Name: Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Aprenda a isolar o círculo de Willis de camundongos para estudar a cerebrovasculatura em modelos murinos. Este protocolo permite obter vasos grandes intactos para pesquisas em neurociência e doenças cerebrovasculares como o Alzheimer.

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Este trabalho foi apoiado pelo VI Universidade Paris e uma bolsa Pierre Fabre Inovação.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as normas da Comunidade Europeia para o cuidado e uso de animais de laboratório, com a aprovação do comitê de ética local para experimentação animal (Ile de France-Paris-Comitê, Autorização 4270). 1. Anestesia <ol><li> Infundir uma dose letal de pentobarbital (até 1 mg / 10 g de peso corporal) (agulha de calibre 27 e seringa de 1 ml) por via intraperitoneal em ratinhos adultos antes da cirurgia. </li></ol> Perfusão 2. Vessel NOTA: Não há necessidade de aplicar vet pomada para os olhos durante a perfusão navio. Este procedimento é rápido (5-10 minutos) e termina na morte do animal. Confirmar a falta de resposta com uma pitada dedo do pé. <ol><li> Usando íris tesouras, fazer uma incisão, de cerca de 4 cm de comprimento, na parede abdominal e peritônio, logo abaixo da caixa torácica. </li><li> Fazer uma pequena incisão (alguns milímetros de comprimento) no diafragma e, em seguida, continue a incisão do diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. </li><li> Levante o esterno de distância e apertar a ponta do esterno com a pinça hemostática; colocar a pinça hemostática no pescoço. Cuidadosamente cortar o tecido adiposo que liga o esterno para o coração. </li><li> Passar a perfusão agulha de calibre 15 através do ventrículo esquerdo para o vértice do coração. </li><li> Finalmente, utilize uma tesoura para cortar um dos lóbulos do fígado para criar uma saída. NOTA: Uma tomada alternativa pode ser criado usando íris tesouras para criar uma incisão no átrio direito. </li><li> Perfundir o animal com 25 a 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com uma bomba que opera a uma velocidade de 2,5 ml / min. O fígado deve blanch como o sangue é substituído por PBS. </li><li> Depois de aproximadamente cinco minutos, uma vez que o fluido a partir do fígado é completamente claro, parar a perfusão. </li><li> Se imunocoloração ou coloração regular é planejado, perfundir o animal com 50 ml de paraformaldeído(PFA; 4% em PBS) durante 15 min. NOTA: Cuidado, fumos PFA são tóxicos. Perfusão do animal com PFA deve ser levada a cabo numa hotte ventilada. </li></ol> 3. O isolamento do cérebro e do Círculo de Willis <ol><li> O isolamento do cérebro <ol><li> Retire a cabeça com um par de tesouras cirúrgicas. </li><li> Faça uma incisão na linha média com íris tesouras, ao longo da pele do pescoço até o nariz. </li><li> Aparar a pele para expor o crânio e remova todos os músculos residuais e tecidos adiposos com tesoura de íris. </li><li> Colocar a ponta da íris tesouras para o buraco occipital de um lado e deslize-as cuidadosamente ao longo da superfície interna do crânio para o meato auditivo externo (também conhecida