Name: Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de Drosophila Em um olfatômetro de quatro quadrantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Aprenda a ensaiar comportamentos olfativos em Drosophila melanogaster usando um olfatômetro de quatro quadrantes com rastreamento automatizado. Este método versátil permite testar respostas a estímulos olfativos em grandes populações de moscas.

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Agradecemos a Terry Shelley por fabricar a arena de moscas e o recinto à prova de luz, Liz Marr pela ajuda na manutenção do estoque de moscas e Xiaojing Gao e Junjie Luo pela ajuda com o código Matlab usado para análise de dados. Agradecemos a Johan Lundström, do Monell Chemical Senses Center, por demonstrar sua configuração de entrega de odor. Este trabalho foi apoiado por doações da Whitehall Foundation (CJP) e NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

1. Setup Assembléia <ol><li> Fabricação na arena em forma de estrela (19,5 cm por 19,5 cm por 0,7 cm) de politetrafluoretileno (PTFE), de acordo com o desenho (Materiais Suplementares, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) fornecidos. A arena podem ser fabricados por uma instalação de um costume ou comercial. </li><li> Adquirir duas placas de vidro (20,25 cm por 20,25 cm de altura com a espessura de 2 mm), e um furo (~ 0,7 cm de diâmetro) precisamente no centro de uma das placas de vidro, utilizando uma broca diamantada. </li><li> Fabricar uma caixa de comportamento à prova de luz para a arena comportamental. fabricar também uma caixa de câmera à prova de luz para a câmera de vídeo CCD infra-vermelho de acordo com os desenhos fornecidos (Materiais Suplementares, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). As caixas podem ser fabricados por um uma instalação personalizada comercial ou. </li><li> Montar o aparelho de ar condicionado na parede posterior e as matrizes de LED nas paredes laterais da caixa de comportamento. Coloque a sonda de temperaturana caixa de comportamento através de um orifício lateral para feedback de temperatura em tempo real e ajuste (ver Figuras 1 e 2 para detalhes). </li><li> Anexar o filtro IR e polarizador circular para a câmera, e montar o conjunto na caixa de câmera. A caixa de comportamento e caixa de câmera são separados por uma janela de vidro para melhor controle de temperatura da caixa de comportamento (ver Figuras 1 e 2 para detalhes). </li><li> Ligue a câmera CCD infravermelho a um adaptador de câmera. Ligue o adaptador de câmera para um conversor USB. Ligue o conversor USB a uma porta USB do computador para aquisição de dados. </li><li> Instalar o driver para o conversor de vídeo no computador de acordo com as instruções do fabricante. Opcionalmente, instale o software de processamento de imagem fornecida pelo fabricante do conversor de vídeo USB para acessar uma ampla gama de configurações de câmera e parâmetros de aquisição. </li><li> Ligue o aparelho de ar condicionado (por meio de &quot;output&quot;Na parte de trás do controlador de temperatura) e a sonda de temperatura (por meio de&quot; termopar &quot;na parte de trás do controlador de temperatura) para o controlador de temperatura. Colocar o sensor dentro da caixa de comportamento. Nota: O sistema de controle da temperatura no nosso esquema é capaz de manter a temperatura da caixa de entre 18 ° C e 30 ° C. Temperaturas ambientes mais elevadas ou mais baixas podem ser úteis para termogênico (ts dTrpA1, TRPM8 ou shibire) experimentos para manipular a actividade neuronal ou inibir a transmissão sináptica. Para a maioria das experiências, a temperatura é mantida a 25 ° C. </li><li> Monte o sistema de entrega de odor nas etapas seguintes (ver Figura 1B para esquemas detalhados e acessórios de conexão): <ol><li> Usar o regulador de pressão de ar para controlar a entrada de ar do sistema de ar condicionado central. Conectar um filtro de ar de carbono (cheio com carvão vegetal) para o regulador de pressão para purificar o ar a partir do centro de umsistema de IV. </li><li> Monte o sistema de controle de fluxo que consiste em múltiplos canais regulados por tubos do medidor de vazão de alta resolução. </li><li> Ligue a saída do filtro de ar de carbono para os tubos do caudalímetro através de um colector tal como mostrado na Figura 1B e 2F. Direcionar a saída dos tubos do medidor de vazão por meio de válvulas solenóide de 3 vias controlados eletronicamente para regular se o ar limpo deixando os medidores de vazão é expelido para a sala ou entrou em câmaras de odor feitas sob medida 24. </li><li> Instalar o controlador da válvula de solenóide de acordo com o manual do fabricante. </li></ol></li><li> Instalar o medidor de fluxo de ar electrónico, ligando-o a um dispositivo de aquisição de dados (DAQ) e uma fonte de alimentação de acordo com o manual do fabricante. Instalar o software de interface DAQ para verificar débitos iguais em cada quadrante da arena antes de cada experimento. </li></ol> 2. Olfativo