Name: Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a detectar eventos individuais de fusão mediada por proteínas SNARE usando microscopia TIRF polarizada em células microfluídicas. Este método oferece resolução temporal de ~15 ms para estudar exocitose.

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Agradecemos a Vladimir Polejaev (Yale West Campus Imaging Core) pelo projeto e construção do microscópio TIRF polarizado, David Baddeley (Universidade de Yale) pela ajuda com a instrumentação de detecção de duas cores e James E. Rothman (Universidade de Yale) e Ben O'Shaughnessy (Universidade de Columbia) e membros de seus grupos por estimular as discussões. A EK é apoiada por um Kavli Neuroscience Scholar Award da Kavli Foundation e NIH grant 1R01GM108954.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A implementação bem sucedida do ensaio de fusão SUV-SBL aqui descrita depende criticamente vários passos-chave, tais como a reconstituição funcional de proteínas em lipossomas, obtendo SBLs de boa qualidade, e escolher os parâmetros de imagem para a direita para detectar moléculas individuais. Embora possa demorar algum tempo e esforço para ter sucesso, uma vez que o ensaio é executado com sucesso, ele oferece uma riqueza de informações sobre o processo de fusão não disponível a partir de qualquer outro ensaio de fusão ...

A fusão da membrana é um processo biológico universal necessário para o tráfico intracelular de lípidos e proteínas, secreção, fertilização, desenvolvimento, e envolveu a entrada do vírus em organismos hospedeiros 1-3. Para a maioria das reacções de fusão intracelular incluindo libertação de hormonas e de neurotransmissores via exocitose, a energia para fundir duas bicamadas lipídicas é proporcionado pela formação de um feixe de quatro hélices entre proteínas de receptor cognato solúvel N-etilmaleimida-sensível proteína factor de fixação (SNARE), ancorada na a vesícula (v-SNARE) e da membrana alvo (T-SNARE) 4, respectivamente. Synaptic exocitose da vesícula é a reação de fusão mais fortemente regulada e ocorre dentro de um milésimo de segundo depois da chegada de um 1,4,5 potencial de ação. O poro de fusão, a ligação inicial entre os dois compartimentos de fusão, pode piscar aberta e fechada várias vezes antes de selar ou expandir irreversivelmente 5-7. Os resultados anterioresem transitória, &quot;Kiss &amp; run&quot; fusion, enquanto o segundo leva a fusão completa. Fatores que regem o equilíbrio entre estes dois modos de fusão e mecanismos que regulam cintilação poros não são bem compreendidos 5,8. SNARE proteínas são necessárias para a exocitose; fusão das vesículas sinápticas é abolida por quebra de SNAREs por neurotoxinas 9. Experiências de fusão em massa usando pequenas vesículas unilamelares (SUVs) mostrou que SNAREs não só necessário, mas também suficiente para conduzir a fusão da membrana 10. Neste ensaio a granel, SUVs reconstituído com v-SNARE (V-SUV) foram dopados com fosfolípidos fluorescentes (N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) -phosphoethanolamine (NBD-PE) e ( N -. (lisamina rodamina B sulfonil) -phosphoethanolamine (LR-PE) e misturado com vesículas não marcados contendo t-SNAREs (t-SUV) Inicialmente, a fluorescência do NBD-PE no v-SUVs é extinta por Förster transferência de energia de ressonância (FRET ) para LR-PE. Como laboratórioELED v-SUVs fundir-se com t-SUVs não marcados, a densidade da superfície fluoróforo na membrana agora combinada é reduzido e o aumento resultante na fluorescência de NBD-PE relata a extensão de lípido de mistura 10. Como o ensaio é fácil de grandes quantidades definir-se e analisar, que tem sido amplamente utilizada para estudar os mecanismos de fusão mediada por SNARE 10-14. No entanto, tem várias limitações, como a baixa sensibilidade e baixa resolução tempo. O mais importante, como um conjunto de medição, ela é em média resultados de todos os eventos que fazem a discriminação entre o encaixe e de fusão, bem como a detecção de intermediários hemifusão difíceis. Durante a última década vários grupos, incluindo o nosso, desenvolveram novos ensaios para monitorar eventos de fusão no único nível vesícula 15-27. Ha e seus colegas usaram v-SUVs amarrados em uma superfície e monitorados sua fusão com livre t-SUVs 18,19. mistura lipídica foi monitorizada utilizando FRET entre um par de fluoróforos ligados a lípidos inalojado no V e t-SUVs, respectivamente, através de microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRF) 