Name: Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a criar um sistema de co-cultura celular usando inserts com membrana permeável para estudar sinalização parácrina. Este método permite avaliar os efeitos de fatores solúveis secretados sem contato célula-célula.

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Este trabalho foi financiado por uma doação do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá para a MGM. JR é um bolsista NSERC-Vanier.

Nota: Cada um dos seguintes passos devem ser realizados sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar, conforme necessário para a cultura de células de mamífero. Além disso, as orientações gerais para a cultura de células estéril optimizada aplica-se, por exemplo., Descartando dicas qualquer momento que eles podem levar à contaminação cruzada, reduzindo a quantidade de células de tempo são expostos ao ar ao realizar mudanças de suporte inteiras, adequadamente, mas que se agitava suavemente todos suspensões de células para garantir a sua pipetagem homogênea, etc. Além disso, as inserções são uma espécie de plasticware que requerem um tratamento especial. Em primeiro lugar, sempre que as inserções são manipulados, evite tocar a membrana frágil, que rasga facilmente e poderia, portanto, comprometer o experimento. Além disso, não é adequado para realizar a aspiração de vácuo do meio de cultura celular, como existe o risco de perfurar a membrana ou dissociar células aderentes. Em seguida, insere pendurado na placa de cultura de tecido de poços múltiplos e, assim, cuidado deve ser empregue quando MODEIXANDO O utensílios de plástico ou ao pipetar para evitar a dissociação de células aderentes. Além disso, quando utilizando inserções com tamanhos de poros grandes, há uma possibilidade de que o meio de cultura de células se infiltra através da membrana e, por conseguinte, é importante para monitorizar frequentemente o nível de líquido. Finalmente, note que o seguinte protocolo é concebido para células aderentes e requer pequenas modificações, a fim de ser adequado para as células em suspensão. 1. As orientações gerais para a realização de inserção experiências de co-cultura <ol><li> Sementeira tipo de célula # 1 em inserções <ol><li> Desembrulhar as inserções da sua embalagem. </li><li> Coloque as inserções em uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos vazios de dimensão adequada. Para fazê-lo, prender a borda superior da inserção utilizando pinças. </li><li> Para melhorar o anexo e disseminação de células aderentes, condicionar as inserções com meio de cultura de células antes da semeadura. Para fazer isso, cobrir toda a superfície da membrana de cultura de células com medium utilizando uma micropipeta. NOTA: Faça isto para o maior número de inserções, conforme necessário. </li><li> Substituir a tampa da placa e incubar durante pelo menos 1 hora ou O / N sob as mesmas condições (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO 2). </li><li> Quando as inserções são condicionadas, remover todo o meio de cultura de células utilizando uma micropipeta. Descartar o meio utilizado. </li><li> Tipo de Semente célula # 1 em meio de cultura celular fresco da mesma maneira como em uma placa com múltiplas cavidades. Para fazê-lo, desenhar um volume apropriado da suspensão de células com uma micropipeta e distribuir o líquido no inserto. NOTA: Prepare o maior número de inserções, conforme necessário. </li><li> Após semear todas as inserções, agite levemente a placa de esquerda e direita, em seguida, frente e para trás, a fim de distribuir as células uniformemente. Evitar fazer movimentos circulares, como isso vai fazer com que as células que se acumulam no centro das inserções. </li><li> Colocar a tampa sobre a placa e incubar, tal como especificado por como por exigências celulares (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO <sub&gt; 2). </li></ol></li><li> Sementeira tipo de célula # 2 em placas de cultura de tecidos com vários poços <ol><li> tipo de célula semente # 2 em meio de cultura de células frescas de acordo com a Seção 1. </li><li> Preparar de muitos poços como necessário para o número de inserções. Balance a placa como no passo 1.1.7) para assegurar que as células estão uniformemente distribuídas nos poços. </li><li> Colocar a tampa sobre a placa e incubar sob as mesmas condições (normalmente 37 ° C, 5-10% de CO 2). </li></ol></li><li> meio refrescante na inserções <ol><li> Usando uma micropipeta, remover parte ou a totalidade do meio de cultura celular, em que contêm as inserções tipo de célula # 