Estímulos Preparação <ol><li> Prepare 5 odorcâmaras de formigas 24 que consistem em um recipiente de plástico exterior, vidro de embalagem interior, uma PTFE inserção tampa feito por encomenda, tampa do recipiente original com parte central removida e duas válvulas unidirecionais. Nota: Um anel em torno da tampa de PTFE pode ser usado para evitar fuga de ar da câmara de odores durante a perfusão de odor. Veja a Figura 1 para esquemática e a Figura 2 para fotos das câmaras. </li><li> Use quatro câmaras olfativos para controlos do solvente, e uma câmara para um odorante teste. Encher os recipientes de vidro com 1000 uL de diluição solvente ou odorante (odorantes de teste + solventes apropriados, misturar bem antes de experiências), colocar o recipiente de vidro no interior da câmara de plástico correspondente (não derramar o líquido para dentro da câmara de plástico) e aperte a tampa . Certifique-se de usar sempre uma câmara limpa para o odorante de teste e controlos do solvente. Nota: atração olfativo pode ser desencadeada por 1/16 de diluição de vinagre de maçã (5% de acidez) em water. Em contraste, o comportamento de repulsão olfactiva pode ser estudada utilizando uma diluição de 10% de propionato de etilo em óleo mineral. estímulos de controle nestes casos são câmaras de odor com óleo mineral puro. </li></ol> 3. Preparação Fly <ol><li> Traseira voa em meio fubá padrão. Coloque 30 do sexo masculino e 30 moscas parentais feminina em uma garrafa padrão, e deixá-los põem ovos durante 5 dias a 25 ° C ou à temperatura ambiente. </li><li> Para cada experiência, recolher recém eclosed (&lt;1 dia de idade) 25 do sexo masculino e 25 do sexo feminino voa sob breves CO 2 anestesia. </li><li> Manter moscas num frasco com meio de mosca padrão durante 2-4 dias. </li><li> 40-42 h antes da experiência, transferir as moscas sem CO 2 anestesia &#160; para um frasco com ~ 10 ml de gel de agarose 1%. Isto irá manter as moscas umidificadas sem alimentos, o que ajuda a aumentar a sua actividade locomotora. Nota: Mais de 90% das moscas deve sobreviver à inanição. Alguns genótipos são menos curartua e não pode fazê-lo através de uma fome de 40 horas. Nesses casos, períodos mais curtos, tais como 24-28 horas são aceitáveis, mas deve ser mantido o mesmo para todas as condições experimentais e repete. </li></ol> 4. Respostas comportamentais aos atrativos e repelente de Fragrâncias <ol><li> Ligue o controlador de temperatura e configurá-lo para 25 ° C. </li><li> Ligar as câmaras olfactivos (Fragrância de controlo e de teste) por inserção do tubo para a saída da câmara de odorante e ao premir-para-ligar montagem na caixa do comportamento. </li><li> Verifique a taxa de fluxo em cada quadrante usando o medidor de fluxo de ar para se certificar de que a corrente de ar e controle de odores é igual a 100 ml / min. </li><li> Limpar a arena PTFE mosca e as placas de vidro com etanol 70% 2-3 vezes e permitir-lhes totalmente ar seco (~ 3-4 min). </li><li> Cole as placas de vidro para com grampos na arena. </li><li> Transferência voa sem CO 2 em anestesia através do orifício de uma das placas de vidro na arena. à réer a transferência, colocar uma malha circular no furo para impedir que as moscas de escapar. Nota: CO 2 anestesia foi mostrada para afectar o comportamento de Drosophila 25 e não deve ser usada dentro de 24 horas de uma experiência de comportamento. </li><li> Coloque com moscas dentro da câmara à prova de luz da arena, conecte as correntes de ar quatro de controle, ligando o tubo ligado ao push-to acessório de conexão na caixa de comportamento para os cantos de arena, feche a porta da câmara e espere 10- 15 min para permitir que as moscas se aclimatar ao novo ambiente. Se possível, desligue as luzes na sala onde os experimentos são realizados, para evitar possível vazamento mínima luz que pode influenciar o resultado experimental. </li><li> Executar um experimento de controle 5-10 min, em que as moscas são expostos a correntes de ar 4 controle. </li><li> Analisar os dados imediatamente (ver secção A análise dos dados abaixo) para se certificar de que as moscas são distribuídos uniformemente na arena, e Índice da atração está pertoa 0. Este passo é essencial, uma vez que verifica se não existem fontes não controladas de preferências e aversões dentro da arena (por exemplo, luz vazamento do exterior, distribuição de temperatura desigual, arena irregular, contaminação odor, etc.). Se as moscas são distribuídos de forma desigual ou a sua actividade locomotora é baixo, descartar as moscas, limpar a arena de novo (passo 4.4) e utilizar um novo lote de moscas para repetir a experiência. </li><li> Ligue a câmara de teste odorante à configuração ligando as 3-way válvulas ou re-conectar os tubos conectores. </li><li> Execute experimento de teste para 5-10 min e analisar os dados como discutido na seção 5 abaixo (veja também a referência 14 e Figura 3). Gravações mais longos do que 20 minutos pode resultar em arquivos de dados que podem ser difíceis de processo