18. Mais tarde, o laboratório de Brunger utilizada uma única espécie de rótulo de lípidos juntamente com um marcador de conteúdos para a detecção simultânea de lípido de mistura e os conteúdos 20,28. Tanto o lipídico e os marcadores de conteúdo foram incluídos em concentrações elevadas, auto-extingue; fusão com SUVs não marcados resultou em fluorescência dequenching 20,28. Outros têm fundido v-SUVs para bicamadas planar reconstituídos com t-SNAREs 15-17,21-27,29. A geometria planar do alvo (T-SNARE contendo) bicamada imita melhor o processo de fusão fisiológica de pequenas vesículas, altamente curvadas com uma membrana de plasma plana. O grupo Steinem empregada membranas de abrangência dos poros reconstituídos com t-SNAREs, suspensas sobre um substrato de nitreto de silício poroso e detectado fusão com v-SUVs individuais usando microscopia confocal de varrimento laser 23. outros fusados ​​v-SUVs para bicamadas planar reconstituídos com t-SNAREs, apoiada sobre um substrato de vidro 15-17,21,22,24-27,29. A grande vantagem do uso de camadas duplas suportados (SBLs) é que a microscopia TIRF pode ser usado para detectar atracação e de fusão eventos com excelente relação sinal-ruído e sem interferência de V-SUVs livres, embora usando microfluídica também fornece resolução single-evento usando microscopia de epifluorescência-campo distante padrão de 24. Uma preocupação importante é se, e como interacções substrato-bicamada suportada afectar a qualidade da bicamada e o processo de fusão. Os primeiros trabalhos feito uso de SBLs planares que foram suportados directamente sobre um substrato de vidro ou de quartzo 15-17. Estes SBLs foram feitas por adsorção, a rebentar, espalhando e fusão de membranas t-SUV sobre o substrato. Foi logo percebeu, porém, que omitir um componente-chave t-SNARE, SNAP25, de SBLs preparados desta maneira resultou em v-SUV de atracação e de fusão cinética indistinguishable daqueles obtidos utilizando a completa t-SNAREs 17. Porque SNAP25 é absolutamente necessária para a fusão in vivo 30,31, a relevância fisiológica desses primeiras tentativas foi posta em causa. O grupo de Tamm superou este desafio usando a formação de bicamada melhor controlada suportado 21. Usou-se a deposição de Langmuir-Blodgett, pela primeira folheto livre de proteínas de SBL, seguido por fusão de que monocamada com t-SUVs 21. Isto resultou na fusão dependente de SNAP25. Para evitar artefactos potenciais associados a uma bicamada suportada directamente sobre um substrato de vidro, sem necessidade de utilizar métodos de Langmuir-Blodgett, Karatekin et ai. Introduziu um poli hidratado (etileno glicol) de apoio macio, (PEG) entre a bicamada e o substrato 24. Esta modificação também resultou na fusão dependente da SNAP25 24. Bicamadas almofadadas em uma camada de polímero macio tinha sido conhecido para melhor preservar transmembranamobilidade e função das proteínas de 32, e tinha sido utilizado em estudos de fusão com vírus 33. Além disso, bicamadas PEGilados parecem manter alguma capacidade de se auto-curar e são muito robustos 34,35. Em primeiro lugar, uma fracção de cadeias de PEG disponíveis comercialmente, ligados em lípidos incluídos na membrana t-SUV. Quando estes t-SUVs rebentar e formar uma bicamada planar num substrato de vidro, uma escova de PEG abrange ambos os folhetos da bicamada planar. Como a formação de bicamada planar é impulsionado por intermédio de adesão das cadeias de PEG circundantes t-SUVs sobre a superfície de vidro hidrófilo, rebentamento de lipossomas e formação em bicamada planar são relativamente insensíveis à composição de lípido utilizado. No entanto, quando grandes quantidades de colesterol estão incluídos, aumentando as propriedades coesivas dos SUVs, as SUVs não pode rebentar espontaneamente. Se este for o caso, os iões divalentes ou choque osmótico pode ser empregado para ajudar a formação planar de duas camadas 25. Como mencionado acima, nesta approach uma escova de PEG cobre ambos os lados do cartão planar, suportado bicamada. A escova de frente para o canal de fluxo de microfluidos ajuda a evitar a aderência não específica da v-SUVs de entrada que também são geralmente cobertos com uma camada de PEG. A formação de complexos e t-V- SNARE começa a partir do terminal N da membrana distal e procede em etapas para com os domínios membrana proximal 36. Para os v-SUVs para interagir com o t-SBL, a necessidade e v- t-SNARE terminais N a projectar-se acima das escovas de PEG, o que parece