutível e com alto rendimento.Enquanto a placa de PCR estiver no congelador, prepare o Mix Mestre B. Combine o seguinte em um tubo de 10 mililitros: 2.048 microlitros de água destilada desionizada, 525 microlitros de tampão 10X e 52,5 microlitros de polimerase, obtendo um volume total de 2.626 microlitros por placa. Retire a placa de PCR e o resfriador de PCR do congelador a menos 80 graus Celsius.Com a placa ainda no resfriador de PCR, adicione rapidamente 25 microlitros da Mistura Mestra B sobre a Mistura Mestra A congelada em cada poço, obtendo um volume final de reação de 50 microlitros. Este passo é crítico no tempo e deve ser concluído antes que a Mistura Mestra A descongele. Sobreponha a placa com filme adesivo.Configure o termociclador da seguinte maneira: 94 graus Celsius por 10 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 graus Celsius por 15 segundos, 65 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por dois minutos, seguidos por um período final de alongamento de 72 graus Celsius por sete minutos. Após o bloco atingir 94 graus Celsius, coloque a placa de PCR no termociclador e inicie o programa de amplificação.Inicie este procedimento preparando um grande gel de agarose a 1% em tampão de corrida Tris-acetato-EDTA ou TAE, com quatro linhas de poços. Carregue um marcador de DNA de um kb nos primeiros e 28º poços de cada linha. O próximo passo é transferir dois microlitros do produto de PCR diretamente, sem tampão de carregamento de DNA, para cada poço do gel, seguindo o padrão mostrado aqui.Por exemplo, os produtos de PCR das linhas A e B da placa de PCR são carregados nas alças ímpares e pares da primeira linha do gel, respectivamente. Trabalhando rapidamente para reduzir a possibilidade de contaminar os amplicons, carregue os produtos de PCR da linha A da placa de PCR nas alças ímpares da primeira linha do gel. Em seguida, carregue os produtos de PCR da linha B da placa de PCR nas alças pares da primeira linha do gel.Carregue os produtos de PCR das linhas C e D da placa de PCR usando esse mesmo padrão, com a linha C nas canais ímpares e a linha D nas canais pares da segunda fileira do gel. Continue esse padrão de carregamento até que cada poço da placa de PCR seja carregado no gel. Coloque o gel no tanque de eletroforese e encha o tanque com tampão de corrida TAE até que o gel esteja submerso.Execute a 100 volts por 30 minutos. Visualize utilizando um transiluminador UV. É mostrado aqui um gel de agarose representativo de validação de PCR em placa de 96 poços, no qual 95 dos 96 PCRs foram bem-sucedidos.O PCR malsucedido foi o H11. Este procedimento utiliza a linhagem celular SMOXP9 da forma procíclica de Trypansoma brucei. Cultive as células até a densidade apropriada conforme descrito no texto do protocolo e recolha o número necessário de células por centrifugação a 800 vezes G durante 10 minutos.Comece a preparar a eletroporação enquanto as células estão sendo centrifugadas. Conecte o manipulador de placas ao eletroporador. Na unidade do eletroporador, ajuste a voltagem para 1.500 volts, a duração do pulso para 100 microssegundos, o número de pulsos para 12 e o intervalo entre pulsos para 500 milissegundos.No manipulador de placas, defina a contagem de pulsos para um. Usando uma pipeta multicanal de 12 canais P200, transfira as reações de PCR da placa de PCR para uma placa descartável de eletroporação de 96 poços. Lave as células em 10 mililitros de citomix modificado e centrifugue novamente a 800 vezes G por 10 minutos.Resuspenda as células em 23 mililitros de citomix modificado para uma concentração final de cinco vezes 10 à sétima células por mililitro. Transfira a suspensão celular para um reservatório de reagentes. Pipete 200 microlitros da solução celular em cada poço da placa de eletroporação e misture com o produto de PCR por pipetagem.Use um tecido para remover qualquer gota da parte superior da placa para evitar curtos-circuitos. Aplique uma película selante na parte superior da placa de eletroporação, posicionando-a de forma a deixar os orifícios para os eletrodos descobertos na parte superior e inferior de cada coluna. Evite cobrir os pontos elevados usados para guiar a película.Carregue a placa de eletroporação no manipulador de placas e feche a tampa. Pressione o pulso"na unidade de eletroporação. Após a eletroporação, as células devem ser transferidas rapidamente para quatro placas de cultura tecidual de 24 poços que contêm um mililitro de meio SDM-79 por poço para recuperação.Utilize uma pipeta multicanal de 12 canais P200 com metade das ponteiras ausentes, de modo que as seis ponteiras restantes se alinhem com as seis fileiras de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços. Após a transferência das células da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, lave os poços da placa de 96 poços com o meio proveniente dos poços correspondentes da placa de 24 poços. Em seguida, transfira o lavado de volta para os poços da placa de 24 poços.Transfira as células eletroporadas da placa de eletroporação de 96 poços para as placas de cultura de tecidos de 24 poços, seguindo o padrão predefinido mostrado aqui. Por exemplo, as células dos poços de numeração ímpar da Linha A da placa de 96 poços são transferidas para a Linha A da Placa A, enquanto as células dos poços de numeração par da Linha A da placa de 96 poços são transferidas para a Linha A da Placa C. Após cada transferência das células da placa de 96 poços para a placa de 24 poços, lave os poços da placa de 96 poços com o meio da linha correspondente da placa de 24 poços. Em seguida, transfira a lavagem de volta para a placa de 24 poços.Transferir as células para as placas de 24 poços é confuso, mas você deve ser capaz de rastrear as linhagens celulares resultantes até o ID gênico correto. É fundamental realizar este passo rapidamente para manter as células saudáveis. Depois que todas as células eletroporadas tiverem sido transferidas para as quatro placas de 24 poços, coloque as placas de 24 poços em uma caixa plástica limpa com tampa que forme um selo hermético. Coloque a caixa em um incubador a 28 graus Celsius.Entre seis a oito horas depois, adicione a cada poço um mililitro de SDM-79 com 10% de FCS contendo antibiótico seletivo. Incube a 28 graus Celsius por nove a 10 dias até que linhagens celulares transgênicas se tornem visíveis. Após uma transfeção em placa de 96 poços para marcação de 96 proteínas diferentes na extremidade C-terminal, as células são transferidas para placas de cultura de tecidos de 24 poços para recuperação e seleção.Cada poço é então avaliado para determinar se contém células saudáveis e resistentes ao fármaco. Um poço saudável contém predominantemente células altamente ativas que aparecem brilhantes na microscopia de contraste de fase. Neste esquema de exemplo, o verde representa um poço com transfeção bem-sucedida, e o cinza representa um poço com apenas células mortas.88 de 96, ou 92% dos poços, contêm parasitas transfectados com sucesso após 15 dias de seleção. Após dominar a técnica, levará aproximadamente uma hora desde a contagem das células até o seu plaqueamento após a eletroporação. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adicionar as drogas seletivas entre seis e oito horas após a transfeção.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como marcar grandes coortes de proteínas em Trypansoma brucei.