computacionalmente. Se gravações mais experimentais são desejados, parar rapidamente e re-iniciar o programa de rastreamento. Isso resulta em um ~ 10 seg lacuna entre as gravações experimentais. </li><li> discarmoscas d. </li><li> Limpos arena e vidro placas com 70% de etanol (passo 4.4), e substituir os tubos conectores dentro do compartimento à prova de luz. Para agilizar experimentos, uma nova arena limpo pode ser usado, ea arena sujo limpo durante a realização de ensaios experimentais. </li><li> Executar outra experiência com um novo lote de moscas, se necessário. Se vários experimentos são executados no mesmo dia, tomar extremo cuidado para garantir que nenhum odorante é deixado no sistema a partir de um teste anterior. Isto não é normalmente um problema com baixas concentrações de odorantes ou com CO 2, mas pode ser necessário para estímulos altamente concentradas até um intervalo de 24 horas entre as execuções experimentais. Além disso, todos os tubos depois de os tubos de escoamento pode ser substituído se a contaminação odorante é suspeito durante as experiências de controlo. Sempre deixar o ar seco em entre as experiências para lavar continuamente o sistema </li></ol> Análise 5. Os dados Nota: A mosca sugeriu softwar aquisição de rastreamentoe (detalhado em Materiais), as faixas moscas em tempo real durante a aquisição, e salva o carimbo de tempo e coordenadas de todas as moscas detectados em formato * .dat. Nós desenvolvemos uma Matlab rotina feitos por medida para converter os dados para um formato Matlab, e para analisar os dados. exemplos de código são fornecidos em Materiais suplementares, mas os detalhes da implementação dependerá do software utilizado para a aquisição de dados. <ol><li> Carregar os dados brutos. Criar uma máscara espacial que segue os contornos da arena e aplicar a máscara para os dados em bruto para remover todos os pontos de dados que caem fora da arena uma vez que representam ruído (Figura 4A, Recurso Código MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m). </li><li> Remove todos os pontos de dados que se movem a uma velocidade inferior a 0,163 cm / s durante mais de 3s, como estes dados é provável que seja o ruído gerado por moscas ou não em movimento (Figura 4B, Recurso Código TemporalFiltering.m). </li><li> Visualize dados restantespontos de plotagem-los todos de uma vez ou como trajetórias individuais (Figura 3, Código Complementar SingleTrajectoryViewer.m). Nota: A localização das fronteiras odor nos quatro campos provavelmente depende de um número de fatores, como as características de cada odorante e as taxas de fluxo de ar que está sendo usado. Por exemplo, odorants altamente voláteis provavelmente vai encher o quadrante odor mais completa do que odorants menos voláteis. Assim, é provável que cada odorante podem apresentar ligeiramente diferentes limites de odor. A utilização de um detector de fotoionização para medir limites de odores pode ser problemático, uma vez que utiliza uma amostra de ar de vácuo a partir de um determinado ponto, e assim interrompe a concentração odorante naquele ponto. No entanto, os limites de odores pode ser rapidamente calculada com base em dados do comportamento da mosca. Por exemplo, um limite de odor à base de pistas mosca acumulados em resposta a diferentes odores pode ser claramente observado nas Figuras 3C e 3D. </li><li> Calcular um índice atracção para determinar se experiências de controlo gerar nenhuma resposta preferência, e também para aceder a resposta a um odorante (ou optogenetic 9) estímulo. Para calcular uma atração Index (AI), use o último 5 min de um controle ou gravação de teste. Para se obter uma medida de atracção que se situa entre 1 (atracção absoluta) e -1 (repulsão absoluta), a seguinte fórmula é utilizada para calcular o AI: <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54346/54346eq1.jpg" /> onde o teste N é o número de pontos de dados no quadrante de teste, controlo N é o número médio de pontos de dados nas três quadrantes de controlo. Esta medida é intuitivo como nenhuma preferência seria indicado por valores próximos de zero. No entanto, ele não indica correctamente a proporção do número total de moscas que se encontram no quadrante odorante. Para obter esta medida, um Índice Percentagem (IP) podem ser utilizados: <img alt="equação 2" src=&quot;/files/ftp_upload/54346/54346eq2.jpg&quot; /&gt; onde o teste N é o número de pontos de dados no quadrante de teste, e N total é o número total de pontos de dados em todos os quatro quadrantes. Esta fórmula prevê uma medida que cai entre 0 e 1, com 0,25 correspondente a nenhuma preferência comportamental (Figura 3E e 4C, Recurso Código AttractionIndex.m). </li><li> Executar 5-10 repetições de cada condição experimental, usando um novo grupo de moscas para cada repetição. Comparar os índices de atração entre as condições ou contra controlos utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov não paramétrico (Figura 3F, função kstest2 em Matlab). </li></ol>