ser o caso nas condições do ensaio. Altura da escova pode ser adaptada para estudar outras proteínas que SNARE, variando a densidade de lipidos PEGilados e o comprimento da cadeia de PEG 37,38. Um outro benefício das escovas de PEG que cobre as superfícies proximais das bicamadas de fusão é que eles imitam o ambiente de aglomerado de membranas biológicas, que são embalados com 30.000-40.000 proteínas de membrana integrais por quadrado 39 micron. Assim como as cadeias de PEG Neste ensaio, o repucamada de proteína lsive abrangendo membranas biológicas tem de ser empurrado de lado para permitir o contacto entre as duas bicamadas de fosfolípidos para a fusão ocorresse. canais de microfluidos de fluxo são utilizados neste ensaio, uma vez que oferecem vantagens únicas. Primeiro, o fluxo microfluídico permite a deposição uniforme mais de t-SUVs para espalhar e se fundem para formar o t-SBL. Em segundo lugar, o volume do canal de pequeno (&lt;1 ul) minimiza o consumo da amostra. Em terceiro lugar, as pequenas quantidades necessárias de permitir que todo o experimento ser conduzida sob fluxo constante. Fluxo remove fracamente, presumivelmente não-especificamente, aderiram v-SUVs da SBL 16. Ele também mantém uma densidade constante de v-SUVs acima do t-SBL, simplificando a análise cinética 17. Finalmente, vesículas ancoradas são facilmente distinguidos dos mais livre transportados pelo fluxo 25. Em quarto lugar, vários canais de microfluidos pode ser utilizado na mesma lamela, cada sondagem de uma condição diferente. Isto permite a comparação das condições de during mesma corrida experimental. Uma abordagem semelhante foi usada pelo grupo van Oijen para estudar fusão entre vírus influenza e SBLs almofadadas 33. Em microscopia TIRF, o decaimento exponencial do campo evanescente (com um decaimento constante de ~ 100 nm) limites de excitação de fluorescência para aquelas moléculas que são muito próximo da interface vidro-tampão. Isso minimiza a contribuição de moléculas fluorescentes que estão mais longe, aumenta a relação sinal-ruído, e permite sensibilidade única molécula com tempos de exposição de quadro de 10-40 ms. O campo evanescente também leva a um aumento de sinal em cima de fusão: como a transferência de lípidos marcados a partir do SUV para o SBL, encontram-se, em média, em um campo de excitação mais forte. Este aumento na fluorescência é mais forte para os lipossomas maiores. Se a luz polarizada é usada para gerar o campo evanescente, efeitos adicionais contribuir para alterações na fluorescência após transferência de etiquetas do SUV na SBL. Alguns corantes de lípidos tem um dipolo de transição orientada com um ângulo médio preferido em relação à camada dupla em que eles são incorporados. Isto cria uma diferença de a quantidade de fluorescência emitida pelos fluoroforos quando estão no SUV versus a SBL, uma vez que o feixe polarizado vai excitar corantes nas duas membranas de forma diferente. Para o primeiro, o feixe de excitação vai interagir com dipolos orientados de transição em torno do SUV esférica, ao passo que para o segundo, orientações dipolo será confinado pela geometria plana SBL. Por exemplo, quando é usado s-luz polarizada incidente (polarizado normal ao plano de incidência), a excitação é mais eficiente quando o corante é no SBL do que no SUV por um corante de lípidos transição dipolo orientado paralelamente à membrana 29,40 (como a de DII ou fez 41-43). Um SUV dopado com tal fluoróforo aparece dim quando se dirige para o SBL (Figura 7, Representat<html> ive Resultados). Como um poro de fusão abre e liga as membranas SUV e SBL, sondas fluorescentes difundem-se para a SBL e tornar-se mais susceptível de ser excitado pelo campo evanescente s-polarizados 25,27,29. Por conseguinte, o sinal de fluorescência integrada em torno do local de fusão aumenta acentuadamente durante a transferência de corantes a partir de SUV para a SBL 27 (Figura 3 e Figura 7). Um factor adicional que contribui para sinalizar mudanças que acompanham fusão é dequenching de etiquetas fluorescentes, como eles são diluídos quando transferido para a SBL. A contribuição de dequenching é geralmente menor em comparação com efeitos evanescentes decaem campo e polarização no ensaio descrito aqui, porque apenas uma pequena fração ( <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" /> ) Dos lípidos são rotulados. O aumento do sinal mediante a fusão pode ser explorada para deduzir propriedades de poros de fusão através da comparação do