como o canal do ouvido). </li><li> Reproduzir a incisão descrito em 3.1.4 no lado contralateral e fazer um corte na linha média ao longo da superfície interna do osso inter-parietal para o início da sutura sagital. </li><li> Plantar a íristesouras no osso frontal, bem entre os olhos, na sutura sagital e, em seguida, abri-los para dividir o crânio em dois. </li><li> Levante o cérebro, agarrando os bulbos olfatórios e usando as íris tesoura para cortar as conexões nervosas em sua superfície ventral. </li><li> Remover o cérebro e colocá-lo em um prato de 60 mm de Petri contendo PBS gelado para o isolamento de vaca. Mergulhe completamente o cérebro na PBS. Se o cérebro foi fixada com PFA a 4% (para corte subsequente e imunocoloração ou coloração normal), mantê-lo em um banho de PFA a 4% a 4 ° C durante 24 h. </li></ol></li><li> O isolamento do círculo de Willis NOTA: Um microscópio de dissecação é necessária para o isolamento de vaca. O cérebro deve ser mantida a 4 ° C ao longo de todo o procedimento. <ol><li> Coloque o cérebro de cabeça para baixo (ou seja, em sua superfície dorsal) para visualizar a vaca. </li><li> Use uma pequena pinça para agarrar as artérias cerebrais anteriores (ACA) na base dos lobos olfativos ( <strong&gt; A, Figura 1) e exercer pressão para dissociar-los a partir do vaso contínuo. Use o mesmo procedimento para cortar as artérias cerebral média (MCA) em b (Figura 1). </li><li> Use as pontas afiadas das pinças para levantar e remover as principais artérias que formam a vaca do córtex. </li><li> Levante-se o início das artérias comunicantes posteriores (PCA) para desligá-los a partir do cérebro, segurando nas artérias cerebrais médias (MCA) com a pinça. Pegar as artérias anteriores (ACA e MCA) e puxe-os delicadamente sobre o quiasma no sentido ântero-dorsal. Para evitar a interrupção da vaca, interromper o procedimento a lidar com as outras artérias. </li><li> Repita os passos 3.2.2 e 3.2.3 para as artérias cerebelar superior e posterior (SCA) / (APC) (C, figura 1) e para a artéria basilar (BA) (d, Figura 1), puxando-os em um dorso- direcção anterior. Parar no final do procedimento descrito In 3.2.4. </li><li> Remova toda a vaca puxando suavemente com a pinça. Coloque a vaca em um 60-mm placa de Petri com PBS gelado e remover qualquer tecido cerebral ligada restante com duas pinças, segurando a vaca no lugar com pequenos pinos. </li><li> Mantenha a vaca colhida a -80 ° C para posterior processamento para purificação de RNA (rendimentos de extração de RNA grandes quantidades de RNA - cerca de 500 ng) ou extração de proteínas. Nota: A vaca pode ser mantida ex vivo, durante 24 horas, através da adaptação do sistema de banho de órgãos desenvolvido para artéria olfativa isolado do rato 7. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama esquemático de um Ventral View of the Mouse Cérebro Destacando a vaca a vaca é formada a partir das duas artérias carótidas internas (MCA), que são derivadas das duas artérias cerebrais anteriores (ACA);. o basilararteriais (BA) ramifica na posterior (PCA) e superior (SCA) artérias cerebrais, e duas artérias vertebrais (VA).