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<li>Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+discrimination+in+Drosophila%3A+from+neural+population+codes+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior.</a> Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O olfactómetro de quatro campos descrito aqui é um sistema comportamental versátil para estudar as respostas olfativas de populações grandes de tipo selvagem e mutante de Drosophila moscas. Cada experiência leva ~ 1 hr (incluindo instalação, ensaios experimentais, e limpeza) e 4-6 experimentos podem ser realizados rotineiramente a cada dia. Um ensaio típico usando 40-50 moscas durante 5 minutos gera aproximadamente 450.000 rastreados pontos de dados para análise. A configuração descrita, também podem ser utiliz...

A capacidade de adaptação e respondem ao ambiente externo é crítica para a sobrevivência de todos os animais. Um animal precisa para evitar perigos, procurar comida e encontrar companheiros, e aprender com experiências anteriores. sistemas sensoriais funcionar para receber uma variedade de estímulos visuais, tais como, química e mecanosensorial, e envia esses sinais para o sistema nervoso central a ser interpretada e descodificado. O cérebro, em seguida, direciona comportamentos motores apropriadas com base no ambiente percebido, como a busca de alimento ou escapar de um predador. Entender como sistemas sensoriais detectar o mundo externo, e como o cérebro decodifica e dirige decisões, é um grande desafio em neurobiologia. Drosophila melanogaster é um sistema poderoso modelo para investigar como neural comportamentos circuitos de guia. Além de ser simples e barata de manter, Drosophila apresentam muitos comportamentos diversos e complexos estereotipada, mas fazê-lo com uma compact sistema nervoso de cerca de 100.000 neurônios. Existem técnicas genéticas poderosas para manipular o genoma de Drosophila, e milhares de linhas transgénicas foram geradas que seletivamente e reprodutível rotular os mesmos subconjuntos de neurônios 10-13. Estas linhas transgénicas podem ser usadas para manipular selectivamente a actividade dos neurónios marcados (activar ou inibir), e estas manipulações podem ser utilizados para investigar como neural comportamentos funções de guia. Vários ensaios comportamentais têm sido desenvolvidos para estudar vários comportamentos de Drosophila. Drosophila, como muitos animais, use seu sentido de cheiro para guiar muitas escolhas comportamentais, tais como encontrar comida, encontrar companheiros e evitar perigos. Olfato é, portanto, um bom sistema sensorial para investigar como os estímulos externos são detectados e interpretados pelo sistema nervoso de um animal para orientar as escolhas apropriadas. Como tal, uma série de ensaios foram desenvolvidos para Investigating larval e comportamentos olfativos adultos. Tradicionalmente, os comportamentos olfactivos em Drosophila foram ensaiadas por um paradigma de labirinto em T de dois escolha, que pode ser utilizado para ensaiar inata e comportamentos aprendidos olfactivos 3. Neste ensaio, cerca de 50 moscas são dado uma escolha entre dois tubos: um tubo contém o odor em questão e o outro contém um odorante de controlo (normalmente o solvente odor). As moscas são dadas um determinado período de tempo para fazer uma escolha, e, em seguida, o número de moscas que estão nas diferentes câmaras são contados. Embora o labirinto em T é um ensaio simples para muitas experiências, há várias limitações. Por exemplo, comportamentos olfativos são medidos em apenas um ponto no tempo, e diferentes escolhas feitas antes deste ponto de tempo são descartados. Da mesma forma, os comportamentos individuais das moscas dentro da população são negligenciadas. Além disso, o labirinto em T requer a contagem manual das moscas, que pode introduzir erros. Finalmente, uma vez que existem apenas duas opções de medição, estereduz o poder estatístico muitas vezes necessária para detectar mudanças comportamentais sutis. Uma alternativa para um dois-escolha T-maze é um de quatro quadrantes (quatro campos) olfatômetro 14-18. Neste ensaio, os animais explorar uma arena em que cada um dos quatro cantos da arena é preenchido com uma fonte potencial de ar odorizado. A arena tem uma forma de estrela enrugada para maximizar a formação de quatro quadrantes de odor experimentalmente definidos. Se o odor é fornecido em um dos cantos em seguida, é contida apenas em que um quadrante. Os comportamentos dos animais pode ser rastreado como eles entram e saem do quadrante odor, e facilmente em comparação com o seu comportamento nos três quadrantes de controle. Assim, o ensaio olfatômetro de quatro quadrantes registros de resposta comportamental espacial e temporal aos estímulos odor mais de uma grande arena experimental. O olfatômetro de quatro quadrantes foi desenvolvido pela primeira vez por Pettersson et al. 15 e Vet et al. 17 para investigar o olrespostas comportamentais fábrica de Hymenoptera parasítica indivíduo. Faucher et al. 18 e Semmelhack e Wang 16 adaptada a configuração para monitorar as respostas olfativas de Drosophila individual. O olfactómetro de quatro quadrantes é igualmente sensível às respostas atractivas e repulsivas, permitindo uma vasta gama de condições de ensaio e odorantes. Software de rastreamento fly escrita por encomenda, desenvolvido por Alex Katsov 19 e atualmente mantido por Julian Brown (detalhado em Materiais), apresentou vantagens adicionais para implementações mais recentes do olfatômetro de quatro quadrantes 14,20-23. É agora possível testar até 100 moscas simultaneamente em alta resolução espacial (27,5 pixels / cm) e temporais (30 quadros por segundo) de resolução, que permite extrair vários parâmetros, tais como posição, velocidade e aceleração de moscas em qualquer ponto do tempo. Isso permite que as investigações sobre a dinâmica das respostas comportamentais das moscas aos odores 20 </s-se&gt;. Deve notar-se, no entanto, que a identidade de moscas individuais dentro da população durante todo o período de seguimento não é mantido. Em vez disso, cada faixa mosca é registrado por até duas faixas mosca não se cruzam. Em que ponto, novas faixas são atribuídos após as moscas divergem. Ao incorporar outro software de captura de vídeo (detalhado na Tabela de Materiais), a mesma configuração permite períodos de monitoramento flexível e pode ser usado para controlar moscas por até 24 horas, tomando imagens a uma taxa de quadros mais baixa. Esta opção foi utilizada para estudar os comportamentos que põem ovos de moscas e comparar suas posições corporais com as preferências oviposição 14. O olfactómetro de quatro campos podem também ser utilizados para estudar as respostas para multimodal (por exemplo, olfativas e visuais) estímulos, ou para combinar optogenetic 9 ou 21 termogênico estimulação com apresentações de estímulos sensoriais. Além disso, a resolução temporal alta permite que a extracção de trajectórias for cada mosca individual no conjunto de dados ensemble. Portanto, o método permite investigação sobre comportamentos da população olfativos-guiada e também interações sociais individuais. Os dados gerados por este ensaio são robustos e altamente reprodutível, que permite a utilização do olfactómetro de quatro campos para telas comportamentais. Descrevemos aqui o conjunto de instalação para um olfatômetro de quatro quadrantes. Demonstramos ainda mais a sua utilização no ensaio de atração olfativa em resposta ao vinagre de maçã e repulsão em resposta ao propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, descreve-se e proporcionar o Exemplo de código para a análise dos dados de controlo de mosca gravados.

