Name: Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a co-cultivar microbioma intestinal com vilosidades humanas em dispositivo microfluídico gut-on-a-chip. Este método simula peristalse e fluxo para estudar interações hospedeiro-microbioma e doenças gastrointestinais.

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Agradecemos a Sri Kosuri (Instituto Wyss da Universidade de Harvard) por fornecer a cepa de E. coli marcada com GFP. Este trabalho foi apoiado pela Agência de Projetos de Pesquisa Avançada de Defesa sob o Acordo de Cooperação Número W911NF-12-2-0036, Food and Drug Administration sob contrato #HHSF223201310079C e o Instituto Wyss de Engenharia Biologicamente Inspirada da Universidade de Harvard. As visões e conclusões contidas neste documento são de responsabilidade dos autores e não devem ser interpretadas como representando as políticas oficiais, expressas ou implícitas, do Escritório de Pesquisa do Exército, do Laboratório de Pesquisa do Exército, da Food and Drug Administration ou do Governo dos EUA. O governo dos EUA está autorizado a reproduzir e distribuir reimpressões para fins governamentais, não obstante qualquer notação de direitos autorais aqui contida.

1. A microfabricação de um dispositivo Gut-on-a-chip Nota: A a-chip intestino-em-um dispositivo de microfluidos feita por polímero de silicone transparente, permeável ao gás (polidimetilsiloxano, PDMS), contendo dois microcanais paralelas (1 mm de comprimento x largura de 150 um de altura x 1 cm), separadas por uma flexível porosa (10 um de diâmetro de poro, 25 um de poro no espaçamento de poro) PDMS membrana de 5,9. Fabricar o gut-on-a-chip (Figura 1A, esquerda), seguindo os passos indicados. <ol><li> Microfabricação Processo do 5,9 Gut-on-a-chip. <ol><li> Prepare PDMS não curado, desgaseificada por mistura do pré-polímero de PDMS e o agente de cura (15: 1 w / w), e colocá-lo no exsicador de vácuo durante 30 min. </li><li> Despeje 30 g e 3 g de não curados, PDMS desgaseificados em cada molde de silicone que tem SU-8 micropadrões base da parte superior e os microcanais inferiores do a-chip gut-on-, respectivamente. Em seguida, curar a 60 ° C num forno seco durante pelo lleste 4 h. </li><li> Desmoldar o PDMS camadas superior e inferior de cada molde de silicone por corte em torno da borda usando um bisturi cirúrgico. Soco 6 furos (duas entradas, duas saídas e duas câmaras de vácuo) utilizando um perfurador de biópsia (2,0 mm de diâmetro do furo). </li><li> Preparar a membrana porosa por vazamento 10 g de PDMS não curado e desgaseificado em uma bolacha de silício silanizado contendo pós matrizes com pilares circulares (10 um de diâmetro, 25 ^ m de altura) sobrepondo com uma superfície plana, silanizada camada de suporte PDMS (15: 1, W / w; 1 cm de espessura). Coloque um calcador 3 kg de peso sobre a configuração e curar o polímero a 60 ° C durante 12 h ou mais. </li><li> Desmoldar a configuração de uma membrana porosa de PDMS aderido à laje de apoio PDMS da bolacha de silício por cuidadosamente levantando o canto da placa de bolacha, e que descasca fora até que a membrana porosa PDMS é completamente separado da bolacha. </li><li> Expor o lado do canal de uma camada superior (PDMS, 15: 1, w / w) e o lado da membrana porosa ao plAsma gerado por um tratador de corona de mão durante 1 min, e 3 s, respectivamente. </li><li> Coloque as superfícies tratadas com plasma da membrana PDMS poroso e camada de microcanais superior em um contato conformada, colocando cada peça em paralelo sem quaisquer bolhas de ar. </li><li> Incubar toda a configuração a 80 ° CO / N para a ligação irreversível de as duas camadas de PDMS. </li><li> Descolar a camada de suporte a partir de PDMS a montagem de uma camada superior com uma membrana porosa com cuidado levanta acima do canto da camada de suporte, e que descasca fora até que a camada de suporte é completamente separada da camada superior com a membrana. </li><li> Corte as porções desta membrana localizada sobre as câmaras de vácuo (as duas câmaras situadas de cada lado do canal principal), utilizando uma pinça de ponta fina para tornar as câmaras de vácuo ocos. </li><li> Expor o lado com a membrana ligada no topo da peça e o lado com os canais gravados na parte inferior do pedaço de plasma num mesmo modo como descrito iN passo 1.1.6 durante 1 min. </li><li> Alinhar a camada superior microcanal com uma membrana porosa e a camada inferior com um contacto conformada colocando cada peça em paralelo, sem quaisquer bolhas de ar sob um estereoscópio. </li><li> Curar toda a configuração num forno seco a 80 ° CO / N para produzir uma escala dispositivo completo gut-on-a-chip microfluídico contendo duas câmaras de vácuo ocas ao lado do canal de Cell microfluídico. </li></ol></li><li> Para ligar a tubagem de entrada e na saída de cada porta ligada à parte superior ou inferior dos microcanais em uma a-chip-on-intestinal através de uma agulha de extremidade romba de 90 ° dobrada de aço inoxidável. </li><li> Ligue a tubagem aos buracos ligados às câmaras de vácuo, utilizando uma agulha romba-end 90 ° curvado de aço inoxidável. </li><li> Esterilizar os microcanais e a tubagem de fluxo de 70% (v / v) de etanol utilizando uma mistura 1 ml esterilizados seringa descartável. </li><li> Secar os microcanais e tubos em um 60 ° C forno seco O / N. </li></ol> 2. Crescimento de micromotorEred Intestinal Villi no Dispositivo Gut-on-a-chip <ol><li> Semente células intestinais epiteliais (por exemplo, Caco-2BBE) sobre um 5,9 microdispositivos Gut-on-a-chip. <ol><li> Esteriliza-se o dispositivo com 70% (v / v) de etanol (ver passo 1.4), utilizando uma seringa de 1 ml descartável esterilizado seguido por secagem num forno a 60 ° C seco S / N (ver passo 1.5), antes da activação da superfície. </li><li> Expor a configuração completa de um microssistema intestino-on-a-chip (ou seja, um corpo do intestino-on-a-chip conectado a tubagem) à luz ultravioleta (253,7 nm) e