tempo,1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54349 / 54349eq2.jpg &quot;/&gt;, necessário para um lipídio de escapar através de um poro que é livremente permeável à lipídios com o tempo de lançamento real, <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" /> . Se as duas escalas de tempo são comparáveis, ao que se concluir que a poro apresenta pouca resistência ao fluxo de lípido. No entanto, se o tempo efectivo de libertação é significativamente mais longo do que o tempo para a libertação limitada por difusão, isso indicaria um processo, tal como tremulação de poro, retardador de libertação de lípidos. O tempo de liberação limitada por difusão, <img alt="equação 1" src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" /> , Depende do tamanho do lipossoma de fusão e de lípidos-difusividade; sua estimativa exige estes dois parâmetros para ser quantificado. A sensibilidade única molécula do ensaio permite diffusivity lipídica a ser medido através do rastreamento vários fluoróforos única de lipídios após a sua libertação no SBL para cada evento de fusão 26. O tamanho de cada vesícula fusãopode ser cerca de 27 por combinação de (I) a intensidade de um único corante lípido, (ii) a alteração na fluorescência total em torno de um local de ancoragem depois de todos os fluoróforos são transferidos para a SBL mediante fusão, (iii) a densidade de rotulagem conhecidos de SUV lípidos, e (iv) a superfície por lípido. Para muitos eventos de fusão, os tempos de libertação de lípidos reais foram encontrados para ser muito mais lento que o esperado pela libertação de difusão controlada 27, como foi observado anteriormente assumindo SUV tamanho uniforme 44. Assumindo retardamento da liberação de lipídios é devido a pore cintilação, um modelo quantitativo permite a estimativa de &quot;abertura dos poros&quot;, a fração de tempo do poro permanece aberta durante a fusão 27. Sempre que possível, é importante para testar mecanismos de fusão usando tanto conteúdo etiquetas solúveis lipídico e. Por exemplo, a liberação de lipídios pode ser retardado por outros que cintilação poros processos, como a restrição da difusão de lípidos pelas proteínas SNARE que cercam tele poros. Se este fosse o caso, em seguida, solte do conteúdo precederia de suporte de etiquetas de lipídios, desde o poro é grande o suficiente para permitir a passagem de sondas solúveis. Uma falha mais fundamental na abordagem poderia ser sob a suposição de que a transferência de lípidos marcados para a SBL ocorre através de um poro de fusão estreita que liga a SBL a uma vesícula que manteve a sua forma, em grande parte de pré-fusão. Transferência de lípides para a SBL também pode resultar de uma rápida dilatação dos poros de fusão com uma concomitante, extremamente rápido colapso do SUV na membrana SBL, como previamente sugerido com base em dados de libertação de lípidos sozinho 29. Monitoramento tanto lipídica e conteúdo liberar simultaneamente, verificou-se que muitos poros fechados de novo depois de libertar todos os seus rótulos de lipídios, mas manteve alguma da sua carga solúvel 27. Isto indica que, pelo menos alguns lipossomas não colapsam para a SBL após a fusão, e que a transferência de corante de lípidos no SBL ocorre através de um poro de fusão. Além disso, lIPID e conteúdo de libertação ocorreu simultaneamente 27, tornando improvável que retardamento da libertação de lípidos era devido ao impedimento de difusão de lípidos pelas proteínas SNARE circundantes do poro 45. Um protocolo de fusão SUV-SBL que não monitorar liberação conteúdos solúveis foi publicado anteriormente pelo Karatekin e Rothman 25. Aqui, os desenvolvimentos mais recentes são incluídos, monitoramento ou seja simultânea de lipídios e conteúdo liberar e estimativa de propriedades SUV, lipídios, e de poros de fusão 27. O protocolo começa com instruções para preparar as células de microfluidos, realizadas por ligação de um poli (dimetilsiloxano) (PDMS) elastómero de blocos contendo ranhuras com uma lamela de vidro de 25. Em seguida, preparação de v-SUVs com tanto lipídica e conteúdo marcadores é explicado. Secções 4 e 5 fornecem instruções para a montagem das células microfluídicos, formando os SBLs in situ e verificar se há defeitos e fluidez, introdução de vSUVS para as células de fluxo e detecção de eventos de fusão. Secção 6 fornece instruções para a análise de dados.