Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de
20 de agosto de 2016
Descrevemos aqui uma configuração comportamental e método de análise de dados para testar as respostas olfativas de até 100 moscas do vinagre (Drosophila melanogaster). Este sistema pode ser usado com estímulos olfativos únicos ou múltiplos e adaptável para ativação optogenética ou silenciamento de subconjuntos neuronais.
O objetivo geral deste experimento é analisar os comportamentos olfativos de moscas em um olfatômetro de quatro quadrantes utilizando um script fornecido de software automatizado para rastreamento de moscas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre como os sistemas neurais olfativos detectam o mundo externo e como o cérebro decodifica e orienta decisões comportamentais. A principal vantagem desta técnica é sua versatilidade e robustez, permitindo testes repetidos de respostas olfativas por populações de moscas em uma arena experimental ampla.
Para este protocolo, prepare cinco câmaras de odorizante que consistem em um recipiente externo de plástico, um recipiente interno de vidro e um inserto de tampa de PTFE feito sob medida. O inserto é uma tampa original do recipiente com a parte central removida e duas válvulas unidirecionais acopladas. Utilize quatro das câmaras de odorizante como controles de solvente e uma câmara para um odorizante de teste.
Certifique-se de que cada câmara esteja limpa e, em seguida, carregue um recipiente de odorizante com um mililitro de solvente ou diluição de odorizante. Depois, verifique a posição do recipiente na câmara de plástico e certifique-se de que nenhum líquido tenha sido derramado. Fixe a tampa usando o parafuso e uma junta de vedação no inserto de PTFE para evitar vazamentos.
Crie as moscas em meio padrão de farinha de milho. Em um frasco padrão, coloque 30 machos e 30 fêmeas e permita que os ovos sejam postos por cinco dias à temperatura ambiente. A partir desses frascos, colete moscas recém-emergidas.
Para cada coorte experimental, colete 25 moscas macho e 25 fêmeas sob breve anestesia com dióxido de carbono e deixe o coorte envelhecer em meio padrão para moscas por dois a quatro dias. Entre 40 e 42 horas antes do experimento, transfira o coorte para um frasco com cerca de 10 mililitros de gel de agarose a um por cento para umidade, sem alimento. A inanição ajuda a aumentar o movimento geral, e mais de 90% das moscas devem sobreviver ao processo de inanição.
Se mais de 10% morrerem, o que pode ocorrer em um genótipo fraco, tente usar um período de jejum de um dia para todas as moscas do experimento. Pelo menos cinco minutos antes, ligue o controlador de temperatura e ajuste-o para 25 graus Celsius. Em seguida, conecte as câmaras de odorizante à arena por meio de um tubo plástico.
Verifique a taxa de fluxo de ar em cada quadrante da arena usando um medidor eletrônico de fluxo. Certifique-se de que os fluxos de ar controle e com odorizante estejam ambos funcionando a 100 mililitros por minuto. As moscas são muito sensíveis ao fluxo de ar, e é essencial verificar o fluxo de ar de cada quadrante antes de cada experimento.
Agora, limpe a arena e as placas de vidro utilizando etanol 70%. Passe em todas as partes duas a três vezes e deixe secar completamente ao ar antes de prosseguir. Em seguida, prenda as placas de vidro à arena.
Em seguida, transfira as moscas para a arena sem anestesia. Usando a gravidade, permita que entrem através do orifício em uma das placas de vidro e, então, cubra o orifício com uma malha circular. Agora, coloque a arena com as moscas na câmara opaca à luz.
Em seguida, conecte os quatro fluxos de ar controle a cada canto da arena. Feche a porta da câmara e deixe as moscas aclimatarem-se ao novo ambiente por 10 a 15 minutos. Após o período de aclimatação, realize um experimento controle de cinco a 10 minutos no qual as moscas são expostas a quatro fluxos de ar controle.
É essencial analisar imediatamente os dados. Se as moscas não estiverem distribuídas uniformemente na arena, esta deve ser redefinida. É fundamental testar o comportamento de moscas controle apenas com ar limpo.
Isso verificará rapidamente se todas as condições de fundo estão normais. Vazamento de luz, desequilíbrio de temperatura, arena inclinada ou contaminação por odores podem causar problemas. Se necessário, descarte as moscas e limpe a arena novamente.