o ozono simultaneamente, durante 40 min. </li><li> Arrefecer o dispositivo à TA durante 15 min com luz UV de uma cabine de segurança biológica (BSC). </li><li> Introduzir 100 ul de o revestimento de ECM solução que consistiria uma mistura de 50 ug / Tipo ml Eu colagénio e 300 ug / ml de mistura de matriz extracelular diluída no livre de soro da Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) - em ambos os microcanais superior e inferior usando um descartável , estéril seringa de 1 ml. </li><li> Incubate toda a configuração de uma temperatura de 37 ° C humidificada com 5% de CO2 durante 1 hora. </li><li> Desgaseifica 50 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura completo (DMEM, 20%, v / v, de soro fetal de bovino (FBS), 100 unidades / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina; aliquotadas em 3 ml seringa descartável) usando um sistema de filtração de 50 ml (0,45 um de tamanho de poro) no BSC durante 1 min. <ol><li> Passar o meio de pré-aquecido através do sistema de filtragem e bater suavemente sobre a forma filtrada durante 1 minuto para remover quaisquer bolhas de gás ou dissolvido no meio. </li></ol></li><li> Coloque a alíquota de meio completo desgaseificada numa seringa descartável de 3 ml e incuba-se num banho a 37 ° C humidificada com 5% de CO2 durante 1 hora. </li><li> Conectar duas seringas descartáveis ​​de 3 ml contendo desgaseificada, meio de cultura completo pré-aquecido para os microcanais superiores e inferiores. </li><li> Fluir o meio de cultura celular completo desgaseificada no microcanal superior usando uma bomba de seringa no volumétricataxa de 30 ul / h de fluxo (equivalente à tensão de corte a 0,02 dyne / cm2) em uma temperatura de 37 ° C humidificada com 5% de CO 2 incubadora S / N. </li></ol></li><li> Formação de Microengineered Caco-2 vilosidades no o a-chip-on-Gut. <ol><li> Utilização de células Caco-2BBE com o número de passagem entre 50 e 65. </li><li> Crescer as células Caco-2 em um frasco T75 contendo meio de cultura completo em uma temperatura de 37 ° C humidificada com 5% de CO2 durante 4-5 dias para obter células completamente confluentes. </li><li> Adicionar 10 ml de Ca 2+ e Mg 2+ -livre PBS para totalmente as células Caco-2 confluentes, cultivadas num frasco T75, células de lavar, em seguida, aspirar para fora PBS. Repita esta etapa duas vezes. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de tripsina / EDTA a 0,05% e incuba-se num banho a 37 ° C humidificada com 5% de CO2 durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células dissociadas com 10 ml de meio de cultura celular completo pré-aquecido (com FBS) por pipetagem para cima e para baixo de três a cinco vezes. </li><li> Spin down a suspensão de células por centrifugation a 500 xg durante 5 min, em seguida, remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender novamente com 1 ml de pré-aquecido meio completo para ajustar a densidade celular a 1,5 x 10 ~ 5 células / cm2 no dispositivo. Use hemocitómetro para estimar a densidade de células. </li><li> Infundir 100 ul da ressuspensas Caco-2 em células do microcanal superior (lado do lúmen), colocando uma seringa descartável de 1 ml ligada a uma 25 G5 / 8 agulha na saída da tubagem ligada ao microcanal superior. </li><li> Fixe todas as entradas e saídas de tubos ligados aos microcanais superior e inferior usando grampos da pasta. </li><li> Incubar toda a configuração de uma temperatura de 37 ° C, humidificada com 5% de CO2 durante 1 hora para permitir que dissociado células Caco-2 a aderir à superfície da membrana porosa. </li><li> Remover os grampos e retomar o fluxo de meio de cultura apenas ao microcanal superior a 30 uL / ​​hr usando uma bomba de seringa até que as células formam uma monocamada intacta durante 24-36 hr. Use os contras de faseT ou microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) para confirmar junções célula-célula em uma monocamada de células. </li><li> Quando as células formam uma monocamada, a perfusão do meio de cultura para ambos os superiores (lúmen) e inferior microcanais (capilar) à mesma taxa de fluxo de 30 mL / hr. </li><li> Aplicação de deformações mecânicas que imitam movimentos peristaltismo-like 5,9. <ol><li> Ligar a bomba de vácuo equipada com o equipamento de tensão. </li><li> Ligar as câmaras de vácuo para o controlador de vácuo através de uma tubagem com um conector de aço inoxidável. </li><li> Defina o movimento de alongamento de 10% de deformação média de células com uma frequência de 0,15 Hz com o modo de função seno cíclica sobre o software que controla a vácuo, em seguida, clique em &quot;Start&quot;. </li></ol></li><li> Manter o fluxo constante de meio de cultura (30 ul / h) em ambos os microcanais superiores e inferiores para o confluente monocamada de células Caco-2 sob deformações mecânicas (10%, 0,15 Hz) durante 100 ~ hr. Nota: as células Caco-2 sponneamente sofrer morfogénese das vilosidades com projecções 3D ondulados estendidos em direcção ao lúmen do microcanal epitelial 5,8-10. </li></ol></li><li> Para emular as funções de nível de órgãos do intestino humano vivo com interface de tecido lúmen capilar no intestino-on-a-chip 10, siga os passos conforme descrito. <ol><li> Cresça microengineered Caco-2 vilosidades, repetindo os passos de 2,1 a 2,2. </li><li> Fluir o meio de pré-aquecido de co-cultura (uma mistura de meio de cultura celular completo de Caco-2 e o meio de cultura completo HMVECs, 1: 1 v / v) para os microcanais superiores e inferiores a 30? L / h. </li><li> Introduzir 100 ul de células dissociadas normais capilar microvasculares endoteliais humanas (HMVECs, densidade celular final, ~ 5,0 x 10 5 células / cm2) na parte inferior das microcanal pelo método idêntico descrito nos passos a partir de 2.2.3 a 2.2.9. </li><li> Coloque um pedaço rectangular de PDMS curado (0,5 cm x 1 cm x 1 cm; comprimento x largura x altura; 15: 1, W/ w elastômero: agente de cura) em cima do dispositivo