<table><tbody><tr><td><forte>Sistema de entrega de ar&nbsp; </td><td></td><td></td><td>(Quantidade necessária)</td></tr><tr><td>Tubulação e conectores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coletores Termoplásticos NPT(F)</td><td>Cole-Parmer, IL, EUA</td><td>R-31522-31</td><td>1</td></tr><tr><td>Bico redutor hexagonal (1/4MNPT->1/8MNPT)</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5232T314</td><td>1</td></tr><tr><td>Tubulação ( ID: 1/8)</td> <td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5108K43</td><td>Tubulação de 50 pés</td></tr><tr><td>(ID: 1/16)</td> <td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>52355K41</td> Conexões de tubo farpado <td>de 100 pés</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5117K71</td><td>1 pacote</td></tr><tr><td>de conexões de tubo push-to-connect</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5779K102</td><td>4</td></tr><tr><td>conexões de tubo farpado (1 / 4MNPT->1 / 8BF)</td> <td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5463K439</td><td>1 pacote (10)</td></tr><tr><td>Conexões de Tubo Farpado (1/8MNPT->1/8BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5463K438</td><td>2 pacotes (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Conexões de Tubo Farpado (1/8MNPT->1/16BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>5463K4</td><td>2 pack (10)&nbsp;</td></tr><tr><td>Conexões de Tubo Farpado (1/4MNPT->1/4BF)</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>&nbsp; 5670K84</td><td>1</td></tr><tr><td>Plug de cabeça hexagonal</td><td>McMaster-Carr, IL, USA</td><td>48335K152</td><td>1</td></tr><tr><td>Regulador de pressão de ar, filtro de ar e medidores de vazão</td><td></td><td></td><td>(Quantidade necessária)</td></tr><tr><td>Unidade de secagem de gás labatorial</td><td>W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, EUA</td><td>Modelo: L68-NP-303; estoque #26840</td><td>1</td></tr><tr><td>Quadros multitubos para tubos de fluxo de 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, EUA</td><td>R03215-30</td><td>1</td></tr><tr><td>Quadros multitubos para tubos de fluxo de 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, EUA</td><td>R03215-76</td><td>1</td></tr><tr><td>tubos de fluxo de 150 mm</td><td>Cole-Parmer, IL, EUA</td><td>R-03217-15</td><td>9</td></tr><tr><td>Cartucho de válvula</td><td>Cole-Parmer, IL, EUA</td><td>R-03218-72</td><td>9</td></tr><tr><td>Regulador de ar de precisão</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>6162K13</td><td>1</td></tr><tr><td>Válvulas solenoidais</td><td>Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>02-10i</td><td>4</td></tr><tr><td>Controlador de válvula solenóide</td><td>ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA</td><td>01-18</td><td>1</td></tr><tr><td>Medidor de vazão eletrônico</td><td>Honeywell</td><td>AWM3100V</td><td>1</td></tr><tr><td>DAQ (NI USB-6009, National Instruments) e a&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6009</td><td>1</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>Extech Instruments</td><td>382200</td><td>1</td></tr><tr><td>Câmaras de</td><td></td><td></td><td></td>odor</tr><tr><td>Polipropileno Boca larga Jar 2 oz; 60 ml</td><td>Nalgene</td><td>562118-0002</td><td>São necessários pelo menos 5 por experimento, mas uma câmara separada é necessária para cada diluição de cada odorante. Disponível na Container Store, parte #635114)</td></tr><tr><td>Câmara de odor de vidro, 0.25 oz</td><td>Garrafa Sunburst</td><td>LB4B</td><td>Pelo menos 5 são necessários por experimento&nbsp;</td></tr><tr><td>Válvula "In" para câmara de odor</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>214224PB-0011S000-4074</td><td>1 dessas peças é usada por câmara de odor, mas elas precisam ser substituídas com frequência</td></tr> <tr><td>Válvula de "saída" para câmara de odor</td><td>Smart Products, Inc., CA, USA</td><td>224214PB-0011S000-4074</td><td>1 dessas peças é usada por câmara de odor, mas elas precisam ser substituídas frequentemente</td></tr><tr><td>Anel O</td><td>RT Dygert International, MN, EUA</td><td>AS568-029 Buna-N O-R</td><td>1 pacote (100)</td></tr><tr><td>Fly arena, câmera e caixas de comportamento</td><td></td><td></td><td>(Quantidade necessária)</td></tr><tr><td>Comportamento e material da caixa da câmera</td><td>Plásticos Interstate, CA, EUA</td><td>ABS extrudado preto (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)</td><td>1803 polegadas</td></tr> <tr><td>quadradasTeflon para arena de mosca e inserções de câmara de odor, 3/8" de espessura, 12" x 12"</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>8545K27&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Placas de vidro, 1/8" de espessura, 9" x 9"</td><td>McMaster-Carr, IL, EUA</td><td>8476K191&nbsp;</td><td>algarismo</td></tr><tr><td>Controlador termoelétrico de ação dupla</td><td>WAtronix Inc, CA, USA</td><td>DA12V-K-0</td><td>1</td></tr><tr><td>matriz de LED IR</td><td>Advanced Illumination, Rochester, VT, USA</td><td>AL4554-88024, PS24-TL</td><td>2 matrizes de LED e uma fonte de alimentação</td></tr><tr><td>Unidade de ar condicionado</td><td>Melcor Store</td><td>&nbsp; MAA280T-12</td><td>1</td></tr><tr><td>Sistema de imagem</td><td></td><td></td><td>(Quantidade necessária)</td></tr><tr><td>Cosmicar/Pentax C21211TH (12,5 mm F/1.4) Lente C-mount</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA</td> PEC21211 <td>KP</td><td>1</td></tr><tr><td>CCXC-12P05N Cabo de interconexão</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA</td><td>SOCCXC12P05N</td><td>1</td></tr><tr><td>Adaptador de câmera DC-700</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA</td><td></td> SODC700 <td>1</td></tr><tr><td>P+B 40,5 093 Filtro IR</td><td>B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, EUA</td><td>65-072442</td><td>1</td></tr><tr><td>TiFFEN 40,5 mm Polarizador circular</td><td>Amazon</td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>Câmera de vídeo IR</td><td>Industrial Vision Source, FL, EUA</td><td>Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)</td><td>1</td></tr><tr><td>Conversor de vídeo USB</td><td>The Imagingsource, NC, EUA</td><td>DFG/USB2-It</td><td>1</td></tr><tr><td>iFlySpy2 (software de rastreamento de moscas)</td><td>Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com</td><td>iFlySpy2</td><td>1</td></tr><tr><td>IC Capture 2.2 software</td><td>The Imagingsource, NC, EUA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diversos</td><td></td><td></td><td>(Quantidade necessária)</td></tr><tr><td>Ferramenta rotativa Dremel</td><td>Dremel, Racine, WI, USA</td><td>Dremel 8000-03&nbsp;</td><td>1</td></tr><tr><td>Brocas revestidas de diamante para corte de vidro</td><td>Disponível em vários fornecedores; MSC Industrial Supply Co, Melville, NY</td><td>90606328</td><td>1</td></tr></tbody></table>

comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; drosophila</em&gt; em um olfatômetro de quatro quadrantes

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

Um dos principais desafios em neurobiologia é entender como os circuitos neurais funcionam para orientar comportamentos adequados com animais. Drosophila melanogaster é um excelente sistema modelo para tais investigações devido aos seus comportamentos complexos, técnicas genéticas poderosas e sistema nervoso compacto. Ensaios comportamentais laboratoriais têm sido muito utilizados com Drosophila para simular propriedades do ambiente natural e estudar os mecanismos neurais subjacentes aos comportamentos correspondentes (por exemplo fototaxia, quimiotaxia, a aprendizagem sensorial e memória) 1-3. Com a recente disponibilidade de grandes coleções de linhas de Drosophila transgênicas que rotulam subconjuntos neurais específicos, ensaios comportamentais têm assumido um papel de destaque para conectar neurônios com comportamentos 4-11. paradigmas versáteis e reprodutíveis, em conjunto com as rotinas computacionais subjacentes para análise de dados, são indispensáveis ​​para testes rápidos de linhas de voar candidatos com vários genotypes. Particularmente úteis são as configurações que são flexíveis no número de animais testados, a duração das experiências e a natureza dos estímulos apresentados. O ensaio de escolha também deve gerar dados reprodutível, que é fácil de obter e analisar. Aqui, apresentamos uma descrição detalhada de um sistema e protocolo para ensaiar respostas comportamentais de Drosophila voa em uma grande arena de quatro campos. A configuração é usado aqui para ensaiar respostas de moscas para um único estímulo olfativo; No entanto, o mesmo arranjo pode ser modificado para testar múltiplos olfactivo, estímulos visuais ou optogenetic, ou uma combinação destes. A configuração olfatômetro registra a atividade de populações de moscas que respondem aos odores e métodos analíticos computacionais são aplicadas para quantificar os comportamentos da mosca. Os dados coletados são analisados ​​para obter uma rápida leitura fora de uma corrida experimental, que é essencial para a coleta de dados eficiente e a otimização das condições experimentais.

Os olfatômetro registros e ensaio quatro quadrantes analisa as atividades de passeio de muitas moscas sobre um grande espaço comportamental. Odorantes pode ser introduzido nas correntes de ar que entra com uma, duas, três, ou todos os quatro quadrantes. Na ausência de odores, as moscas irá mover-se livremente entre todos os quatro quadrantes. Este comportamento é crucial para observar uma vez que indica que polarizações un-intencional não têm sido introduzidos no ensaio. Estes desvios po...

