Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de co-cultura celular de dois tipos de células usando inserções com membrana permeável, permitindo assim a difusão de fatores solúveis secretados. Isso é feito com uma série de etapas que colocam inserções finamente contendo um tipo de célula em uma placa de cultura de tecidos com vários poços contendo um segundo tipo de célula. Começamos minha semeadura do tipo de célula número um em inserções e a semeadura do tipo de célula número dois em uma placa de cultura de tecidos de vários poços.

O segundo passo é transferir as inserções para os poços da placa que contém o tipo de célula número dois. Em última análise, isso dá a capacidade de colher os dois tipos de células, bem como os respectivos sobrenadantes. Portanto, é possível avaliar o efeito dos fatores solúveis secretados sobre o tipo de célula de interesse.

Em organismos multicelulares, os fatores solúveis secretados provocam respostas de diferentes tipos de células como resultado da sinalização parácrina. Como tal, o valor de um sistema de co-cultura de inserção reside em sua capacidade de oferecer uma maneira original de avaliar as mudanças de parâmetros celulares mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula. Os sistemas de cocultura de inserção oferecem várias vantagens sobre outras técnicas de cocultura, como: uma por sinalização direcional; duas polaridades celulares conservadas; e três detecção de alterações celulares específicas da população.

Um protocolo específico para medir os efeitos tóxicos da citocina secretada pela microglia N9 ativada por lipopolissacarídeo em células neuronais PC12 será detalhado a seguir, fornecendo assim uma compreensão concreta da metodologia de co-cultura de inserção. Para começar, desembrulhe a placa de cultura de tecidos de 24 poços e as inserções de politetrafluoretileno de 0,4 mícron de sua embalagem. Em seguida, coloque as inserções nos poços vazios da placa de cultura de tecidos, segurando a borda superior da inserção usando uma pinça estéril.

Em seguida, preencha as inserções com meio N9 de rotina até que a membrana esteja completamente coberta. Incube as inserções por pelo menos uma hora, ou durante a noite, para melhorar a capacidade das células de se fixarem. Assim que as inserções estiverem prontas, divida a microglia N9 em 80 a 90% de confluência usando meio N9 de rotina para obter uma suspensão celular que será usada para semear as inserções.

Em seguida, remova o meio de rotina das inserções, tomando cuidado para não perfurar a membrana com a ponta da micropipeta. Em seguida, semeie cada inserto a 60.000 células por centímetro quadrado com 50 microlitros da suspensão celular, ou de acordo com o protocolo do fabricante do inserto. Ao distribuir a suspensão celular, certifique-se de que ela permaneça homogênea, invertendo ocasionalmente o tubo.

Quando todas as inserções estiverem semeadas, balance suavemente a placa para frente e para trás, depois da esquerda para a direita, a fim de distribuir as células uniformemente. Evite fazer movimentos circulares, pois isso fará com que as células se acumulem no centro da inserção. Em seguida, incubar a placa contendo as inserções por 24 horas antes de prosseguir com a ativação da microglia N9.

Comece pesando 10 miligramas de lipopolissacarídeo e armazene-o em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro para uso posterior. Como o lipopolissacarídeo é uma potente endotoxina pró-inflamatória e requer precauções de segurança especiais, óculos, luvas e um respirador de partículas são fortemente recomendados. Em seguida, crie um conjunto de diluições seriadas de lipopolissacarídeo usando meio de tratamento N9 quente para obter soluções de trabalho de quatro, dois e um microgramas por mililitro.

Por fim, remova metade do meio de cultura das inserções, tomando cuidado para não perturbar as células. Em seguida, adicione suavemente 25 microlitros das soluções de trabalho de lipopolissacarídeo às inserções para obter diluições finais de dois, um ou 0,5 microgramas por mililitro. Incubar a placa por mais 24 horas antes de prosseguir com os experimentos de co-cultura.

Esta etapa requer células PC12 plaqueadas em 30.000 células por centímetro quadrado interneurônios diferenciados e microglia N9 ativada com lipopolissacarídeo por 24 horas, conforme descrito na seção anterior. Comece removendo suavemente todo o meio das inserções e substituindo-o por 50 microlitros de meio de tratamento N9 fresco e quente. Isso é necessário para remover todos os vestígios de lipopolissacarídeo, deixando apenas a microglia N9 ativada.