1. Descartar o meio utilizado. </li><li> Desenhar um volume apropriado de meio de cultura de células fresco. Suavemente descansar a ponta sobre a parede interna da inserção e lentamente dispensar o meio de cultura celular. </li><li> Colocar a tampa sobre a placa e incuba-se de acordo com o passo 1.1.4. </li></ol></li><li> meio refrescante em placas de cultura de tecidos com vários poços <ol><li> Usando um micropipette, remover parte ou a totalidade do meio de cultura de células nos poços contendo tipo de célula # 2. Descartar o meio utilizado. </li><li> Desenhar um volume apropriado de meio de cultura de células fresco. Colocar a ponta na parede interior do poço e lentamente dispensar o meio de cultura celular. </li><li> Colocar a tampa sobre a placa e incuba-se de acordo com protocolos de cultura de células previamente estabelecidos. </li></ol></li><li> Transferência de inserções contendo tipo de célula # 1 a placas de cultura de tecidos de múltiplos poços contendo tipo de célula # 2. NOTA: Execute esta etapa, quando ambos os tipos de células atingiram a fase de crescimento adequado. <ol><li> Antes de transferir os insertos em poços, fazer quaisquer alterações médias necessárias, como anteriormente descrito nas etapas 1.3 e 1.4)). NOTA: Neste ponto, é importante para dispensar os volumes apropriados de meios de comunicação em ambos os compartimentos, tal como especificado por instruções do fabricante da pastilha. </li><li> Com uma pinça, segure a extremidade superior de uma inserção contendo células TYpê # 1 e gentilmente colocá-lo no apropriado poço contendo tipo de célula 2 #. </li><li> Depois de transferir todas as inserções, verificar a presença de bolhas de ar abaixo da membrana de inserções. NOTA: As bolhas de ar evitar um intercâmbio entre a membrana da peça inserta e pode pôr em perigo todo o experimento. </li><li> Se bolhas de ar estão presentes, muito delicadamente levantar a inserção do poço usando uma pinça e mergulhar de volta para o meio de cultura celular. As bolhas vão desaparecer. Se eles ainda estão presentes, tente suavemente mergulhando pastilhas de volta para o meio de cultura de células em um ângulo. NOTA: Não bata ou mexa inserções para evitar dissociar as células aderentes. </li><li> Depois de remover todas as bolhas de ar e a verificação de que os volumes de meios de comunicação em ambos os compartimentos, coloque a tampa sobre a placa e incubar. </li></ol></li><li> media refrescantes em um sistema de co-cultura NOTA: Embora a membrana permite fácil troca de mídia entre inserção e bem, refrescando o meio é feito emambos os compartimentos desde o tempo necessário para atingir o equilíbrio nos compartimentos superior e inferior por difusão por si só pode ser bastante longo. <ol><li> meio refrescante em pastilhas contendo tipo de célula # 1 é feito da mesma maneira como no passo 1.3). </li><li> Para atualizar meio em poços contendo tipo de célula # 2, deslize suavemente a inserção para o lado para criar um espaço grande o suficiente para acomodar uma ponteira. Refrescar o meio como no passo 1.4). </li><li> Verificar a presença de bolhas de ar e verificar os volumes como por etapas 1.5.3), através 1.5.5). </li></ol></li></ol> 2. Exemplo: medir os efeitos das citocinas secretadas pela microglia N9 LPS-ativados nas células neuronais PC12 NOTA: Os passos seguintes são projetados para balão específico, bem e tamanhos de prato. No entanto, o protocolo pode ser personalizado para quaisquer dimensões plasticware. Para a mídia e composição ver Tabela Materiais. <ol><li> Semeadura e diferenciação de células PC12 em múltiplosse placas de cultura de tecidos <ol><li> meio de cultura de células PC12 rotina de aquecimento, a diferenciação de PC12 e meio tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Use células PC12 a 60-80% de confluência de um balão de 2 75 centímetros. </li><li> Com uma pipeta de Pasteur a 15 mm, realizar a aspiração de vácuo de todo o meio de cultura celular no balão. </li><li> Lave a monocamada de células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril e remover o líquido com uma pipeta de Pasteur. Tenha cuidado para não dissociar as células nesta etapa. </li><li> Cobrir a monocamada de células com 3 ml de tripsina-EDTA e incubar durante 2-3 min a 37 ° C. </li><li> Certifique-se de que todas as células são separadas sob um microscópio. Se muito poucas células estão flutuando, incubar por um período mais longo para um máximo de 5 min. </li><li> Adicionam-se 10 ml de meio de cultura de células PC12 de rotina, a fim de inactivar a tripsina-EDTA. </li><li> Com