<ol><li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Descrevemos aqui um protocolo reprodutível para o isolamento do círculo de Willis. As doenças cerebrovasculares mais comuns que envolvem a vaca são vasculopatias associadas à CAA, aterosclerose intracraniana e aneurisma intracraniano, todos os quais afectam as paredes dos vasos arteriais. Os fatores de risco são bem conhecidos, mas a patogênese molecular desses distúrbios cerebrais permanece mal compreendido e marcadores biológicos específicos para prever sua ocorrência faltam. Há um grande interesse em métodos para iso...

O círculo arterial cerebral (circulus arterial cerebral), também conhecido como o círculo de Willis (vaca), alça de Willisor Willis polígono) foi descrita pela primeira vez por Thomas Willis em 1664. É uma anastomose circulatório localizados ao redor do quiasma óptico e no hipotálamo que pode ser considerado como um hub central fornecimento de sangue para o cérebro e estruturas circundantes. Sangue entra esta estrutura através da carótida interna e artérias vertebrais e flui para fora do círculo através do meio interior e as artérias cerebrais posteriores. Cada um destes ramos tem artérias esquerda e direita de cada lado do circulo. O basilar, pós comunicação, e comunicante anterior artérias completa o círculo (Figura 1 e Figura 2). O risco de fluxo de sangue deficiente em qualquer das artérias de escoamento é minimizado pela fusão de sangue que entra no círculo da carótida e artérias cerebrais, garantindo assim que o sangue suficiente seja fornecido ao bchuva. Essa estrutura também serve como a principal via para o fluxo sanguíneo colateral em doenças oclusivas graves da artéria carótida interna. Vários tipos de doenças cerebrovasculares têm a sua origem na vaca. Os mais comuns são angiopatia amilóide cerebral (CAA) vasculopatias -associated, aterosclerose intracraniana e aneurismas intracranianos. 1, 2, 3 Esses distúrbios podem levar a hipoperfusão devido à vasodilatação e intracerebrais e / ou subaracnóidea hemorragias em última análise, traduzindo-se em acidente vascular cerebral isquêmico ou hemorrágico ou , na melhor das hipóteses, um ataque isquêmico transitório. Recentes avanços em procedimentos de diagnóstico, incluindo neuroimagem, possivelmente combinado com angiografia, tornaram possível para diagnosticar estas importantes doenças cerebrovasculares clinicamente, sem a necessidade de uma biópsia do cérebro. No entanto, os tratamentos eficazes e específicos (farmacológicas ou endovasculares) são actualmente não existe e não existe, portanto, uma necessidade de definir novosalvos moleculares. A identificação de novos alvos de drogas para a prevenção dessas doenças em seres humanos vai exigir modelos animais e modos de isolamento do cerebro-vascular incluindo a vaca. Tais modelos devem fornecer provas de e pistas para as mudanças específicas, incluindo alterações inflamatórias, que ocorrem nas paredes dos vasos grandes em modelos animais de aneurisma da artéria intracraniana, CAA ou aterosclerose intracraniana. 4, 5, 6 Nós estabelecemos um método para o isolamento do mouse vaca para facilitar os estudos de inflamação dos vasos na doença de Alzheimer (DA) e doenças relacionadas, tais como CAA. Este método para isolar a vaca rato foi desenvolvida para a avaliação da expressão do gene vascular cerebral durante a progressão da doença inflamatória. Juntamente com a detecção da deposição de amilóide beta dentro das paredes das artérias e leptomeníngeas piais, este método pode tornar mais fácil para dissuadirmina a possível relação entre a expressão do gene inflamatório na parede do cerebro-vascular e acumulação de Ap-péptido. A rede vascular do cérebro, incluindo o leptomeníngea e pial no espaço subaracnóide, é uma extensão das grandes artérias que formam o polígono de Willis. O método aqui descrito pode ser utilizado para isolar a vaca de qualquer linhagem do rato e poderia ser utilizado para todos os tipos de rastreio (por exemplo, a expressão do gene, a produção de proteínas e modificações pós-tradução de proteínas) sobre os grandes vasos do rato cerebro-vascular.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Fosfato Tampolado Salino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Fórceps</td><td>Ferramentas</td> de Ciência Fina <td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Íris Fina Endurecida&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura - Reta / Afiada / Afiada&nbsp; &nbsp; 16.5 cm</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7b Fórceps&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Zoom Estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Prato de Cultura de Superfície 60mm</td><td>Bomba Peristáltica Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>- MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para isolar o mouse círculo de willis

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

O círculo arterial cerebral (circulus arterial cerebral) ou círculo de Willis (vaca) é uma anastomose circulatório em torno do quiasma óptico e no hipotálamo que fornece sangue para o cérebro e estruturas adjacentes. Ele tem sido implicada em várias doenças cerebrovasculares, incluindo angiopatia amilóide cerebral (CAA) -associated vasculopatias, aterosclerose intracraniana e aneurismas intracranianos. Estudos de mecanismos moleculares subjacentes a estas doenças para a identificação de novos alvos de drogas para a sua prevenção requerem modelos animais. Alguns destes modelos podem ser transgénico, enquanto que outros envolvem o isolamento do cerebro-vascular, incluindo o método CoW.The aqui descrito é adequado para o isolamento de vaca em qualquer linhagem do rato e tem um potencial considerável para o rastreio (a expressão de genes, a produção de proteína, modificações pós-traducionais de proteínas, análise secretome, etc.) estudos sobre os grandes vasos do cerebrospinal do ratovasculatura. Ele também pode ser usado para estudos ex vivo, mediante a adaptação do sistema de banho do órgão desenvolvido para artérias rato isolados olfactivos.