Lembre-se de que as inserções estão soltas nos poços da placa de cultura de tecidos e podem se mover se a ponta for pressionada com muita força na parede. Esta etapa deve ser executada uma inserção de cada vez para evitar que as células sequem devido ao contato prolongado com o ar. Em seguida, remova completamente o meio celular neuronal PC12 e substitua-o por 0,6 mililitros de meio de tratamento PC12 fresco e quente.

Faça isso bem de cada vez para garantir que as células não sequem. Usando uma pinça, segure a borda superior de uma inserção e coloque-a suavemente no poço que contém células neuronais PC12. Quando todas as inserções forem transferidas, verifique a presença de bolhas de ar sob as membranas das inserções.

Bolhas de ar impedirão qualquer troca através da membrana do inserto e podem comprometer todo o experimento. Remova todas as bolhas de ar levantando suavemente a inserção do poço usando uma pinça e colocando-a de volta no meio de cultura de células, esta ação deve eliminar a maioria das bolhas. No entanto, para bolhas persistentes, tente mergulhar suavemente o inserto de volta no meio de cultura de células em um ângulo.

Não bata ou mexa as inserções, pois isso tende a causar a dissociação das células aderentes. Em seguida, verifique os volumes de mídia nos insertos e nos poços, o líquido em ambos os compartimentos deve estar aproximadamente no mesmo nível. Quando todas as bolhas de ar forem removidas e os volumes de mídia forem apropriados, incube a placa.

As células, o meio de cultura ou ambos podem então ser colhidos para medir os efeitos da sinalização parácrina entre a microglia N9 e as células neuronais PC12. Ensaios imunoenzimáticos foram realizados no meio de cultura celular do compartimento inferior para quantificar citocinas pró-inflamatórias. Os resultados ilustram que, 24 horas após o período de ativação, a microglia N9 tratada com dois microgramas por mililitro de lipopolissacarídeo secretou significativamente mais citocinas pró-inflamatórias, como interluken-6, fator de necrose tumoral-alfa e interferon gama, em comparação com microglia que não foram tratadas.

Além disso, a microglia N9 tratada com um micrograma por mililitro de lipopolissacarídeo secretou mais interferon gama após 24 horas, enquanto levou 48 horas para ver um aumento significativo nos níveis médios celulares de interlucen-6 e fator de necrose tumoral alfa. Em contraste, a condição de 0,5 micrograma por mililitro não conseguiu aumentar a expressão de citocinas na microglia N9 24 e 48 horas após o período de ativação. Além disso, os dados em 24 horas no grupo de dois microgramas por mililitro sugerem que houve microgliose, um aumento na população microglial.

No entanto, foi somente após 48 horas que o número de celulares aumentou significativamente. Finalmente, a fim de avaliar as consequências da ativação microglial levando ao aumento da secreção de citocinas e microgliosos, a citotoxicidade foi avaliada nas células PC12 neuronais co-cultivadas. Ao medir os níveis de lactato desidrogenase extracelular, que é liberada por células danificadas, descobriu-se que as células neuronais PC12 exibem mais morte celular à medida que a concentração de lipopolissacarídeo nas células N9 aumenta.

Como tal, esses resultados mostram que os fatores solúveis secretados são capazes de atravessar a membrana das pastilhas de co-cultura e podem causar danos citotóxicos às células neuronais PC12 na ausência de contato célula-célula. Embora apenas um cenário de co-cultura de inserção tenha sido apresentado aqui, é uma técnica muito flexível. Neste protocolo, um tipo de célula foi pré-tratado com a molécula responsável por reduzir a secreção de fatores solúveis que, ao transferir o inserto para o poço, afetam o comportamento do segundo tipo de célula.

No entanto, é possível incubar os dois tipos de células juntos em um sistema de co-cultura para detectar o aumento da fraqueza ou resistência de uma ou ambas as populações de células a um tratamento posterior. Esta técnica pode simplesmente fazer uso de duas populações de células incubadas juntas sem qualquer tratamento, para avaliar a sinalização recíproca parácrina basal, por exemplo. Além de serem valorizados no campo da neuroinflamação, conforme demonstrado aqui, os sistemas de co-cultura de inserção podem ser usados para responder a uma vasta gama de perguntas relativas à regênese tumoral, neurolatirisma, sinalização de apoptose ou qualquer outro tópico com um componente de sinalização parácrina.

Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma boa compreensão de como os sistemas de co-cultura de inserção podem oferecer uma maneira simples de avaliar as mudanças mediadas pelo fator solúvel secretado. E esperamos tê-lo convencido do alto potencial deste sistema de co-cultura inserido no estudo da sinalização parácrina multicelular na ausência de contato célula-célula.