Comportamentos olfativos ensaiadas pelo monitoramento do computador de Drosophila Em um olfatômetro de quatro quadrantes

O objetivo geral desta configuração é testar os comportamentos olfativos das moscas em um olfatômetro de quatro quadrantes usando um script de software de rastreamento de moscas automatizado fornecido. Esse método pode ajudar a abordar questões-chave sobre como os sistemas neurais olfativos detectam o mundo externo e como o cérebro decodifica e direciona as decisões comportamentais. A principal vantagem desta técnica é que ela é versátil e robusta, e permite repetir o teste de respostas olfativas por população de moscas em uma grande arena experimental.

Para este protocolo, prepare cinco câmaras de odor que consistem em um recipiente externo de plástico, um recipiente interno de vidro e uma inserção de tampa de PTFE feita sob medida. A inserção é uma tampa original do recipiente com a parte central removida e duas válvulas unidirecionais anexadas. Use quatro das câmaras de odor para controles de solvente e uma câmara para um odor de teste.

Certifique-se de que cada câmara esteja limpa e, em seguida, carregue um recipiente de odor com um mililitro de diluição de solvente ou odorante. Em seguida, verifique a posição do recipiente na câmara de plástico e certifique-se de que nenhum líquido foi derramado. Prenda a tampa usando a tampa de rosca e um O-ring na inserção de PTFE para evitar vazamentos.

Crie as moscas em meio de fubá padrão. Em uma garrafa padrão, coloque 30 machos e 30 fêmeas e deixe os ovos serem postos por cinco dias em temperatura ambiente. Dessas garrafas, colete moscas recém-fechadas.

Para cada coorte experimental, colete 25 moscas machos e 25 fêmeas sob breve anestesia com dióxido de carbono e deixe a coorte envelhecer em meio de mosca padrão por dois a quatro dias. 40 a 42 horas antes do experimento, transfira a coorte para um frasco com cerca de 10 mililitros de gel de agarose a um por cento para umidade sem comida. A fome ajuda a aumentar todo o movimento, e mais de 90% das moscas devem sobreviver ao processo de fome.

Se mais de 10% morrerem, o que pode acontecer em um genótipo fraco, tente usar uma fome de um dia para todas as moscas do experimento. Com pelo menos cinco minutos de antecedência, ligue o controlador de temperatura e ajuste-o para 25 graus Celsius. Em seguida, conecte as câmaras de odor à arena por meio de um tubo de plástico.

Verifique a taxa de fluxo de ar em cada quadrante da arena usando um medidor de vazão eletrônico. Certifique-se de que os fluxos de ar de controle e odor estejam funcionando a 100 mililitros por minuto. As moscas são muito sensíveis ao fluxo de ar e é fundamental que o fluxo de ar para cada quadrante seja verificado antes de cada experimento.

Agora, limpe a arena e as placas de vidro usando etanol 70%. Limpe todas as peças duas a três vezes e deixe-as secar completamente ao ar antes de prosseguir. Em seguida, prenda as placas de vidro na arena.

Em seguida, transfira as moscas para a arena sem anestesia. Usando a gravidade, deixe-os entrar pelo orifício em uma das placas de vidro e, em seguida, cubra o orifício com uma malha circular. Agora, coloque a arena carregada de moscas na câmara à prova de luz.

Em seguida, conecte os quatro fluxos de ar de controle a cada canto da arena. Feche a porta da câmara e deixe as moscas se aclimatarem ao novo ambiente por 10 a 15 minutos. Após o período de aclimatação, execute um experimento de controle de cinco a 10 minutos no qual as moscas são expostas a quatro correntes de ar de controle.

É essencial agora analisar os dados imediatamente. Se as moscas não forem distribuídas uniformemente na arena, a arena deve ser reiniciada. É fundamental testar o comportamento das moscas de controle apenas para limpar o ar.

Isso verificará rapidamente se todas as condições de fundo estão normais. Vazamento de luz, desequilíbrio de temperatura, arena inclinada ou contaminação por odor podem causar problemas. Se necessário, descarte as moscas e limpe a arena novamente.

Se houver suspeita de contaminação por odor, substitua toda a tubulação. Continue repetindo o teste de controle com novas coortes até que os animais não mostrem preferência por nenhum dos quatro quadrantes. Em seguida, conecte a câmara de odor de teste à configuração usando uma válvula de três vias ou reconecte a tubulação e execute um experimento de teste por cinco a 10 minutos.

Para gravações experimentais mais longas, pare e reinicie rapidamente o programa de rastreamento a cada 20 minutos, ou os arquivos de dados ficarão muito grandes. Entre os testes, descarte as moscas, limpe a arena e as placas de vidro com etanol 70% e substitua os tubos conectores. Mantenha o fluxo de ar seco para lavar continuamente o sistema.

Para maior eficiência, é bom ter duas arenas para que a limpeza possa ser feita durante as corridas. Se vários experimentos estiverem errados no mesmo dia, tome muito cuidado para garantir que nenhum odor seja deixado no sistema de uma execução anterior. Isso normalmente não é um problema com baixas concentrações de odorante ou com CO2, mas para estímulos altamente concentrados, pode ser necessário um intervalo de até 24 horas entre as execuções do experimento.

Para a análise de dados, use a rotina Matlab personalizada fornecida para converter os dados em um formato Matlab. Carregue o arquivo de dados brutos feito em tempo real pelo software de rastreamento e crie uma máscara espacial que siga os contornos da arena. Aplique a máscara aos dados brutos para remover todos os pontos de dados que estão fora da arena, pois eles representam ruído.

Em seguida, remova todos os pontos de dados que se movem a menos de 0,163 centímetros por segundo por mais de três segundos. É provável que esses dados sejam ruídos ou moscas que não se movem. Agora, visualize os pontos de dados restantes plotando todos eles através dos períodos de gravação.

Os dados também podem ser visualizados como trajetórias únicas. Os limites de odor podem ser rapidamente estimados com base nos dados comportamentais da mosca. Em seguida, calcule o índice de atração, e faça testes estatísticos conforme descrito no protocolo de texto.

25 moscas machos e 25 fêmeas foram testadas no aparelho comportamental. Em resposta ao ar seco, as moscas exploraram toda a arena sem preferência por nenhum quadrante. A linha mostra a trajetória rastreada de uma mosca.

Quando o vinagre de maçã foi introduzido no fluxo de ar do quadrante superior esquerdo, a maioria das moscas foi atraída para esse quadrante de odor. Quando um odor repelente, propionato de etila a 10%, foi introduzido no quadrante superior esquerdo, esse quadrante foi evitado. O índice de atratividade desse quadrante pontuou 0,68.

Um índice atraente é o índice mais amplamente utilizado na medição da resposta olfativa. Um valor acima ou abaixo de zero indica atração ou repulsão. O roteiro compensou pequenas variações na posição da arena entre os testes.

Os pontos de dados que poderiam ter sido ruído ou moscas que não se moviam foram removidos. Embora o teste possa ser executado por qualquer duração, é interessante ver as mudanças nos movimentos da coorte em caixas de 10 segundos para apreciar a habituação ao odor e outros fenômenos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar e analisar efetivamente os comportamentos olfativos em um ensaio de quatro campos.

Uma vez dominado, cada experimento olfativo pode ser concluído em cerca de uma hora, e rotineiramente executamos de quatro a seis experimentos durante um dia.