gut-on-a-chip, em seguida, virar toda a configuração do dispositivo de cabeça para baixo (ou seja, do microcanal superior enfrenta para o lado negativo, e do microcanal inferior enfrenta para a cabeça). </li><li> Incubar a configuração em um temperatura de 37 ° C, humidificada com 5% de CO2 durante 1 hora para permitir HMVECs dissociados para aderir à superfície da membrana porosa no microcanal inferior. </li><li> Retire uma configuração inteira da incubadora de CO 2, e virar a configuração mais uma vez. </li><li> Fluxo do meio de co-cultura pré-aquecido (uma mistura de meio de cultura celular completo de Caco-2 e o meio de cultura HMVECs completa, 1: 1 v / v) em ambos os microcanais superiores e inferiores a 30? L / h, com movimentos de alongamento mecânico ( 10%, 0,15 Hz), durante pelo menos três dias para formar junções célula-célula de uma monocamada endotelial. </li></ol></li></ol> 3. Host-gut Microbiome Co-cultura num microdispositivos Gut-on-a-chip <ol><li> Realizar pré-cultura of das células bacterianas como segue para co-cultura microbioma commensal intestino na vilosidades intestinais microengineered. <ol><li> Ressuspender a mistura em pó bacterianas probióticas liofilizado em 10 ml de mistura (1: 1, v / v) de Lactobacilli MRS Broth autoclavado e reforçado de Clostridium Médio. </li><li> Ajustar a densidade de células final de aproximadamente 0,2 unidades de densidade óptica (a 600 nm) por adição de uma quantidade adequada de meio de, em seguida, 3 ml de aliquota de suspensão de células microbianas num tubo estéril de 10 ml descartável. </li><li> Colocar os tubos contendo células microbianas ressuspensos no recipiente anaeróbio. Adicionar dois maços de anaeróbio saquinho de geração de gás no recipiente. Fechar a tampa do recipiente hermeticamente e incubar a configuração do recipiente sem agitação num banho a 37 ° C humidificado a 5% de CO 2 incubadora S / N. </li></ol></li><li> Inoculação de Microbiome e Co-cultura com células epiteliais intestinal 5,10. <ol><li> Prepare 3 ml seringas descartáveis ​​contendo antibioti desgaseificadoC-livre meio de cultura celular (ou seja, meio DMEM com FBS a 20%). Ver 2.1.6 para o processo de desgasagem do meio de cultura. </li><li> Retire uma configuração de todo o dispositivo de gut-on-a-chip contendo vilosidades microengineered da incubadora de CO 2, em seguida, passar para a cabine de segurança biológica. </li><li> Remover seringas ligada à tubagem ligada para os microcanais superiores e inferiores. Conectar seringas preparadas em 3.2.1 para o dispositivo, para trazer de volta na incubadora de CO 2, então o fluxo este meio de cultura isento de antibiótico durante 12 horas antes da sementeira da microbiota. </li><li> Girar as células bacterianas probióticas pré-cultivadas a mistura (ver passos em 3.1) a 10.000 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante usando vácuo, em seguida ressuspender em meio de DMEM livre de antibióticos (densidade celular final, ~ 1,0 x 10 7 UFC / ml). </li><li> Infundir a suspensão de células para o lado do lúmen do microcanal contendo as vilosidades intestinais &quot;livres de germes&quot;, usando uma seringa descartável de 1 ml ligada a uma 25G5 / 8 agulha. Permitir que a aderência de células microbianas para a superfície apical das vilosidades intestinais durante ~ 1,5 horas sem fluxo por fixação a toda a extremidade da tubagem. </li><li> Perfundir o meio de cultura livre de antibióticos pré-aquecido em ambos os microcanais superiores e inferiores a 40? L / h, com deformações cíclicas rítmicos (10%, 0,15 Hz). </li><li> Para a co-cultura de proteína verde fluorescente (GFP) marcado com E. coli (GFP E. coli; não-patogênico hospedeiras coli DH5-alfa E.) 10,11 células com vilosidades microengineered, pré-cultivar GFP E. células de E. coli em meio LB autoclavado a 37 ° C sob agitação condição (200 rpm) durante 12 h. Repita o procedimento a partir do 3.2.5 para 3.2.6 para realizar co-cultura de GFP E. células de E. coli com vilosidades microengineered. </li></ol></li><li> Células imagem 5,8-10 <ol><li> Execute DIC, epifluorescência, ou de varredura a laser microscopia confocal para gravar microbiana e epitelial morfologia 5,8,10. <ol><li> Para a imagem DIC, tirar uma configuração do microssistema gut-on-a-chip da incubadora de CO 2, coloque a configuração do dispositivo no palco de um microscópio, em seguida, registrar a morfologia celular. </li><li> Para imagiologia de fluorescência de epitélio das vilosidades, fluir PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min. <ol><li> Fix vilosidades com 4% (w / v) de paraformaldeído durante 15 min. Então o fluxo de PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min. </li><li> Permeabilizar as vilosidades com 0,3% (v / v) de Triton X-100 diluído em PBS contendo 2% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) durante 10 min. Então o fluxo de PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min. </li><li> As células de bloco com 2% (w / v) de solução de BSA em PBS durante 1 h. Então o fluxo de PBS por lavagem das células em 100 ul / h durante 10 min. </li><li> Adicionar 300 nM de 4 &#39;, solução de dicloridrato de 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) diluída em PBS para a coloração nuclear sob protecção contra a luz. </li><li> Adicionar 25 unidades / ml de phalloidin fluorescente(Conjugado faloidina-CF647) dissolvida em PBS para a coloração de F-actina sob a proteção de luz. </li><li> gravar imagens das células fluorescentes coradas utilizando um microscópio confocal de varredura a laser. Nota: Um objetivo 25X foi aplicado com zoom óptico apropriado durante a microscopia confocal. Na Figura 3B, foi utilizado aproximadamente 525x ampliação. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Donald E. Ingber é fundador da Emulate Inc., detém participação acionária na empresa e preside seu Conselho Consultivo Científico. Os outros autores não têm divulgações financeiras.