Descrevemos aqui uma configuração comportamental e método de análise de dados para testar as respostas olfativas de até 100 moscas do vinagre (Drosophila melanogaster). Este sistema pode ser usado com estímulos olfativos únicos ou múltiplos e adaptável para ativação optogenética ou silenciamento de subconjuntos neuronais.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de<em&gt; Drosophila</em&gt; Em um olfatômetro de quatro quadrantes

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

O objetivo geral deste experimento é analisar os comportamentos olfativos de moscas em um olfatômetro de quatro quadrantes utilizando um script fornecido de software automatizado para rastreamento de moscas. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais sobre como os sistemas neurais olfativos detectam o mundo externo e como o cérebro decodifica e orienta decisões comportamentais. A principal vantagem desta técnica é sua versatilidade e robustez, permitindo testes repetidos de respostas olfativas por populações de moscas em uma arena experimental ampla.Para este protocolo, prepare cinco câmaras de odorizante que consistem em um recipiente externo de plástico, um recipiente interno de vidro e um inserto de tampa de PTFE feito sob medida. O inserto é uma tampa original do recipiente com a parte central removida e duas válvulas unidirecionais acopladas. Utilize quatro das câmaras de odorizante como controles de solvente e uma câmara para um odorizante de teste.Certifique-se de que cada câmara esteja limpa e, em seguida, carregue um recipiente de odorizante com um mililitro de solvente ou diluição de odorizante. Depois, verifique a posição do recipiente na câmara de plástico e certifique-se de que nenhum líquido tenha sido derramado. Fixe a tampa usando o parafuso e uma junta de vedação no inserto de PTFE para evitar vazamentos.Crie as moscas em meio padrão de farinha de milho. Em um frasco padrão, coloque 30 machos e 30 fêmeas e permita que os ovos sejam postos por cinco dias à temperatura ambiente. A partir desses frascos, colete moscas recém-emergidas.Para cada coorte experimental, colete 25 moscas macho e 25 fêmeas sob breve anestesia com dióxido de carbono e deixe o coorte envelhecer em meio padrão para moscas por dois a quatro dias. Entre 40 e 42 horas antes do experimento, transfira o coorte para um frasco com cerca de 10 mililitros de gel de agarose a um por cento para umidade, sem alimento. A inanição ajuda a aumentar o movimento geral, e mais de 90% das moscas devem sobreviver ao processo de inanição.Se mais de 10% morrerem, o que pode ocorrer em um genótipo fraco, tente usar um período de jejum de um dia para todas as moscas do experimento. Pelo menos cinco minutos antes, ligue o controlador de temperatura e ajuste-o para 25 graus Celsius. Em seguida, conecte as câmaras de odorizante à arena por meio de um tubo plástico.Verifique a taxa de fluxo de ar em cada quadrante da arena usando um medidor eletrônico de fluxo. Certifique-se de que os fluxos de ar controle e com odorizante estejam ambos funcionando a 100 mililitros por minuto. As moscas são muito sensíveis ao fluxo de ar, e é essencial verificar o fluxo de ar de cada quadrante antes de cada experimento.Agora, limpe a arena e as placas de vidro utilizando etanol 70%. Passe em todas as partes duas a três vezes e deixe secar completamente ao ar antes de prosseguir. Em seguida, prenda as placas de vidro à arena.Em seguida, transfira as moscas para a arena sem anestesia. Usando a gravidade, permita que entrem através do orifício em uma das placas de vidro e, então, cubra o orifício com uma malha circular. Agora, coloque a arena com as moscas na câmara opaca à luz.Em seguida, conecte os quatro fluxos de ar controle a cada canto da arena. Feche a porta da câmara e deixe as moscas aclimatarem-se ao novo ambiente por 10 a 15 minutos. Após o período de aclimatação, realize um experimento controle de cinco a 10 minutos no qual as moscas são expostas a quatro fluxos de ar controle.É essencial analisar imediatamente os dados. Se as moscas não estiverem distribuídas uniformemente na arena, esta deve ser redefinida. É fundamental testar o comportamento de moscas controle apenas com ar limpo.Isso verificará rapidamente se todas as condições de fundo estão normais. Vazamento de luz, desequilíbrio de temperatura, arena inclinada ou contaminação por odores podem causar problemas. Se necessário, descarte as moscas e limpe a arena novamente.Se for suspeita uma contaminação por odorizante, substitua todas as tubulações. Continue repetindo o teste controle com novos grupos até que os animais não apresentem preferência por nenhum dos quatro quadrantes. Em seguida, conecte a câmara do odorizante de teste ao equipamento usando uma válvula de três vias, ou reconecte as tubulações e realize um experimento-teste por cinco a 10 minutos.Para gravações experimentais mais longas, interrompa e reinicie rapidamente o programa de rastreamento a cada 20 minutos, ou os arquivos de dados serão muito grandes. Entre os testes, descarte as moscas, limpe a arena e as placas de vidro com etanol 70% e substitua os tubos conectores. Mantenha o fluxo de ar seco para lavar continuamente o sistema.Para maior eficiência, é recomendável ter duas arenas para que a limpeza possa ser realizada durante os experimentos. Se vários experimentos forem realizados no mesmo dia, tome extremo cuidado para garantir que nenhum odor permaneça no sistema de um experimento anterior. Normalmente, isso não é um problema com baixas concentrações de odorizante ou com CO2, mas para estímulos altamente concentrados, pode ser necessário um intervalo de até 24 horas entre os experimentos.Para a análise dos dados, utilize a rotina personalizada fornecida em Matlab para converter os dados para o formato Matlab. Carregue o arquivo de dados brutos gerado em tempo real pelo software de rastreamento e crie uma máscara espacial que siga os contornos da arena. Aplique a máscara aos dados brutos para remover todos os pontos de dados que caem fora da arena, pois eles representam ruído.Em seguida, remova todos os pontos de dados que se movem a menos de 0,163 centímetros por segundo por mais de três segundos. Esses dados provavelmente são ruídos ou moscas imóveis. Agora, visualize os pontos de dados restantes plotando todos eles ao longo dos períodos de gravação.Os dados também podem ser visualizados como trajetórias individuais. Os limites do odor podem ser estimados rapidamente com base nos dados comportamentais da mosca. Em seguida, calcule o índice de atração e realize os testes estatísticos conforme descrito no protocolo do texto.25 moscas machos e 25 fêmeas foram testadas no aparelho comportamental. Em resposta ao ar seco, as moscas exploraram toda a arena sem preferência por qualquer quadrante. A linha mostra a trajetória rastreada de uma mosca.Quando o vinagre de maçã foi introduzido no fluxo de ar do quadrante superior esquerdo, a maioria das moscas foi atraída para esse quadrante odorante. Quando um odor repelente, o propionato de etila a 10%, foi introduzido no quadrante superior esquerdo, esse quadrante foi evitado. O índice de atratividade desse quadrante foi de 0,68.O índice de atratividade é o índice mais utilizado na medição da resposta olfativa. Um valor acima ou abaixo de zero indica atração ou repulsão. O script compensou pequenas variações na posição da arena entre os ensaios.Pontos de dados que poderiam ser ruído ou moscas imóveis foram removidos. Embora o teste possa ser realizado por qualquer duração, é interessante observar as alterações nos movimentos do grupo em intervalos de 10 segundos para perceber a habituação ao odor e outros fenômenos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como executar e analisar eficazmente comportamentos olfativos em um ensaio de quatro campos.Uma vez dominado, cada experimento olfativo pode ser concluído em cerca de uma hora, e rotineiramente realizamos de quatro a seis experimentos durante um dia.