uma pipeta de 10 ml, triturar suavemente ao se certificar de que a maioria das células são dissociadas do fundo of o balão. Evitar a criação de bolhas de ar na suspensão de células. </li><li> Com a mesma 10 ml de pipeta, transferir a suspensão celular num tubo de centrifugação de 50 ml. </li><li> Centrifugar por 1 min a 3.200 xg </li><li> Descartar o sobrenadante com uma pipeta Pasteur, tendo o cuidado para não perturbar o sedimento. </li><li> Adicionam-se 10 ml de meio de cultura de células PC12 rotina com uma pipeta de 10 mL. NOTA: Este volume pode ser ajustado se o pellet é extraordinariamente pequeno ou grande. </li><li> Tritura-se com a mesma pipeta de 10 ml para homogeneizar o sedimento. As células PC12, muitas vezes se aglutinarem assim, pelo menos 20 pipetando para cima e downare necessário. NOTA: Enquanto trituração vigorosa é necessário, evitar a criação de bolhas de ar na suspensão de células. </li><li> Em um tubo de 1,5 ml, preparação de uma diluição apropriada da suspensão de células em azul de tripano. Contar as células utilizando um hemocitómetro de acordo com protocolos previamente estabelecidos 74. </li><li> Num tubo separado de 50 ml, dividir a suspensão de célulascom meio de diferenciação de PC12 para se obter uma suspensão de células diluída apropriada para semear poços de uma placa de 24 poços (30000 ¢ / cm2, 0,6 ml por poço de acordo com o protocolo do fabricante). NOTA: A placa de 24 poços devem ser previamente revestida com colagénio tal como especificado por protocolos previamente estabelecidos 75. </li><li> Distribuir 0,6 ml da suspensão de células por poço usando uma micropipeta. </li><li> Quando todos os poços são semeadas, balance a placa como no passo 1.1.7). </li><li> Para permitir a diferenciação de células PC12 adequada, incubar as placas de 24 poços durante 7-9 dias a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% húmida em meio de diferenciação de PC12 15,16 antes de realizar as experiências de co-cultura. </li><li> Realizar as mudanças de meio a cada dois dias, removendo metade do líquido e substituindo-o com um volume igual de meio de diferenciação de PC12 fresco. </li></ol></li><li> Sementeira microglia N9 nas inserções e tratamento com LPS <ol><li> Um dia antes de realizar os experimentos de co-cultura, pré-tratamento de PTFE de 0,4 mm inserções de poros com meio de cultura celular N9 rotina para otimizar a adesão celular, seguindo os passos 1.1.1), através 1.1.4) </li><li> meio quente N9 rotina de cultura de células e de tripsina-EDTA em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Entretanto, pesar aproximadamente 10 mg de LPS em um tubo de 1,5 ml para uso posterior. NOTA: Desde LPS é um potente endotoxina pró-inflamatório e exige precauções especiais de segurança, óculos, luvas, e um respirador particulado são fortemente recomendados. </li><li> Use células N9 a 80-90% de confluência de um balão de 2 75 centímetros. </li><li> Siga os passos 2.1.3) para 2.1.14). Sempre use meio de cultura celular N9 rotina em vez de meio de cultura de células PC12 rotina. Observe também que microglia N9 não se agregam tanto quanto células PC12 fazer, então menos pipetagem cima e para baixo pode ser necessário no passo 2.1.13). </li><li> Num tubo separado de 50 ml, dividir a suspensão de células com meio de cultura de células para o N9btain uma suspensão diluída de células apropriada para semear inserções destinadas a reter em placas de 24 poços (60.000 ¢ / cm 2, 0,05 ml por inserção de acordo com o protocolo do fabricante, para a área de superfície da membrana ver informação do fabricante). Nota: Estas inserções já são revestidos com colagénio pelo fabricante e são otimizados para adesão celular. </li><li> Distribuir 0,05 ml da suspensão de células por pastilha utilizando uma micropipeta. </li><li> Quando todas as inserções são semeadas, balance a placa como no passo 1.1.7). </li><li> Efectuar diluições em série de LPS com o meio de tratamento para obter N9 4 ug / mL, 2 ug / ml e 1 ug / ml de soluções de trabalho. </li><li> Pipetar 0,05 ml do / ml Solução de trabalho de 4 ug de um conjunto de inserções, a fim de se obter uma diluição final de 2 ug / ml. </li><li> Repetir o passo 2.2.10) para as outras duas soluções de trabalho em diferentes conjuntos de inserções, obtendo-se diluições finais de 1 ug / mL e 0,5 ug / ml, respectivamente. </li><li> DentroCubate as placas contendo as inserções de 24 h a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% de humidade para permitir a activação da microglia N9 com LPS antes de realizar as experiências de