Se for suspeita uma contaminação por odorizante, substitua todas as tubulações. Continue repetindo o teste controle com novos grupos até que os animais não apresentem preferência por nenhum dos quatro quadrantes. Em seguida, conecte a câmara do odorizante de teste ao equipamento usando uma válvula de três vias, ou reconecte as tubulações e realize um experimento-teste por cinco a 10 minutos.
Para gravações experimentais mais longas, interrompa e reinicie rapidamente o programa de rastreamento a cada 20 minutos, ou os arquivos de dados serão muito grandes. Entre os testes, descarte as moscas, limpe a arena e as placas de vidro com etanol 70% e substitua os tubos conectores. Mantenha o fluxo de ar seco para lavar continuamente o sistema.
Para maior eficiência, é recomendável ter duas arenas para que a limpeza possa ser realizada durante os experimentos. Se vários experimentos forem realizados no mesmo dia, tome extremo cuidado para garantir que nenhum odor permaneça no sistema de um experimento anterior. Normalmente, isso não é um problema com baixas concentrações de odorizante ou com CO2, mas para estímulos altamente concentrados, pode ser necessário um intervalo de até 24 horas entre os experimentos.
Para a análise dos dados, utilize a rotina personalizada fornecida em Matlab para converter os dados para o formato Matlab. Carregue o arquivo de dados brutos gerado em tempo real pelo software de rastreamento e crie uma máscara espacial que siga os contornos da arena. Aplique a máscara aos dados brutos para remover todos os pontos de dados que caem fora da arena, pois eles representam ruído.
Em seguida, remova todos os pontos de dados que se movem a menos de 0,163 centímetros por segundo por mais de três segundos. Esses dados provavelmente são ruídos ou moscas imóveis. Agora, visualize os pontos de dados restantes plotando todos eles ao longo dos períodos de gravação.
Os dados também podem ser visualizados como trajetórias individuais. Os limites do odor podem ser estimados rapidamente com base nos dados comportamentais da mosca. Em seguida, calcule o índice de atração e realize os testes estatísticos conforme descrito no protocolo do texto.
25 moscas machos e 25 fêmeas foram testadas no aparelho comportamental. Em resposta ao ar seco, as moscas exploraram toda a arena sem preferência por qualquer quadrante. A linha mostra a trajetória rastreada de uma mosca.
Quando o vinagre de maçã foi introduzido no fluxo de ar do quadrante superior esquerdo, a maioria das moscas foi atraída para esse quadrante odorante. Quando um odor repelente, o propionato de etila a 10%, foi introduzido no quadrante superior esquerdo, esse quadrante foi evitado. O índice de atratividade desse quadrante foi de 0,68.
O índice de atratividade é o índice mais utilizado na medição da resposta olfativa. Um valor acima ou abaixo de zero indica atração ou repulsão. O script compensou pequenas variações na posição da arena entre os ensaios.
Pontos de dados que poderiam ser ruído ou moscas imóveis foram removidos. Embora o teste possa ser realizado por qualquer duração, é interessante observar as alterações nos movimentos do grupo em intervalos de 10 segundos para perceber a habituação ao odor e outros fenômenos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como executar e analisar eficazmente comportamentos olfativos em um ensaio de quatro campos.
Uma vez dominado, cada experimento olfativo pode ser concluído em cerca de uma hora, e rotineiramente realizamos de quatro a seis experimentos durante um dia.
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Visão Geral
Este artigo apresenta uma configuração comportamental e um método de análise de dados para avaliar respostas olfativas em moscas-das-frutas (Drosophila melanogaster). O sistema foi projetado para uso com estímulos olfativos únicos ou múltiplos e pode ser adaptado para manipulação optogenética de subconjuntos neuronais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Sistemas Olfativos
Antecedentes
- O estudo concentra-se em como os sistemas neurais olfativos detectam estímulos externos.
- Compreender a decodificação cerebral de informações sensoriais é crucial para a tomada de decisões comportamentais.
- A montagem do olfatômetro permite testes controlados de respostas olfativas.
- Este método pode acomodar uma grande população de moscas para testes repetidos.
Objetivo do Estudo
- Realizar ensaios de comportamentos olfativos de Drosophila melanogaster.
- Investigar os mecanismos de detecção olfativa e respostas comportamentais.
- Fornecer uma estrutura experimental versátil e robusta para pesquisas futuras.
Métodos Utilizados
- Utilização de um olfatômetro de quatro quadrantes para ensaios comportamentais.
