Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar o crescimento de vilosidades em células intestinais humanas sob movimentos e fluxo semelhantes à peristalse em um dispositivo microfluídico do tipo intestino-em-um-chip, bem como mostrar como co-cultivar essas células com microbioma intestinal vivo. Assim, este método pode auxiliar em questões fundamentais nas áreas de gastroenterologia, microbiologia clínica e ciências farmacêuticas, ajudando a identificar mecanismos de doenças e a validar a eficácia e toxicidade de novos compostos medicamentosos. A principal vantagem desta técnica é que os pesquisadores podem estabelecer in vitro um ecossistema pós-microbioma viável e funcional do intestino humano vivo, utilizando um sistema microfisiológico.

As implicações dessa técnica podem estender-se a doenças como a colite ulcerativa ou a doença de Crohn, já que o co-cultivo estável de células hospedeiras com o microbioma pode emular as complexidades dessas doenças. Embora este método possa fornecer uma visão sobre as interações complexas entre o microbioma intestinal e o sistema imunológico no intestino, ele também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos onde ocorrem interações entre hospedeiro e microrganismos, como a pele, o trato genital ou a cavidade oral. Para começar, prepare o dispositivo microfluídico gut-on-a-chip conforme descrito no protocolo textual complementar.

O dispositivo consiste em um polímero de silício transparente permeável a gases que contém dois microcanais paralelos, separados por uma membrana de PDMS porosa e flexível. Em cada lado dos canais há câmaras de vácuo, que podem ser usadas para aplicar tensão mecânica cíclica. Esterilize o dispositivo utilizando uma seringa de um mililitro para fazer passar etanol a 70% pelos canais.

Em seguida, seque o dispositivo em uma estufa seca a 60 °C durante a noite. No dia seguinte, exponha o microsistema tipo-pequeno-intestino-em-um-chip, juntamente com sua tubulação conectada, simultaneamente à luz UV e ao ozônio por 40 minutos. Deixe o dispositivo esfriar permanecendo sob a luz UV de uma cabine de segurança biológica por 15 minutos.

Em seguida, carregue 100 microlitros de uma solução codificadora de matriz extracelular em uma seringa de um mililitro e dispense-a no microcanal superior do dispositivo. Repita este processo para revestir também o microcanal inferior. Coloque todo o conjunto em uma incubadora úmida a 37 graus Celsius com 5% de CO2 por uma hora.

Durante a incubação, desgaseifique o meio de cultura completo pré-aquecido passando-o através de um filtro de 0,45 mícron em um sistema de filtração de 50 mililitros durante um minuto. Bata suavemente no meio filtrado por um minuto para remover quaisquer bolhas ou gases dissolvidos no meio. Em seguida, transfira o meio completo desgaseificado para duas seringas descartáveis de três mililitros e incube as seringas por uma hora.

Em seguida, conecte as seringas aos microcanais superior e inferior do chip-de-intestino e remova a solução codificadora fazendo passar meio completo pelos microcanais superior e inferior com um pulso suave. Depois, use uma bomba de seringa para fazer fluir o meio de cultura celular completo e dessupado pelo microcanal superior do dispositivo, enquanto incuba o chip durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de CO₂. Colete células epiteliais intestinais Caco-2 de um frasco T75 totalmente confluente lavando primeiro as células com 10 mililitros de PBS sem cálcio e sem magnésio.

Em seguida, aspire o PBS e repita a lavagem mais duas vezes. A seguir, adicione um mililitro de solução de Tripsina-EDTA 0,05% e incube o frasco por cinco minutos a 37 graus Celsius. Após a dessanexação, adicione 10 mililitros de meio de cultura celular completo pré-aquecido e pipete a suspensão celular para cima e para baixo de três a cinco vezes antes de transferi-la para um tubo de centrífuga.

Centrifugue a suspensão celular. Em seguida, remova o sobrenadante e re-suspenda as células a 150.000 células por centímetro quadrado em meio completo pré-aquecido. Aspire 500 microlitros da suspensão celular em uma seringa descartável de um mililitro, equipada com uma agulha de 25 graus, 5/8 de polegada.

Em seguida, distribua 100 microlitros da suspensão celular no microcanal superior através da tubulação de saída. Depois, prenda todos os inlets e outlets conectados aos microcanais superior e inferior utilizando clipes de papel. Incube todo o conjunto por uma hora para permitir que as células epiteliais intestinais adiram à superfície da membrana porosa.