<html> O mouse PBS-perfusão é morto ea vaca é isolada como descrito no ponto 3.2 do protocolo. Quando a dissecção é realizada corretamente, a vaca deve sair em uma parte e deve ser ligeiramente transparente, devido à ausência de sangue residual na vasculatura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jpg" /> Figura 2: A vaca mouse após o isolamento. (A) Resumo da vaca em ...

Descrevemos aqui um protocolo reproduzível para isolar o círculo de Willis do camundongo.

Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

O objetivo geral deste procedimento de dissecação é isolar o círculo de Willis murino para facilitar o estudo dos grandes vasos da cerebrovasculatura do camundongo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no estudo da expressão gênica cerebrovascular em diversas doenças que afetam os vasos cerebrais, como a doença de Alzheimer e a angiopatia amiloide cerebral. A principal vantagem desta técnica é que os grandes vasos podem ser isolados rapidamente e com facilidade, sem alterar a estrutura dos vasos.Inicie utilizando tesoura de íris para fazer uma incisão de quatro centímetros de comprimento na parede abdominal e no peritônio de um camundongo letalmente anestesiado logo abaixo da caixa torácica. Em seguida, faça uma incisão de alguns milímetros de comprimento no diafragma, continuando a incisão ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Levante o esterno e prenda a ponta com uma pinça hemostática, apoiando a pinça no pescoço.Em seguida, remova cuidadosamente o tecido adiposo que conecta o esterno ao coração. Agora, introduza uma agulha de perfusão de 15 gauge pelo ventrículo esquerdo até o ápice do coração e use uma tesoura para cortar um dos lobos do fígado, criando uma saída para o perfusato. Perfunda o animal com 25 a 50 mililitros de PBS a uma velocidade de bomba de 2,5 mililitros por minuto durante cerca de dez minutos.O fígado deve ficar pálido conforme o sangue é substituído pelo PBS. Quando o fluido proveniente do fígado estiver completamente claro, interrompa a perfusão. Para isolar o cérebro, use tesoura de íris para fazer uma incisão mediana ao longo da pele, do pescoço até o nariz.Retire a pele com a tesoura de íris para expor o crânio e remover qualquer tecido muscular e adiposo residual. Em seguida, posicione as pontas da tesoura de íris em um dos lados do forame magno e deslize cuidadosamente as pontas ao longo da superfície interna do crânio até o meato acústico externo. Faça uma incisão semelhante no outro lado do forame magno, seguida por um corte mediano ao longo da superfície interna do osso interparietal até o início da sutura sagital.Posicione a tesoura de Iris fechada no osso frontal entre os olhos, ao longo da sutura sagital, e abra as lâminas para dividir o crânio ao meio. Com uma pinça, segure os bulbos olfativos e use a tesoura de Iris para cortar as conexões nervosas na superfície ventral do cérebro. Em seguida, mergulhe o cérebro em uma placa de Petri de 60 milímetros contendo PBS gelado.Para isolar o círculo de Willis, transfira a placa para um pacote de gelo sob um microscópio estereoscópico e vire o cérebro com a superfície dorsal voltada para cima para visualizar o círculo de Willis. Use a pinça pequena para segurar as artérias cerebrais anteriores na base dos lobos olfativos e exerça pressão para dissociar as artérias do contínuo vascular. Corte as artérias cerebrais médias da mesma maneira.Em seguida, use as pontas afiadas da pinça para segurar as artérias cerebrais médias e levantar o início das artérias comunicantes posteriores, desconectando ambos os conjuntos de artérias do cérebro. Depois, levante as artérias anteriores, puxando-as suavemente sobre o quiasma óptico em direção anterior dorsal. Remova as artérias cerebelares superiores e posteriores da mesma forma, seguido do deslocamento da artéria basilar.Por fim, use a pin&ccedil;a para transferir suavemente todo o c&iacute;rculo de Willis para uma placa de Petri de 60 mil&iacute;metros contendo PBS gelado, e fixe os vasos no lugar com pinos pequenos, utilizando duas pin&ccedil;as para remover cuidadosamente qualquer tecido cerebral remanescente. O c&iacute;rculo de Willis deve sair inteiro e deve ser ligeiramente transparente devido &agrave; aus&ecirc;ncia de sangue residual na vasculatura. O c&iacute;rculo de Willis limpo deve expressar especificamente marcadores de c&eacute;lulas musculares lisas vasculares, como Actina da M&uacute;sculo Liso, Cadeia Pesada da Miosina do M&uacute;sculo Liso e Smoothelin.Os marcadores neuronais, como a glicoproteína oligodendrocítica da mielina ou a proteína 2 associada aos microtúbulos, por outro lado, devem ser apenas levemente detectáveis no círculo de Willis. Além disso, a expressão do marcador endotelial, E-Selectina, em tecido neural fora do círculo de Willis, é muito semelhante à obtida para amostras do círculo de Willis, o que possivelmente reflete a existência de uma rede de capilares cerebrais. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em duas horas, se realizada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os vasos cerebrais de camundongo são muito finos e se rompem facilmente. Assim, a dissecação deve ser conduzida com grande cuidado, sem pressa, para garantir que toda a estrutura seja coletada em uma única peça. Após seu desenvolvimento, esta técnica abre caminho para pesquisadores na área de doenças neurológicas inflamatórias explorarem distúrbios vasculares cerebrais em modelos murinos de Alzheimer e doenças relacionadas, como a angiopatia amiloide cerebral.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar o círculo de Willis de um camundongo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo demonstra o procedimento de isolamento de células imunes dos plexos coróides de camundongos. Este procedimento é usado na pesquisa de neuroimunologia para entender como as células imunes nos plexos coróides afetam a saúde do cérebro e várias doenças neurológicas.