Compreender as interacções hospedeiro-microbioma é fundamental para o avanço da medicina; No entanto, os modelos de cultura de células tradicional realizados numa placa de plástico ou de uma placa de estática não suportam a co-cultura estável de células intestinais humanas com micróbios intestinais viver durante mais de 1-2 dias na maior parte porque as células microbianas cobrir as células de mamíferos in vitro. A população microbiana overgrowing rapidamente consome oxigénio e nutrientes, produzindo subsequent...

O intestino humano abriga uma matriz surpreendentemente diversificado de espécies microbianas (&lt;1.000 espécies) e um número enorme de células microbianas (10 vezes mais do que as células hospedeiras humanas) e genes (100 vezes mais do que o genoma humano) 1. Estes microbiomas humanos desempenham um papel fundamental no metabolismo de nutrientes e xenobióticos, regulação das respostas imunitárias, e a manutenção da homeostase intestinal 2. Não é de surpreender, tendo em conta estas diversas funções, o microbioma intestinal comensal extensivamente modula saúde e da doença 3. Assim, a compreensão do papel das interações microbioma intestinal e host-micróbio são de grande importância para promover gastrointestinal saúde (GI) e explorar novas terapêuticas para distúrbios intestinais 4. No entanto, já existente em modelos de intestino in vitro (por exemplo, culturas estáticas) restringir a co-cultura de hospedeiro-microbiota a um curto período de tempo (&lt;1 dia) porque as células microbianas e cobrir comprometer barreira intestinal5 funções. Modelos animais de substituição (por exemplo, 6 ou geneticamente modificada livre de germes ratos 7) também não são comumente usados ​​para estudar host-gut microbiome crosstalk porque a colonização e manutenção estável do microbioma intestinal humana são difíceis. Para superar estes desafios, que recentemente desenvolveu um ser humano biomimético &quot;Gut-on-a-Chip&quot; sistema microphysiological (Figura 1A, à esquerda) para emular as interações microbioma host-intestinais que ocorrem no intestino humano vivo 5,8. O microdispositivo intestino-on-a-chip contém dois canais de microfluidos paralelas separadas por um flexível, poroso, matriz extracelular (ECM) -Revestido membrana revestida por epiteliais intestinais humanas Caco-2 As células, imitando o lúmen intestinal interface para o tecido-capilares (Figura 1A , à direita) 9. deformações rítmicos cíclicos orientada por vácuo induzir deformações mecânicas fisiológicas que imitam mudanças normalmente Induced pelos movimentos peristálticos (Figura 1A, direita). Curiosamente, quando as células Caco-2 são cultivadas no intestino-on-a-chip para mais de 100 h, eles formam espontaneamente tridimensional (3D) vilosidades intestinais com junções apertadas, fronteiras escova apicais, células proliferativas limitados a criptas basais, a produção de muco, aumento da atividade de metabolização de drogas (por exemplo, o citocromo P450 3A4, CYP3A4), e reforçada glucose recaptação 8. Neste microambiente &#39;livre de germes &quot;, que era possível a co-cultura de Lactobacillus rhamnosus GG probiótico ou a formação de uma mistura terapêutica bacteriana probiótico com células epiteliais do hospedeiro por até duas semanas 5,10. Neste estudo, descrevemos o protocolo detalhado para executar-hospedeiro intestino co-cultura microbioma no dispositivo de intestino-on-a-chip por um período prolongado. Além disso, discutimos questões críticas e desafios potenciais a serem considerados para uma ampla aplicação deste host-microbioma co-cultura protocolo.