Em seguida, remova as pinças e conecte a tubulação do canal superior a uma seringa preenchida com meio de cultura, previamente colocada em uma bomba de infusão. Retome o fluxo de meio de cultura para o microcanal superior a 30 microlitros por hora até que as células formem uma monocamada íntegra. Assim que as células formarem uma monocamada, conecte o canal inferior à segunda seringa e realize a perfusão do meio de cultura em ambos os microcanais — o lúmen superior e o microcanal capilar inferior — na mesma taxa de fluxo de 30 microlitros por hora.

Para criar um movimento semelhante à peristalse no chip, ligue primeiro a bomba de vácuo. Conecte as câmaras de vácuo do dispositivo ao controlador de vácuo por meio de tubos com um conector de aço inoxidável. Em seguida, configure o controlador para fornecer um movimento cíclico de alongamento de 10% da deformação celular média a uma frequência de 0,15 hertz e, depois, clique em iniciar.

Mantenha o fluxo do meio de cultura por ambos os microcanais superior e inferior na presença de deformações mecânicas por pelo menos 80 horas para induzir o crescimento das vilosidades. Prepare uma mistura 50/50 de Caldo MRS Autoclavado para Lactobacilos e Meio Reforçado para Clostrídios. Em seguida, re-suspenda uma mistura bacteriana probiótica liofilizada em 10 mililitros da mistura.

Meça a densidade óptica da mistura a 600 nanômetros e ajuste a densidade final das células a aproximadamente 0,2 unidades de densidade óptica. Aliquote três mililitros da suspensão microbiana ajustada em tubos descartáveis estéreis de 10 mililitros. Coloque os alíquotas em um recipiente anaeróbio e adicione dois envelopes de sachês geradores de gás anaeróbio ao recipiente.

Feche firmemente a tampa do recipiente e incube o conjunto sem agitação em uma estufa durante a noite. Em seguida, prepare o meio de cultura celular sem antibiótico desgaseificado e carregue-o em seringas descartáveis de três mililitros. Transfira o dispositivo tipo intestino-em-um-chip contendo vilosidades microfabricadas para a cabine de segurança biológica.

Remova as seringas conectadas aos microcanais superior e inferior do dispositivo e substitua-as por seringas contendo meio de cultura celular sem antibiótico e desgaseificado. Após concluir, coloque o dispositivo de volta no incubador de CO₂. Em seguida, faça fluir o meio de cultura sem antibiótico pelo dispositivo por 12 horas antes de introduzir o microbioma.

Em seguida, centrifugue a mistura de células bacterianas probióticas previamente cultivadas. Aspire o sobrenadante e, então, re-suspenda as bactérias em DMEM sem antibiótico. Carregue aproximadamente 100 microlitros dessa suspensão celular em uma seringa de um mililitro acoplada a uma agulha de 25 graus, 5/8 de polegada.

Infunda as bactérias no lado do lúmen do microcanal contendo as vilosidades intestinais previamente livres de microrganismos. Deixe as células microbianas aderirem à superfície apical das vilosidades intestinais por uma hora e meia sem fluxo, utilizando grampos na tubulação. Em seguida, perfunda o meio de cultura pré-aquecido e livre de antibióticos nos microcanais superior e inferior a 40 microlitros por hora com deformações rítmicas cíclicas.

Este protocolo de co-cultivo permite a colonização estável de múltiplas espécies de bactérias probióticas no espaço interviloso. Microcolônias bacterianas viáveis podem ser mantidas por até duas semanas em co-cultivo. É mostrado aqui um co-cultivo diferente, composto por E.coli marcado com GFP e vilosidades intestinais.

O aumento de alta potência mostra claramente a localização das microcolônias bacterianas no ponto temporal de 72 horas. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de injetar suave e lentamente o meio de cultura nos canais microfluídicos para evitar danificar a monocamada de células epiteliais nos estágios iniciais do cultivo. Com base neste método, um método de cocultivo com células imunes humanas também pode fornecer algumas pistas sobre como o microbioma pode interagir com o sistema imunológico e influenciar a homeostase e a saúde intestinal ideal.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como reconstituir o microambiente do intestino humano e demonstrar a cocultura entre o microbioma e as vilosidades intestinais humanas in vitro. Trabalhar com bactérias patogênicas e células humanas é extremamente perigoso, portanto, não se esqueça de trabalhar dentro de uma cabine de segurança biológica.