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Os telômeros são essenciais para a estabilidade cromossômica ea estrutura G-saliência dos telômeros é essencial para a telomerase mediada manutenção dos telômeros. Recentemente, aprovou dois métodos para detectar a estrutura G-saliência dos telômeros...

Exame da estrutura G-Telomere saliência na Trypanosoma brucei</em

Aqui nós relatamos um método para usar tipo I e tipo...

Manipulação genética em<em&gt; Δku80</em&gt; Cepas para Análise Genômica Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

A dinâmica dos glicossomos em tripanossomas africanos é difícil de estudar por técnicas tradicionais de biologia celular, como microscopia eletrônica e fluorescência.  Como meio de observar o comportamento dinâmico das organelas, um sistema repórter de organelas fluorescentes tem sido usado em conjunto com a citometria de fluxo para monitorar a dinâmica dos glicossomos em tempo real em parasitas vivos.

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Um ensaio baseado em ribozima altamente sensível, aplicável à triagem de alto rendimento de produtos químicos direcionados ao processo exclusivo de edição de RNA em patógenos tripanossomatídeos, é descrito neste artigo. Os inibidores podem ser usados como ferramentas para análise orientada por hipóteses do processo de edição de RNA e, finalmente, como terapêutica.

RNA Catalisador como repórter para Triagem Drogas contra edição de RNA em Tripanossomas

Este manuscrito descreve o uso de uma cepa bioluminescente de tripanossomas africanos para permitir o rastreamento de infecções em estágio avançado e demonstra como imagens ao vivo in vivo podem ser usadas para visualizar infecções no sistema nervoso central em tempo real.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Os tripanossomas africanos cultivados in vitro sofrem variação antigênica em uma taxa baixa, de modo que as populações são compostas de parasitas que expressam um tipo de glicoproteína de superfície variante dominante (VSG) e uma pequena população de variantes "trocadas".  Este protocolo descreve um método rápido para detectar e quantificar essas populações.

detecção de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant glicoproteína de superfície por Magnetic celular ativado Seleção e citometria de fluxo

Aqui, nós descrevemos um protocolo para introduzir um nocaute do gene no amastigotas extracelular de Trypanosoma cruzi, usando o sistema de crispr/Cas9. O phenotype do crescimento pode ser seguido acima pela contagem da pilha da cultura axênicos do amastigotas ou pela proliferação de amastigotas intracelular após a invasão da pilha de anfitrião.

Introduzindo um nocaute genético diretamente no estágio Amastigote do Trypanosoma cruzi usando o sistema crispr/Cas9

Descrevemos um ensaio colorimétrico de alta produtividade medindo β-galactosidase atividade em três estágios do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. Este ensaio pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível.

In vitro Triagem de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase

Este estudo apresenta um protocolo detalhado para a realização de microscopia de expansão ultraestrutural em três estágios do ciclo de vida in vitro do Trypanosoma cruzi, o patógeno responsável pela doença de Chagas. Incluímos a técnica otimizada para proteínas do citoesqueleto e marcação de pan-proteoma.

Microscopia de Expansão Ultraestrutural em Três Estágios do Ciclo de Vida In Vitro do Trypanosoma cruzi

Descrevemos um método para estudar como o pH responde a pistas ambientais nos glicossomas da forma sanguínea de tripanossomas africanos. Essa abordagem envolve um sensor de proteína hereditária sensível ao pH em combinação com citometria de fluxo para medir a dinâmica do pH, tanto como um ensaio de curso de tempo quanto em um formato de tela de alto rendimento.

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Aprenda a marcar proteínas em Trypanosoma brucei com método de alto rendimento. Esta técnica permite estudar localização e função proteica em larga escala, acelerando pesquisas em biologia celular e genômica de cinetoplastídeos.

De alto rendimento Gene Tagging no

Explorar mais vídeos