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reagentes</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) água</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Prova</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol Fisher</td><td>Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Colreto de Sódio (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hidroxietil] piperazina-N'-[ácido 2-etanossulfônico] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>Tampão HEPES-KOH (pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &mu; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4">Solventes</td></tr><tr><td>Clorofórmio&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>em frasco de vidro, CUIDADO, use EPI</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>em frasco de vidro, CUIDADO, use EPI</td></tr><tr><td colspan="4">Preparação de lipossomas</td></tr><tr><td>Seringa Gastight Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>var. tamanhos</td><td>use apenas sringe de vidro com solents (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Tubos de vidro Pyrex Vista 11 ml, tampa de rosca 16x100 mm tubo de cultura</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>limpe bem, enxágue com clorofórmio</td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Lipids vêm dissolvidos em CHCl3 ou como pó lifilizado em frascos lacrados. Alíquota na abertura. Armazene extra como filmes lipídicos secos em atmosfera inerte a -20 ° C. Mantenha os estoques em CHCl 3 / MeOH (2: 1, v / v) a -20 ° C. deixe vir para RT antes</td></tr><tr><td>de abrir 1,2-dioleoil- sn - glicero-3-fosfo-L-serina (sal de sódio), 18: 1 PS (DOPS)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>mesmo que acima.</td></tr><tr><td>1-estearoil-2-araquidonoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850804</td><td>O mesmo que acima.</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (Cérebro, Suíno) (sal de amônio), Cérebro PI(4,5)P2</td><td>Avanti Lipídios polares</td><td>840046</td><td>O mesmo que acima.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il) (sal de amônio), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145</td><td>O mesmo que acima.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>O mesmo que acima.</td></tr><tr><td>colesterol (lã ovina, >98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>O mesmo que acima.</td></tr><tr><td>Óleo DiD'; Óleo de DiIC18(5) (1,1'-Dioctadecil-3,3,3',3'-Perclorato de Tetrametilindodicarbocianina)</td><td>Sondas Moleculares</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>banho de calor acima de Tm de lipídios usados</td></tr><tr><td>OG n-Octil-&beta;-D-Glucopyranoside</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>armazenar a -20 &deg; C, vamos ao RT antes de abrir</td></tr><tr><td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze de Diálise, 20k MWCO, 3&nbsp; ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorventes</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; Gradiente de Densidade Médio</td> Tubo de Ultracentrifugação <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2&nbsp; ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorhodamineB</td><td>Sondas Moleculares</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&nbsp; Colunas de cromatografia, 2,5 &vezes; 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange Protein Gel Stain</td><td>Molecular Probes</td><td>S-6650</td><td>5,000x Concentrado em DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro Pyrex, 150 x 20 mm, completa com tampa</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Furador - Punção de Biópsia Reutilizável, 0.75&nbsp; mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de Perfuração Manual&nbsp;</td><td>Broca SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>.035 x .026 x 1.5 304 SS TiN revestida com punção redonda</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>diâmetro da broca: 0.9 mm, tamanho do furo do punção: 0.74 mm</td></tr><tr><td>Tubulação Tygon Microbore, 0.25 mm ID, 0.76 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0.010" ID, 0.030" OD</td></tr><tr><td>Tubulação de Silicone (0.51 mm ID, 2.1 mm OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0.020" ID, 0.083" OD</td></tr><tr><td colspan="4">Vidro de cobertura - sala limpa limpa</td></tr><tr><td>Schott Nexterion lamínula de vidro D</td><td>Schott</td><td>1472305</td><td></td></tr><tr><td>limpador de plasma</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF configuração e acessórios</td></tr><tr><td>IX81 corpo do microscópio</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD câmera</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, platina de microscópio aquecida</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de vidro hamilton de 1 ml (4x)</td><td>Bomba</td> de seringa Hamilton <td>81365</td><td></td></tr><tr><td></td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