co-cultura. </li></ol></li><li> Co-cultura de células neuronais PC12 com microglia N9 <ol><li> Em 7-9 dias de diferenciação de células PC12, ativar as microglia N9 Após 24 horas de incubação com LPS por meio de tratamento N9 quente e meio de tratamento PC12 em um banho de água a 37 ° C. </li><li> Realizar uma mudança médio total para microglia N9 como no passo 1.3), a substituição de todo o meio utilizado por 0,1 ml de meio de tratamento N9. Faça isso para cada insert.This é necessário remover todos os vestígios de LPS, deixando microglia N9 única ativadas nas inserções. </li><li> Realizar uma mudança médio total para células PC12 neuronais como no passo 1.4). Transferir os insertos em placas de 24 poços como no passo 1.5) .Incubate o N9-PC12 co-culturas durante 24 h ou 48 h a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5% de humidade. </li><li> Depois de 24h ou 48 h, a colheita do sobrenadante e / ou as células quanto à citotoxicidade, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), transferência de Western ou outros ensaios. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O passo mais crítico de toda a experiência do sistema de co-cultura inserção realmente habita em escolher a inserção correta de usar. O tamanho dos poros e material de membrana tem de ser tida em conta completa, sem deixar de considerar o tipo de células que irão ser semeadas e o objectivo da experiência. Por exemplo, ensaios de quimiotaxia podem utilizar o mesmo tipo de membrana de co-culturas de células para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência de contacto cél...

O estudo de tecidos, órgãos ou sistemas in vitro é uma tentativa para simplificar os relacionamentos existentes muito complexas entre os vários subtipos celulares que compreendem organismos multicelulares. De facto, estudos in vitro tornam possível adquirir uma compreensão detalhada das populações de células individuais. Existem duas grandes vantagens da realização de experiências in vitro: 1) reduzidas interacções celulares, e 2) a capacidade de manipular facilmente o ambiente celular. Cientistas Assim, estas duas vantagens permitiram prever o comportamento de tipos específicos de células in vivo, levando a capacidade para regular os resultados de influências extrínsecos em organismos inteiros. Nesse sentido, em cultura de células in vitro muitas vezes funciona como uma ponte de ligação entre ciências básicas e aplicadas de vida. No entanto, também existem várias desvantagens de se trabalhar in vitro, o mais importante sendo que uma certa reserva pode habitar na fisiológicoal relevância dos fenótipos observados. Com efeito, quando um único tipo de célula é cultivada num vaso, a cultura perde, em graus diversos,, as suas ligações célula-célula com outros tipos de células, a sua contribuição para o ambiente humoral a partir do tecido e organismo de origem, e as âncoras dentro o tecido que lhe permitiu manter uma estrutura tridimensional em particular, por vezes crucial para a função da célula. A questão da relação célula-célula foi abordada pelo desenvolvimento de técnicas de cultura mista. Neste método, duas ou mais populações de células são cultivadas em conjunto no mesmo vaso de cultura. No entanto, estas culturas mistas suportar inconvenientes importantes. Por um lado, alguns subtipos de células não interagem fisicamente com o outro no tecido de origem e depender unicamente das comunicações parácrinos sustentadas por fatores solúveis secretados e receptores nas proximidades. Este é o caso de vários processos inflamatórios que dependem da sinalização de citocina proximal. Em c mistaultures, interações físicas são inevitáveis ​​e torná-lo impossível estudar comunicações parácrinos na ausência de contatos célula-célula que podem produzir resultados alterados. Por outro lado, a realização interpretações específicos de células a partir de uma população mista torna-se inviável sem o uso de técnicas de separação duras que poderiam afectar de forma significativa os resultados. Para resolver estes problemas importantes, a utilização de meios condicionados foi desenvolvido como uma técnica que permite culturas compartimentadas e o estudo da sinalização parácrina. Este método exige a transferência do sobrenadante de um tipo de células, o meio condicionado assim nomeados, às cavidades contendo outra população de células. No entanto, uma desvantagem importante é que as moléculas de vida curta não sobreviver o tempo suficiente no meio condicionado para ser transferida para os poços da segunda população de células. Mesmo moléculas de longa