Isolando células imunes de plexos coróides de camundongos

Nós introduzimos um método cirúrgico para induzir experimental de isquemia / reperfusão (I / R) prejuízo para simular o infarto do miocárdio (MI) em modelos de mouse que permite uma maior clareza no posicionamento da ligadura na artéria descendente anterior esquerda (LAD) para aumentar a reprodutibilidade de experimentos MI em camundongos.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

A inflamação desempenha um papel central na patogênese do AVC isquêmico. Evidências crescentes sugerem que ele atua como uma faca de dois gumes que exacerba a lesão cerebral precoce, mas também contribui para o reparo posterior. Este protocolo descreve o isolamento de células imunes do cérebro isquêmico e sua subsequente fenotipagem citométrica de fluxo.

Isolamento e análise de citometria de fluxo de células imunes do cérebro isquêmico Rato

O objectivo deste protocolo é demonstrar as técnicas de isolamento e cultivo de células musculares murino primários liso vascular (VSMC) da circulação coronária. Uma vez que as VSMCs foram isolados, eles podem ser usados ​​para várias técnicas de cultura convencionais.

Isolamento de Murino vasculares coronários células musculares lisas

É descrito um procedimento para preparar preparações en face da artéria carótida e da aorta do rato. Tais preparações, quando imunofluorescentemente coradas com anticorpos específicos, permitem estudar a localização de proteínas e a identificação de tipos de células dentro de toda a parede vascular por microscopia confocal.

En Face Preparação de Vasos Sanguíneos de Rato

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

O padrão-ouro em cardiologia para experimentos funcionais celulares e moleculares são os cardiomiócitos. Este artigo descreve adaptações à técnica não-Langendorff para isolar cardiomiócitos de camundongos.

Um Método Simples e Eficaz para Isolar Consistentemente Cardiomiócitos de Camundongos

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Este artigo descreve um método para isolamento baseado em esferas magnéticas de células endoteliais murinas de capilares linfáticos dérmicos. As células endoteliais linfáticas isoladas podem ser usadas para experimentos in vitro a jusante e análise de expressão de proteínas.

Isolamento de células endoteliais linfáticas dérmicas murinas

Aprenda a isolar o círculo de Willis de camundongos para estudar a cerebrovasculatura em modelos murinos. Este protocolo permite obter vasos grandes intactos para pesquisas em neurociência e doenças cerebrovasculares como o Alzheimer.

Protocolo para isolar o mouse Círculo de Willis

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