<table><tbody><tr><td>Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 25 mM de glicose e 25 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>10564-011</td><td>Aqueça-o a 37 &deg; C em banho-maria.</td></tr><tr><td>Caldo Difco Lactobacilli MRS</td><td>BD</td><td>288120</td><td>Execute a autoclave a 121 &deg; C por 15 min.</td></tr><tr><td>Poli(dimetilsiloxano)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>15:1 (p/p), PDMS: agente de cura</td></tr><tr><td>Caco-2BBE linha de carcinoma colorretal humano</td><td>Harvard Digestive Disease Center</td><td></td><td>Adenocarcinoma colorretal humano&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>20% (v/v) em DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina-glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>diluição de 1/100 em DMEM</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato</td><td>Sondas</td><td>moleculares D1306</td><td>Coloração de</td></tr><tr><td>núcleos Faloidina-CF647 conjugado (25 unidades/ml)</td><td>Biotium</td><td>00041</td><td>Coloração de</td></tr> <tr>F-actina<td>Sistema de tensão Flexcell FX-5000</td><td>Flexcell International Corporation</td><td>FX5K</td><td>Movimento de stretcing semelhante ao peristaltismo (10% de tensão celular, frequência de 0,15 Hz)</td></tr><tr><td>Microscópio de epifluorescência invertida</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Imaging, DIC</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura</td><td>Leica</td><td>DMI6000</td><td>Imaging, Fluorescência</td></tr><tr><td>UVO Cleaner</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342</td><td>Ativação superficial do colágeno tipo I do chip intestinal</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td>Componente de matriz extracelular para cultura de células no chip</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354234</td><td>Componente de matriz extracelular para cultura de células no chip</td></tr><tr><td>Seringa descartável de 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Injeção de células e meios 25</td></tr><tr><td>G 5/8 agulha</td><td>BD</td><td>329651</td><td>Injeção de células e meios</td></tr><tr><td>Bomba de seringa Braintree</td><td>Scientific Inc.</td><td>BS-8000</td><td>Equipamento de injeção no chip</td></tr><tr><td>VSL#3</td><td>Sigma-Tau Pharmaceuticals</td><td>7-45749-01782-6</td><td>Uma formulação de 8 diferentes micróbios intestinais comensais</td></tr><tr><td>Meio Clostridial Reforçado</td><td>BD</td><td>218081</td><td>Meio de cultura de bactérias anaeróbicas</td></tr><tr><td>Sistema de Recipiente Anaeróbio GasPak EZ com Indicador</td><td>BD</td><td>260001</td><td>Sachê gerador de gás anaeróbico&nbsp;</td></tr><tr>Ciência <td>157-4-100</td> da <td>microscopia eletrônica</td> <td>do paraformaldeído de 4%</td><td>Fixando as pilhas para corar</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Permeabilizando as pilhas</td></tr><tr><td>Albumina bovina do soro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>Agente de bloqueio para a coloração das pilhas</td></tr><tr><td>Tratamento da corona</td><td>Produtos eletrotécnicos</td><td>BD-20AC</td><td>Gerador do plasma para a fabricação da microplaqueta</td></tr><tr><td>Steriflip&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>Desgaseificação do meio de cultura completo</td></tr><tr><td>Hemocitômetro descartável</td><td>iNCYTO</td><td>DHC-N01</td><td>para contagem manual de células</td></tr></tbody></table>

co-cultura de vida microbiome com intestinal microengineered humano villi num gut-on-a-chip microfluidic dispositivo