vida será muito diluídas ao longo do tempo devido à difusão. Além disso, tanto celularpopulações só participam na comunicação parácrina unidirecional e não em comunicação bidirecional ativa. Isto conduz à ausência de sinalização de feedback que é vital para recriar relações precisas multicelulares como elas existem in vivo. Em consequência e motivado pela necessidade para melhor simular o original em condições in vivo no ambiente celular in vitro, a vários avanços nas técnicas de cultura de células foram obtidos ao longo dos anos. Um dos avanços mais significativos foi o uso de suportes permeáveis ​​com membranas microporosas para compartimentar culturas de células, utilizadas pela primeira vez por Grobstein em 1953 um. Tais suportes permeáveis ​​foram adaptados ao longo dos anos para acomodar vários tipos de células e para ser utilizada em várias aplicações diferentes. Hoje em dia, estes suportes existem inserções como ocos que são destinadas para descansar em poços de uma placa de cultura de tecido de poços múltiplos ou em circupratos Lar. Em um sistema de co-cultura, a inserção contém um tipo de célula ao passo que o poço ou prato contém a outra população celular, permitindo estudar a contribuição de duas populações diferentes de células no seu meio ambiente humoral (Figura 1). Como resultado, a polaridade celular (basolateral vs secreção apical ou a recepção do sinal) é preservada, conferindo, assim, sistemas de co-cultura inserir uma vantagem importante sobre as culturas mistas e técnicas de meio condicionado. Vários tipos de materiais de membrana estão disponíveis, as mais comuns sendo de poliéster (PET), policarbonato (PC) ou revestidos com colagénio de politetrafluoretileno (PTFE), e existem em diferentes tamanhos de poros variando de 0,4 um a 12,0 um. Estas variedades de materiais e tamanhos de poros oferecer um espectro de inserções exercendo características variáveis ​​relevantes para propriedades ópticas, a espessura da membrana e adesão celular que tornam prático a níveis diferentes para as seguintes utilizações não limitados a: -estudandoa diferenciação celular, o desenvolvimento embrionário, a metástase tumoral e reparação de feridas por ensaios de quimiotaxia através de membranas permeáveis; -evaluating penetração da droga, avaliando o seu transporte através de monocamadas epiteliais ou endoteliais cultivadas em suportes permeáveis, e; -performing celulares co-culturas para analisar modulações comportamento celular induzida por factores solúveis segregadas na ausência de contacto célula-célula. O objetivo deste artigo é descrever orientações metodológicas gerais para cumprir a terceira função dito acima, que é o de avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula usando um sistema de co-cultura de inserção. Vários campos diferentes de pesquisa fazem uso de sistemas de co-cultura de inserção, a fim de responder a questões relevantes para o efeito de fatores solúveis secretados em populações de células. Com efeito, a sinalização parácrina que modula o comportamento celular em vários níveis é pertinente em todos os tecidose dos sistemas, o que torna os sistemas de co-cultura de inserção indispensável para garantir avanços nestes domínios. Por outro lado, a utilização de inserções pode confirmar que a transdução de sinal é por contacto directo célula a célula e não por factores segregados. Uma das utilizações mais importantes de inserções é em estudos de inflamação 2-14, onde o efeito de citocinas secretadas é avaliada em vários agentes celulares de imunidade. Em particular, o estudo da inflamação no sistema nervoso central (SNC) tem muito lucraram com estudos co-cultura de inserção, que têm permissão para definir melhor os papéis parácrinos distintos de neurônios e microglia na condução neuroinflamação 15-21. Estes sistemas também foram concebidos para estudar o potencial anti-inflamatório de moléculas que se baseia na sua capacidade de reduzir ou inibir a secreção de factores pró-inflamatórias 22-26. Investigação referentes ao câncer de 27-31, em particular os mecanismos subjacentes a angiogênese 32-34 e inflammatiem 35-42 na tumorigênese, também se beneficia de sistemas de co-cultura de inserção. Além disso, fatores solúveis são de primordial importância nos processos que impulsionam diferenciação e vários estudos têm usado as inserções para responder às perguntas em que determinado campo de 43-50. No SNC, visto que o tecido neural tem um potencial de renovação muito limitado, o estudo de neurotrophism e neuroprotecção é fundamental e tem sido amplamente assegurada