fusão snare mediada por uma única proteolipossomos com bicamadas suportados tethered em uma célula microfluidic fluxo monitorado por polarizada tirf microscopia

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

No processo de fusão membranar omnipresente a abertura de um poro de fusão estabelece a primeira ligação entre dois compartimentos anteriormente separadas. Durante neurotransmissor ou a liberação de hormônio através de exocitose, o poro de fusão podem transitoriamente abrir e fechar repetidamente, regulando cinética de liberação de carga. dinâmica dos poros também determinam o modo de reciclagem de vesícula; irreversíveis revedação resulta na fusão transitória, &quot;beije-and-run&quot;, enquanto a dilatação leva a fusão completa. Para entender melhor quais os fatores que regem a dinâmica dos poros, desenvolvemos um ensaio para monitorar a fusão da membrana utilizando microscopia polarizada total de fluorescência de reflexão interna (TIRF), com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms em um bioquimicamente bem definida sistema in vitro. Fusão de fluorescente etiquetado pequenas vesículas unilamelares contendo proteínas v-SNARE (V-SUVs) com um planar bicamada rolamento t-SNAREs, apoiada sobre uma almofada de polímero macio (t-SBL, bicamada suportada-t), É monitorizada. O ensaio utiliza canais de fluxo de microfluidos que asseguram o consumo da amostra mínima, enquanto o fornecimento de uma densidade constante de SUVs. Explorando o reforço de sinal rápida mediante a transferência de etiquetas de lipídios do SUV à SBL durante a fusão, cinética de transferência de corante de lípidos é monitorada. A sensibilidade da microscopia TIRF permite rastrear etiquetas lipídicas fluorescentes individuais, a partir do qual diffusivity lipídico e tamanho SUV podem ser deduzidas para cada evento de fusão. tempos de liberação corante de lípidos pode ser muito maior do que o esperado para a passagem desimpedida através de poros abertos em permanência. Usando um modelo que assume retardamento da liberação de lipídios é devido a pore cintilação, um poro &quot;abertura&quot;, a fração de tempo do poro permanece aberta durante a fusão, pode ser estimado. Um marcador solúvel pode ser encapsulado nas SUVs de monitorização simultânea de lípido e de libertação de carga solúvel. Tais medições indicam alguns poros pode selar novamente depois de perder uma fracção da carga solúvel.

Qualidade SBL É crucial para verificar a qualidade e a fluidez do SBL antes da experiência da fusão. A fluorescência no lado de baixo, de vidro de um canal microfluídico deve ser uniforme, sem quaisquer defeitos óbvios. Se uma bolha de ar passa através do canal, ele geralmente deixa cicatrizes visíveis na SBL. Se existem tais grandes cicatrizes escala / defeitos, não utilize esse canal. Às vezes SUVs podem ade...

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

O objetivo geral deste ensaio é observar eventos individuais de fusão de membranas mediados por proteínas SNARE neuronais e exocitóticas, a fim de compreender os mecanismos fundamentais da liberação de neurotransmissores e hormônios. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de fusão de membranas, como a forma pela qual a liberação de conteúdo ocorre através de uma poro de fusão dinâmico e o destino do poro após a fusão. A principal vantagem desta técnica é que estágios distintos do ancoramento de vesículas, fusão para abertura e cinética da liberação de conteúdo podem ser observados em eventos individuais dentro de ambientes bioquimicamente definidos.Embora este método possa fornecer informações sobre a exocitose, ele também pode ser aplicado a outras reações de fusão de membranas, como a fusão de vírus envelopados com membranas de células-alvo durante a infecção. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque muitas etapas diferentes precisam ser dominadas, desde a microfabricação até a purificação de proteínas e o imageamento. Para começar, prepare um molde-matriz de silicone utilizando técnicas padrão de fotolitografia e o modelo mostrado aqui.Em seguida, adicione 100 mililitros da base de PDMS e 10 mililitros do agente de cura em um copo plástico descartável e misture bem. Depois, coloque o copo em um dessecador a vácuo. Aplique vácuo, mas observe atentamente para evitar que a mistura transborde.Após a desgaseificação, despeje uma grande gota da mistura de PDMS desgaseificada em uma placa de Petri de vidro e pressione o molde sobre o PDMS com o lado do molde voltado para cima, a fim de evitar o aprisionamento de bolhas sob a lâmina. Em seguida, despeje PDMS desgaseificado sobre o molde até que este fique coberto por cinco a oito milímetros do polímero. Caso ocorra uma bolha de ar, remova-a suavemente com a ponta de uma pipeta.Coloque o molde revestido com PDMS sobre uma superfície nivelada de uma estufa e aqueça por três horas a 60 graus Celsius. Em seguida, utilize uma lâmina nova de bisturi para recortar um bloco de PDMS contendo as estruturas canalares moldadas. Observe que o bloco recortado precisa caber sobre uma lamínula.Em seguida, posicione o lado com as ranhuras do canal voltado para cima e use um furador para perfurar o bloco em um único movimento contínuo. Certifique-se de remover o pedaço perfurado de cada uma das oito posições dos furos. Ao finalizar, fixe as ranhuras do bloco para baixo sobre um pedaço limpo de papel alumínio.Agora, corte o tubo de modo que fique com uma leve inclinação em uma das extremidades e use um par de pinças para empurrar o tubo cerca de um terço do caminho para dentro dos orifícios perfurados. Corte os tubos de forma que consigam alcançar o reservatório de tampão e a bomba de seringas. Para conectar os tubos às seringas da bomba de seringas, corte um pequeno pedaço de um tubo de silicone maior e, em um dos lados, insira o tubo mais fino.Este bloco de PDMS pronto para uso pode ser armazenado por alguns meses. Primeiro, coloque o bloco de PDMS sob vácuo elevado por pelo menos 20 minutos para remover gases dissolvidos e reduzir o risco de bolhas de ar nos canais microfluídicos durante o experimento de fusão. Em seguida, certifique-se de que a área da platina do microscópio esteja ajustada à temperatura desejada.Enquanto a temperatura se estabiliza, prepare as vesículas unilamelares pequenas marcadas com NBD-PE fluorescente contendo proteínas t-SNARE, ou controles livres de proteína, diluindo 30 microlitros das vesículas com 60 microlitros de tampão. Em seguida, aspire a solução em uma seringa de três mililitros. Expulse a maior parte do ar acima da amostra enquanto segura a seringa na posição vertical.Em seguida, feche a ponta com filme de parafina e crie um vácuo puxando o êmbolo. Enquanto aplica o vácuo, dê leves batidas no corpo da seringa para acelerar a desgaseificação da solução. Repita este processo várias vezes até que não apareçam mais bolhas de ar quando o vácuo for aplicado.Em seguida, use uma agulha hipodérmica com diâmetro ligeiramente maior que o do tubo microfluídico para furar um orifício na tampa de um tubo de microcentrifugação. Preencha os vesículos unilamelares pequenos desgaseificados no tubo de microcentrifugação, coloque-o no suporte da platina do microscópio e deixe a solução atingir o equilíbrio na temperatura definida. Coloque um lamínula limpo em um limpador de plasma e aplique plasma de ar sobre o lamínula por cerca de cinco minutos.Em seguida, remova a lamínula e coloque-a, com o lado tratado voltado para cima, sobre algumas tiras de tecido livre de fiapos que servirão como amortecedor. Depois, posicione o bloco de PDMS, com o lado padronizado voltado para baixo, sobre a lamínula. Utilize um par de pinças para pressionar suavemente o bloco, mas sem pressionar com tanta força a ponto de quebrar o vidro.Coloque a célula de fluxo montada sobre a platina do microscópio. Em seguida, conecte os tubos aos reservatórios de vesículas unilamelares pequenas e à bomba de seringa. Inicie a aspiração das vesículas unilamelares pequenas a três microlitros por minuto até que a solução preencha completamente os canais.Quando as soluções em todos os canais começarem a subir pelos tubos no lado de saída, reduza o fluxo para 0,5 microlitros por minuto e incube por 30 a 45 minutos. O tempo entre o tratamento com plasma na lamínula de vidro e a passagem das SUVs para o canal não deve exceder 10 minutos, pois o efeito do tratamento com plasma é transitório. Verifique os canais quanto a vazamentos utilizando imagem de fluorescência com uma objetiva de baixa ampliação e, em seguida, lave todos os canais com tampão desgaseificado para remover vesículas