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Aqui, descrevemos um protocolo para realizar co-cultura de longo prazo de multi-espécies microbioma intestinal humana com vilosidades intestinais microengineered em um dispositivo microphysiological gut-on-a-chip humano. Nós recapitular a interface tecido intestinal lúmen capilar num dispositivo de microfluidos, onde as deformações mecânicas e fisiológicas fluxo de cisalhamento de fluidos são constantemente aplicada para imitar o peristaltismo. No microcanal lúmen, epiteliais intestinais células Caco-2 humanos são cultivados de modo a formar um epitélio das vilosidades &#39;livre de germes&#39; e regenerar pequenas vilosidades intestinais. células microbianas cultivadas são pré-inoculado para o lado do lúmen para estabelecer um ecossistema hospedeira-micróbio. Depois de células microbianas aderir à superfície apical das vilosidades, fluxo de fluido e deformações mecânicas são retomadas a produzir um micro-ambiente de estado estacionário na qual meio de cultura fresco é continuamente fornecido e bactérias não ligadas (bem como resíduos bacterianas) são continuamente removidos. Após prolongado co-cultura fdias ROM para semanas, múltiplos microcolônias são encontrados para ser localizado de forma aleatória entre as vilosidades, e tanto as células epiteliais microbiana e permanecer viável e funcional durante pelo menos uma semana de cultura. Nosso protocolo de co-cultura pode ser adaptado para proporcionar uma plataforma versátil para outros ecossistemas hospedeiras-microbiota que pode ser encontrado em vários órgãos humanos, o que pode facilitar o estudo in vitro do papel da microbiota humana na orquestração de saúde e na doença.

Para emular o ecossistema hospedeira-microbiota intestinal humano in vitro, que é necessário desenvolver um protocolo experimental para reconstituir a co-cultura estável a longo prazo das bactérias intestinais e as células epiteliais intestinais humanas sob condições fisiológicas, tais como peristalse mecânica semelhante e fluxo de fluido. Aqui, nós utilizamos um microdispositivo biomimético gut-on-a-chip (Figura 1A) para co-cultura de célu...

