Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

O objetivo geral deste procedimento de dissecção é isolar o círculo murino de Willis para facilitar o estudo dos grandes vasos da cerebrovasculatura do camundongo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da expressão gênica cerebrovascular em várias doenças que afetam os vasos cerebrais, como a doença de Alzheimer e a angiopatia amelóide cerebral. A principal vantagem dessa técnica é que os grandes vasos podem ser isolados de forma rápida e fácil sem alterar a estrutura do vaso.

Comece usando uma tesoura de íris para fazer uma incisão de quatro centímetros de comprimento na parede abdominal e no peritônio de um camundongo letalmente anestesiado logo abaixo da caixa torácica. Em seguida, faça uma incisão de alguns milímetros de comprimento no diafragma, continuando a incisão ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Levante o esterno e prenda a ponta com um hemostático, apoiando o hemostático no pescoço.

Em seguida, apare cuidadosamente o tecido adiposo que conecta o esterno ao coração. Agora passe uma agulha de profusão de calibre 15 através do ventrículo esquerdo até o ápice do coração e use uma tesoura para cortar um dos lobos do fígado para criar uma saída para o perfusato. Perfunda o animal com 25 a 50 mililitros de PBS a uma taxa de bombeamento de 2,5 mililitros por minuto por cerca de dez minutos.

O fígado deve empalidecer à medida que o sangue é substituído por PBS. Quando o fluido do fígado estiver completamente limpo, interrompa a perfusão. Para isolar o cérebro, use uma tesoura de íris para fazer uma incisão na linha média ao longo da pele, do pescoço ao nariz.

Apare a pele com a tesoura de íris para expor o crânio e remover qualquer músculo residual e tecido adiposo. Em seguida, coloque as pontas da tesoura de íris em um lado do forame magno e deslize cuidadosamente as pontas ao longo da superfície interna do crânio até o conduto auditivo externo. Faça uma incisão semelhante no outro lado do forame magno, seguida por um corte na linha média ao longo da superfície interna do osso interparietal até o início da sutura sagital.

Plante a tesoura de íris fechada no osso frontal entre os olhos na sutura sagital e abra as lâminas para dividir o crânio em dois. Usando uma pinça, segure os bulbos olfatórios e use a tesoura de íris para cortar as conexões nervosas na superfície ventral do cérebro. Em seguida, mergulhe o cérebro em uma placa de Petri de 60 milímetros de PBS gelado.

Para isolar o círculo de Willis, transfira o prato para uma bolsa de gelo sob um microscópio de dissecação e vire o cérebro em sua superfície dorsal para visualizar o círculo de Willis. Use a pequena pinça para agarrar as artérias cerebrais anteriores na base dos lobos olfatórios e exerça pressão para dissociar as artérias do continuum do vaso. Corte as artérias cerebrais médias da mesma maneira.

Em seguida, use as pontas afiadas da pinça para agarrar as artérias cerebrais médias e levantar o início das artérias comunicantes posteriores, desconectando os dois conjuntos de artérias do cérebro. Em seguida, levante as artérias anteriores, puxando-as suavemente sobre o quiasma óptico na direção dorsal anterior. Remover as artérias cerebelares superior e posterior da mesma forma, seguido do deslocamento da artéria basilar.

Finalmente, use a pinça para transferir suavemente todo o círculo de Willis em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo PBS gelado e fixe os vasos no lugar com pequenos pinos, usando duas pinças para remover cuidadosamente qualquer tecido cerebral restante. O círculo de Willis deve sair inteiro e deve ser ligeiramente transparente devido à ausência de sangue residual na vasculatura. O círculo limpo de Willis deve expressar especificamente marcadores de células musculares lisas vasculares, como Actina de Músculo Liso, Cadeia Pesada de Músculo Liso-Miosina e Smoothelina.

Marcadores neuronais, como glicoproteína de oligodendrócitos de mielina ou proteína 2 associada a microtúbulos, por outro lado, devem ser apenas pouco detectáveis no círculo de Willis. Além disso, a expressão do marcador endotelial, E-Selectin, em não-círculo de tecido neural de Willis, é muito semelhante à obtida para amostras do círculo de Willis, possivelmente refletindo a existência de uma rede cérebro-capilar. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os vasos cerebrais do camundongo são muito finos e quebram facilmente. Assim, a dissecação deve ser realizada com muito cuidado, sem pressa, para garantir que toda a estrutura seja colhida inteira. Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da doença neural inflamatória explorarem distúrbios vasculares cerebrais em modelo de camundongo de Alzheimer e doenças relacionadas, como a angiopatia amilóide cerebral.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar o círculo de Willis de um mouse.