não ligadas.Em seguida, mude para a objetiva de imersão em óleo com alta ampliação para microscopia TIRF e fixe a câmara de fluxo colocando-a com fita adesiva na platina do microscópio. Feche o diafragma de campo para cerca de 40 micrômetros de diâmetro e ajuste a intensidade da luz de excitação de 488 nanômetros usando o software, de modo a blear significativamente, mas não completamente, a fluorescência na área exposta. A intensidade da fluorescência no centro da área exposta deve ser menor do que nas bordas, pois as moléculas intactas de NBD-PE entram e difundem-se por uma certa distância antes de serem bleadas.No entanto, se as SUVs aderidas à superfície não romperem, todos os fluoróforos na área exposta devem sofrer bleaching. Para verificar os resultados das medições do estado do estudo, interrompa a iluminação e reinicie-a alguns minutos depois para verificar se a fluorescência se recuperou. Desgaseifique o tampão de reconstituição e use-o para diluir a solução estoque de vesículas pequenas unilamelares reconstituídas com v-SNARE, de modo que a solução resultante produza de 10 a 100 eventos de fusão no campo de visão ao longo de 60 segundos.Um número excessivo de eventos de fusão aumenta a fluorescência de fundo e dificulta a detecção e análise desses eventos. Em contrapartida, uma taxa de fusão muito baixa pode resultar em estatísticas insuficientes. Fluide as vesículas unilamelares pequenas reconstituídas com v-SNARE no canal a uma taxa de fluxo de dois microlitros por minuto e alterne para as configurações apropriadas de excitação e emissão para monitorar a mistura de lipídios.Em seguida, ajuste o ângulo e a polarização do TIRF conforme descrito no protocolo de texto complementar. Excite continuamente e monitore a fluorescência das vesículas usando um laser de 561 nanômetros. Conforme as vesículas alcançam o canal de fluxo e se fixam na bicamada suportada, fundindo-se a ela, o sinal de fluorescência de fundo começa a se acumular.Ajuste a intensidade do laser de excitação por meio do software para bleaciar continuamente a fluorescência de fundo, de modo que novos eventos de ancoragem e fusão possam ser facilmente observados. Adquira vários vídeos em diferentes posições em um canal específico. Verifique a fluorescência do NBD-PE para confirmar que a bicamada suportada não apresenta defeitos nessas posições.A recuperação da fluorescência após fotoesmaecimento é mostrada aqui para uma bicamada suportada reconstituída com t-SNARE relativamente livre de defeitos e fluida. A área é imageada com baixa exposição à luz para acompanhar a recuperação da fluorescência por difusão de lipídios marcados com NBD. É mais fácil observar eventos de ancoragem e fusão enquanto se monitora a fluorescência proveniente exclusivamente de marcas lipídicas.Na sequência de imagens mostrada aqui, um quadro foi registrado a cada 18 milissegundos. Após a fusão, os marcadores lipídicos transferem-se para a bicamada suportada e difundem-se para longe do local de fusão. Em alguns casos, é desejável monitorar simultaneamente a mistura de lipídios e a liberação de carga solúvel.Um evento representativo que descreve a mistura simultânea de lipídios e a liberação de carga solúvel é mostrado aqui. Nas altas concentrações utilizadas para encapsulação, a fluorescência do conteúdo solúvel representada em vermelho é inicialmente autoquenchada. Um aumento acentuado na fluorescência de lipídios, representado em azul, indica a mistura de lipídios devido a um evento de fusão, como no monitoramento de cor única de marcadores lipídicos mostrado anteriormente.A abertura da poro libera o corante do conteúdo solúvel e alivia o autoextinção inicial do corante na luz da vesícula. Isso leva a um aumento no sinal da carga solúvel, representado em vermelho. Curiosamente, a fluorescência da carga atingiu uma platô estável.Isso indica que o poro foi resselado após a liberação de todas as marcas lipídicas e de uma fração da carga solúvel. No final, o sinal do conteúdo solúvel, representado em vermelho, diminui muito rapidamente. Isso provavelmente se deve à fusão completa rápida ou à ruptura do lipossomo.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar uma célula de fluxo microfluídica a partir de uma bicamada suportada reconstituída com proteínas t-SNARE e monitorar e analisar eventos individuais de fusão de vesículas utilizando microscopia TIRF. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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