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar o crescimento de vilosidades em células intestinais humanas sob movimentos e fluxo semelhantes à peristalse em um dispositivo microfluídico do tipo intestino-em-um-chip, bem como mostrar como co-cultivar essas células com microbioma intestinal vivo. Assim, este método pode auxiliar em questões fundamentais nas áreas de gastroenterologia, microbiologia clínica e ciências farmacêuticas, ajudando a identificar mecanismos de doenças e a validar a eficácia e toxicidade de novos compostos medicamentosos. A principal vantagem desta técnica é que os pesquisadores podem estabelecer in vitro um ecossistema pós-microbioma viável e funcional do intestino humano vivo, utilizando um sistema microfisiológico.As implicações dessa técnica podem estender-se a doenças como a colite ulcerativa ou a doença de Crohn, já que o co-cultivo estável de células hospedeiras com o microbioma pode emular as complexidades dessas doenças. Embora este método possa fornecer uma visão sobre as interações complexas entre o microbioma intestinal e o sistema imunológico no intestino, ele também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos onde ocorrem interações entre hospedeiro e microrganismos, como a pele, o trato genital ou a cavidade oral. Para começar, prepare o dispositivo microfluídico gut-on-a-chip conforme descrito no protocolo textual complementar.O dispositivo consiste em um polímero de silício transparente permeável a gases que contém dois microcanais paralelos, separados por uma membrana de PDMS porosa e flexível. Em cada lado dos canais há câmaras de vácuo, que podem ser usadas para aplicar tensão mecânica cíclica. Esterilize o dispositivo utilizando uma seringa de um mililitro para fazer passar etanol a 70% pelos canais.Em seguida, seque o dispositivo em uma estufa seca a 60 °C durante a noite. No dia seguinte, exponha o microsistema tipo-pequeno-intestino-em-um-chip, juntamente com sua tubulação conectada, simultaneamente à luz UV e ao ozônio por 40 minutos. Deixe o dispositivo esfriar permanecendo sob a luz UV de uma cabine de segurança biológica por 15 minutos.Em seguida, carregue 100 microlitros de uma solução codificadora de matriz extracelular em uma seringa de um mililitro e dispense-a no microcanal superior do dispositivo. Repita este processo para revestir também o microcanal inferior. Coloque todo o conjunto em uma incubadora úmida a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por uma hora.Durante a incubação, desgaseifique o meio de cultura completo pré-aquecido passando-o através de um filtro de 0,45 mícron em um sistema de filtração de 50 mililitros durante um minuto. Bata suavemente no meio filtrado por um minuto para remover quaisquer bolhas ou gases dissolvidos no meio. Em seguida, transfira o meio completo desgaseificado para duas seringas descartáveis de três mililitros e incube as seringas por uma hora.Em seguida, conecte as seringas aos microcanais superior e inferior do chip-de-intestino e remova a solução codificadora fazendo passar meio completo pelos microcanais superior e inferior com um pulso suave. Depois, use uma bomba de seringa para fazer fluir o meio de cultura celular completo e dessupado pelo microcanal superior do dispositivo, enquanto incuba o chip durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Colete células epiteliais intestinais Caco-2 de um frasco T75 totalmente confluente lavando primeiro as células com 10 mililitros de PBS sem cálcio e sem magnésio.Em seguida, aspire o PBS e repita a lavagem mais duas vezes. A seguir, adicione um mililitro de solução de Tripsina-EDTA 0,05% e incube o frasco por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a dessanexação, adicione 10 mililitros de meio de cultura celular completo pré-aquecido e pipete a suspensão celular para cima e para baixo de três a cinco vezes antes de transferi-la para um tubo de centrífuga.Centrifugue a suspensão celular. Em seguida, remova o sobrenadante e re-suspenda as células a 150.000 células por centímetro quadrado em meio completo pré-aquecido. Aspire 500 microlitros da suspensão celular em uma seringa descartável de um mililitro, equipada com uma agulha de 25 graus, 5/8 de polegada.Em seguida, distribua 100 microlitros da suspensão celular no microcanal superior através da tubulação de saída. Depois, prenda todos os inlets e outlets conectados aos microcanais superior e inferior utilizando clipes de papel. Incube todo o conjunto por uma hora para permitir que as células epiteliais intestinais adiram à superfície da membrana porosa.Em seguida, remova as pinças e conecte a tubulação do canal superior a uma seringa preenchida com meio de cultura, previamente colocada em uma bomba de infusão. Retome o fluxo de meio de cultura para o microcanal superior a 30 microlitros por hora até que as células formem uma monocamada íntegra. Assim que as células formarem uma monocamada, conecte o canal inferior à segunda seringa e realize a perfusão do meio de cultura em ambos os microcanais — o lúmen superior e o microcanal capilar inferior — na mesma taxa de fluxo de 30 microlitros por hora.Para criar um movimento semelhante à peristalse no chip, ligue primeiro a bomba de vácuo. Conecte as câmaras de vácuo do dispositivo ao controlador de vácuo por meio de tubos com um conector de aço inoxidável. Em seguida, configure o controlador para fornecer um movimento cíclico de alongamento de 10% da deformação celular média a uma frequência de 0,15 hertz e, depois, clique em iniciar.Mantenha o fluxo do meio de cultura por ambos os microcanais superior e inferior na presença de deformações mecânicas por pelo menos 80 horas para induzir o crescimento das vilosidades. Prepare uma mistura 50/50 de Caldo MRS Autoclavado para Lactobacilos e Meio Reforçado para Clostrídios. Em seguida, re-suspenda uma mistura bacteriana probiótica liofilizada em 10 mililitros da mistura.Meça a densidade óptica da mistura a 600 nanômetros e ajuste a densidade final das células a aproximadamente 0,2 unidades de densidade óptica. Aliquote três mililitros da suspensão microbiana ajustada em tubos descartáveis estéreis de 10 mililitros. Coloque os alíquotas em um recipiente anaeróbio e adicione dois envelopes de sachês geradores de gás anaeróbio ao recipiente.Feche firmemente a tampa do recipiente e incube o conjunto sem agitação em uma estufa durante a noite. Em seguida, prepare o meio de cultura celular sem antibiótico desgaseificado e carregue-o em seringas descartáveis de três mililitros. Transfira o dispositivo tipo intestino-em-um-chip contendo vilosidades microfabricadas para a cabine de segurança biológica.Remova as seringas conectadas aos microcanais superior e inferior do dispositivo e substitua-as por seringas contendo meio de cultura celular sem antibiótico e desgaseificado. Após concluir, coloque o dispositivo de volta no incubador de CO₂. Em seguida, faça fluir o meio de cultura sem antibiótico pelo dispositivo por 12 horas antes de introduzir o microbioma.Em seguida, centrifugue a mistura de células bacterianas probióticas previamente cultivadas. Aspire o sobrenadante e, então, re-suspenda as bactérias em DMEM sem antibiótico. Carregue aproximadamente 100 microlitros dessa suspensão celular em uma seringa de um mililitro acoplada a uma agulha de 25 graus, 5/8 de polegada.Infunda as bactérias no lado do lúmen do microcanal contendo as vilosidades intestinais previamente livres de microrganismos. Deixe as células microbianas aderirem à superfície apical das vilosidades intestinais por uma hora e meia sem fluxo, utilizando grampos na tubulação. Em seguida, perfunda o meio de cultura pré-aquecido e livre de antibióticos nos microcanais superior e inferior a 40 microlitros por hora com deformações rítmicas cíclicas.Este protocolo de co-cultivo permite a colonização estável de múltiplas espécies de bactérias probióticas no espaço interviloso. Microcolônias bacterianas viáveis podem ser mantidas por até duas semanas em co-cultivo. É mostrado aqui um co-cultivo diferente, composto por E.coli marcado com GFP e vilosidades intestinais.O aumento de alta potência mostra claramente a localização das microcolônias bacterianas no ponto temporal de 72 horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de injetar suave e lentamente o meio de cultura nos canais microfluídicos para evitar danificar a monocamada de células epiteliais nos estágios iniciais do cultivo. Com base neste método, um método de cocultivo com células imunes humanas também pode fornecer algumas pistas sobre como o microbioma pode interagir com o sistema imunológico e influenciar a homeostase e a saúde intestinal ideal.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reconstituir o microambiente do intestino humano e demonstrar a cocultura entre o microbioma e as vilosidades intestinais humanas in vitro. Trabalhar com bactérias patogênicas e células humanas é extremamente perigoso, portanto, não se esqueça de trabalhar dentro de uma cabine de segurança biológica.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Neste vídeo, descrevemos a metodologia para configurar um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações entre fragmentos de tecido intestinal de camundongos e bactérias intestinais específicas. O dispositivo consiste em dois pares de portas de entrada e saída, a primeira conectando o lúmen do tecido intestinal e fornecendo a suspensão bacteriana específica a ele, e a segunda fornecendo continuamente meios aos poços do dispositivo para manter a viabilidade do tecido...