olfactory-behaviors-assayed-computer-tracking-drosophila-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

De alta resolução de Medição do Comportamento Odor-Driven em larvas de Drosophila

Aqui nós descrevemos como otimizar a imagem de vídeo adquiridos para uma corda magnética olfativo (OMT) aparelho. Descrevemos também dois protocolos de amostragem experimental para estudar visuo-olfativa de fusão.

Visualmente Rastreamento Odor Mediated Durante o Voo em Drosophila

As moscas-das-frutas têm um sistema olfativo complexo, podem discriminar centenas de odores e usar seu olfato para direcionar decisões comportamentais. Este vídeo descreve o ensaio do olfatômetro de quatro vias, um método para estudar as respostas comportamentais olfativas em moscas. O clipe de protocolo apresentado mostra como lidar com moscas de teste e quais são as etapas críticas durante a execução do ensaio.

Ensaio de olfatômetro de quatro vias: um método para avaliar as respostas de odorantes em Drosophila

Este vídeo descreve um método para testar o comportamento exploratório olfativo na mosca da fruta, chamado de labirinto em Y. O clipe de protocolo apresentado demonstra como configurar e conduzir o ensaio.

drosófila Ensaio de labirinto em Y: um método para avaliar as respostas olfativas em moscas

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método automatizado para medir o efeito de fome ou saciedade em olfativo comportamento de busca de alimentos dependente na fruta Drosophila melanogaster mosca adulta.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em Drosophila

Apresenta-se um teste de escolha para revelar a influência de odorantes sobre o comportamento de Drosophila, utilizando um ensaio de Y-labirinto.

Prova<em&gt; Drosophila</em&gt; Olfaction com um Ensaio Y-maze

O Flywalk sistema de rastreamento automático é usado para alta resolução de quantificação do comportamento guiado por odor em Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) está associado ao comportamento social e comunicativo prejudicado e ao surgimento de comportamento repetitivo. Para estudar a inter-relação entre genes de TEA e déficits comportamentais no modelo de Drosophila , cinco paradigmas comportamentais são descritos neste artigo para testar o espaçamento social, agressão, namoro, aliciamento e comportamento de habituação.

Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

Procedimentos para gravação de alta densidade de dados EEG e olhar durante o jogo de computador baseado em tarefas cognitivas são descritos. Usando um videogame para apresentar tarefas cognitivas aumenta a validade ecológica sem sacrificar o controle experimental.

Jogo computador baseado combinando experimentos comportamentais com alta densidade de rastreamento Gaze EEG e Infravermelho

Aprenda a ensaiar comportamentos olfativos em Drosophila melanogaster usando um olfatômetro de quatro quadrantes com rastreamento automatizado. Este método versátil permite testar respostas a estímulos olfativos em grandes populações de moscas.

Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de

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