pela utilização de células estaminais em sistemas de co-cultura de 51-56. Além disso, inserções também são utilizados em diversos campos como a nefrologia 57,58, interacções endoteliais e angiogênese 59-62, apoptose sinalização 63-65, inflamação na obesidade e síndrome metabólica 22,23,66-67, ouvido interno protecção das células ciliadas 68,69, e até mesmo em fungos virulência 70,71 e parasitologia 72,73. Este artigo oferece orientações metodológicas gerais, a fim de criar um experiment, tendo em vista avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados usando um sistema de co-cultura de inserção. Em particular, vamos concentrar a nossa atenção em co-culturas de células nervosas e seus usos em estudar processo neuroinflamatória. Dada a muito vasto espectro de experiências que insere tornar possível piloto, é insuportável para cobrir todos os aspectos desta técnica de cultura de células. Como um exemplo, um protocolo específico para medir os efeitos de citocinas secretadas por lipopolissacárido (LPS) -activated microglia N9 em células PC12 neuronais será detalhado, oferecendo uma compreensão concreta da metodologia de co-cultura de inserção.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 médio</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes de utilizar</td></tr><tr><td>Dulbecco» s Águia Modificada' s Mistura Média/Nutriente F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso, deve ser suplementado com 0,365 gm/L de L-glutamina</td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Quente em 37 &graus; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Quente em 37 &graus; C banho-maria antes</td></tr><tr><td>do uso Fator de Crescimento Nervoso-7S da glândula submaxilar murina</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitua o pó liofilizado em uma solução de solução salina tamponada ou meio de cultura de tecidos contendo 0.1&ndash; 1,0% de albumina de soro bovino ou solução de</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td> de 1-10% de soro <td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Quente em 37 &deg; C banho-maria antes do uso</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de&nbsp; Escherichia coli 055: B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de cultura de células tóxicas para uso com placas de 24 poços</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0,4 &mu; m poros</td></tr><tr><td>placas de 24 poços</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Cubra com colágeno antes do uso</td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> de cultura de células PC12 <td>de rotina Meio de cultura de células N9 de rotina</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 85% RPMI médio</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 90% DMEM-F12 médio</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% de soro</td><td></td><td></td> de cavalo inativado pelo calor<td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% de soro de cavalo inativado pelo calor</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Meio de diferenciação PC12 de soro</td><td></td><td></td><td></td>fetal bovino inativado por calor a 5%</tr><tr>Meio<td>de tratamento N9</td><td></td>-&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI médio</td><td></td><td></td><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% DMEM-F12 médio</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% de soro</td><td></td><td></td> fetal bovino inativado pelo calor<td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% de soro fetal bovino inativado pelo calor</td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Meio</td> de tratamento com fator <td></td><td></td><td></td>de crescimento nervoso PC12 de 50 ng/mL</tr><tr><td></td>-&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 99% RPMI médio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Soro fetal bovino inativado por calor a 1%</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

desenvolvimento de um sistema insert co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula contact

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