Um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações hospedeiro-microbiota

Aqui, apresentamos um protocolo para cocultura de células primárias, modelos de tecidos e biópsias por punção em um chip microfluídico de múltiplos órgãos por até 28 dias. Células endoteliais microvasculares dérmicas humanas, agregados hepáticos e biópsias de pele foram combinados com sucesso em uma circulação de mídia comum.

O Chip Multi-organ - Uma plataforma microfluídica para longo prazo Coculture Multi-tecidos

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Aplicação avançada em Vitro cultivo tecnologia para estudar a Microbiota do intestino humano

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele simplificado e indiferenciado tridimensional usando uma plataforma microfluida micromaquinda. Uma abordagem de fluxo paralelo permite a deposição in situ de um compartimento dérmico para a semeadura de células epiteliais em cima, todas controladas por bombas de seringa.

Geração de um modelo simplificado de pele em um chip tridimensional em uma plataforma microfluida micromaquinda

Este artigo apresenta um método único para analisar as interações hospedeiro-microbioma usando um novo sistema de cultura de órgãos intestinais para experimentos ex vivo.

Um sistema de cultura de órgãos intestinais para analisar interações hospedeira-microbiota

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

neuroHuMiX é um modelo avançado de gut-on-a-chip para estudar as interações de células bacterianas, epiteliais e neuronais sob condições de co-cultura proximal e representativa. Este modelo permite desvendar os mecanismos moleculares subjacentes à comunicação entre o microbioma intestinal e o sistema nervoso.

Um modelo Gut-on-a-Chip para estudar o eixo microbioma intestinal-sistema nervoso

Este protocolo descreve um modelo in vitro de enterocolite necrosante (ECN), que pode ser usado para estudos mecanísticos da patogênese da doença. Apresenta um chip microfluídico semeado com enteróides intestinais derivados do intestino neonatal humano, células endoteliais e o microbioma intestinal de um neonato com ECN grave.

Modelo Microfluídico de Enterocolite Necrosante Incorporando Enteróides Intestinais Neonatais Humanos e um Microbioma Disbiótico

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Este artigo descreve um protocolo para a criação de um dispositivo de cultura microfluídica vagina-on-a-chip (Vagina Chip) que permite o estudo das interações do hospedeiro humano com um microbioma vaginal vivo sob condições microaerofílicas. Este chip pode ser usado como uma ferramenta para investigar doenças vaginais, bem como para desenvolver e testar possíveis contramedidas terapêuticas.

Modelagem de microambientes vaginais saudáveis e disbióticos em uma vagina humana em um chip

Nosso protocolo detalhado descreve a criação e o uso do modelo avançado de intestino em chip, que simula a mucosa intestinal humana com estruturas 3D e vários tipos de células, permitindo uma análise aprofundada das respostas imunes e funções celulares em resposta à colonização microbiana.

Modelo Intestino em Chip Imunocompetente para Análise das Respostas Imunes da Mucosa Intestinal

Aprenda a co-cultivar microbioma intestinal com vilosidades humanas em dispositivo microfluídico gut-on-a-chip. Este método simula peristalse e fluxo para estudar interações hospedeiro-microbioma e doenças gastrointestinais.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

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