- Software automatizado de rastreamento de moscas para coleta de dados.
- Preparação de câmaras de odorantes com configurações específicas para testes.
- Inclusão de controles de solvente juntamente com odorantes de teste para comparação.
Resultados Principais
- A montagem permite a avaliação de respostas olfativas em grandes populações de moscas.
- É demonstrada a versatilidade nos testes com diversos estímulos olfativos.
- A coleta robusta de dados por meio de rastreamento automatizado aumenta a confiabilidade experimental.
- Potencial para aplicações optogenéticas no controle da atividade neuronal durante os ensaios.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem abrangente para o estudo do comportamento olfativo em Drosophila.
- Abre caminhos para explorar a base neural do processamento olfativo.
- O aparato pode ser adaptado para diversas necessidades experimentais na pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio permite a avaliação quantitativa e de alto rendimento de comportamentos mediados pelo olfato em Drosophila, apoiando a validação de alvos em neurofarmacologia e neurociência sensorial. Ao fornecer leituras comportamentais reprodutíveis associadas à função de circuitos neurais, facilita a redução de riscos mecanicistas de hipóteses terapêuticas envolvendo processamento olfativo ou vias quimiossensoriais. A adaptabilidade do sistema a múltiplos estímulos e modelos genéticos aumenta sua utilidade em fluxos de trabalho de descoberta inicial para identificação de compostos líderes e confiança preditiva no engajamento de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de circuitos neurais olfativos para validar alvos envolvidos em vias de detecção sensorial e resposta comportamental.
- Valor Operacional: Apoia a triagem comportamental em nível populacional com rastreamento automatizado, reduzindo a variabilidade e aumentando a produtividade para a mitigação de riscos dos alvos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera índices quantitativos de atração/repulsão que servem como leituras fenotípicas para campanhas de triagem de compostos ou genéticas.
- Valor Operacional: O controle padronizado do fluxo de ar e o design da arena garantem a reprodutibilidade entre as execuções, permitindo uma validação confiável do ensaio para aplicações posteriores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a continuidade da manipulação gênica ou do alvo até a saída comportamental mensurável, apoiando o alinhamento de biomarcadores translacionais em fenótipos sensoriais.
- Valor Operacional: Compatível com modelos genéticos (por exemplo, linhagens transgênicas), permitindo a avaliação dos efeitos da redução ou superexpressão do alvo no comportamento orientado pelo olfato.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao vincular perturbações genéticas ou farmacológicas a resultados comportamentais quantificáveis, apoiando a progressão da identificação de alvos à validação fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre a função de circuitos olfativos mediante a medição de respostas comportamentais em tempo real a estímulos controlados.
- Triagem: Oferece condições padronizadas e prontas para ensaio para avaliar grandes coortes de moscas sob desafios olfativos definidos.
- Análise: Fornece dados comportamentais espaciais e cálculos de índice de atração que permitem comparação quantitativa entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a manipulação neural a comportamentos observáveis, reforçando a validade pré-clínica de alvos em vias de processamento sensorial.
- Reutilização Empresarial: O design modular do olfatômetro permite reutilização em múltiplos projetos, estímulos e genótipos, promovendo eficiência em nível de plataforma.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva nas relações entre alvo e comportamento ao reduzir ruídos por meio de rastreamento automatizado e filtragem comportamental.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de validação rigorosa do fluxo de ar, protocolos de limpeza da arena e verificações de experimentos controle.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar na validação de alvos ao fornecer fenótipos comportamentais claros e quantificáveis.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em dados de desvio de risco comportamental provenientes de ensaios olfativos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, no delineamento de ensaios comportamentais e na análise básica de dados em MATLAB ou equivalente.
- Depende de equipamentos para regulação de fluxo de ar, sistemas de entrega de odorizantes e hardware de rastreamento de vídeo com controles ambientais.
- Necessita padronização dos protocolos de inanição, limpeza da arena e experimentos controle para eliminar vieses posicionais ou de contaminação.
- Deve levar em conta as taxas de sobrevivência específicas ao genótipo durante a inanição e ajustar os protocolos conforme necessário para manter a viabilidade do grupo.
- É limitado pela necessidade de lavagem frequente do sistema e pelo potencial de contaminação cruzada com odorizantes de alta concentração, exigindo tempo prolongado de inatividade entre as execuções.