O papel dos fatores solúveis secretados na modificação das respostas celulares é um tema recorrente no estudo de todos os tecidos e sistemas. Na tentativa de simplificar as relações muito complexas entre os vários subtipos celulares que compõem os organismos multicelulares, técnicas in vitro foram desenvolvidas para ajudar os pesquisadores a adquirir uma compreensão detalhada das populações de células únicas. Uma dessas técnicas usa inserções com uma membrana permeável que permite a difusão de fatores solúveis secretados. Assim, uma população de células cultivadas em inserções pode ser co-cultivada em um poço ou placa contendo um tipo de célula diferente para avaliar as alterações celulares após a sinalização parácrina na ausência de contato célula-célula. Esses sistemas de co-cultura de inserção oferecem várias vantagens sobre outras técnicas de co-cultura, ou seja, sinalização bidirecional, polaridade celular conservada e detecção de alterações celulares específicas da população. Além de serem utilizados no campo da inflamação, câncer, angiogênese e diferenciação, esses sistemas de co-cultura são de primordial importância no estudo das intrincadas relações que existem entre os diferentes subtipos celulares presentes no sistema nervoso central, particularmente no contexto da neuroinflamação. Este artigo oferece diretrizes metodológicas gerais para a montagem de um experimento para avaliar as alterações celulares mediadas por fatores solúveis secretados usando um sistema de co-cultura de inserção. Além disso, um protocolo específico para medir os efeitos neuroinflamatórios das citocinas secretadas pela micróglia N9 ativada por lipopolissacarídeos em células neuronais PC12 será detalhado, oferecendo uma compreensão concreta da metodologia de co-cultura de inserção.

O uso de sistemas de co-cultura de inserção é particularmente pertinente no estudo de processos neuroinflamatï¿½ios que mostram relações parácrinos entre diferentes jogadores celulares do CNS. Imunidade no SNC é realizado principalmente por células residentes chamadas microglia que monitoram seu ambiente em seu estado de repouso ramificada (Figura 2A) e são capazes de distúrbios sentindo que poderia incomodar a homeostase muito precioso necessário para a função neuronal ...

Em organismos multicelulares, os fatores solúveis secretados provocam respostas de diferentes tipos de células como resultado da sinalização parácrina. Os sistemas de co-cultura de inserção oferecem uma maneira simples de avaliar as mudanças mediadas por fatores solúveis secretados na ausência de contato célula-célula.

Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de co-cultivo celular de dois tipos celulares utilizando inserts com uma membrana permeável, permitindo assim a difusão de fatores solúveis secretados. Isso é realizado por meio de uma série de etapas que posicionam com precisão inserts contendo um tipo celular em uma placa de cultura tecidual com múltiplas cavidades contendo um segundo tipo celular. Começamos semeando o tipo celular número um nos inserts e o tipo celular número dois em uma placa de cultura tecidual com múltiplas cavidades.O segundo passo é transferir os insertos para os poços da placa contendo o tipo celular número dois. Em última análise, isso permite colher os dois tipos celulares, bem como os respectivos sobrenadantes. Portanto, é possível avaliar o efeito de fatores solúveis secretados sobre o tipo celular de interesse.Em organismos multicelulares, fatores solúveis secretados provocam respostas em diferentes tipos celulares como resultado da sinalização parácrina. Assim, o valor de um sistema de co-cultura com inserto reside na sua capacidade de oferecer uma maneira original de avaliar as alterações nos parâmetros celulares mediadas por fatores solúveis secretados, na ausência de contato célula-célula. Os sistemas de co-cultura com inserto oferecem diversas vantagens em comparação com outras técnicas de co-cultura, tais como: um, sinalização direcional; dois, conservação da polaridade celular; e três, detecção específica por população das alterações celulares.Um protocolo específico para medir os efeitos tóxicos de citocinas secretadas por micróglia N9 ativada por lipopolissacarídeo sobre células neuronais PC12 será detalhado a seguir, fornecendo assim uma compreensão concreta da metodologia de co-cultivo com inserções. Para começar, retire a embalagem de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e das inserções de 0,4 mícron em politetrafluoretileno. Em seguida, posicione as inserções nos poços vazios da placa de cultura tecidual segurando a borda superior da inserção com pinças estéreis.Em seguida, preencha os insertos com meio N9 de rotina até que a membrana esteja completamente coberta. Incube os insertos por pelo menos uma hora, ou durante a noite, para melhorar a capacidade de adesão das células. Uma vez que os insertos estejam prontos, divida as micróglias N9 com 80 a 90% de confluência usando meio N9 de rotina para obter uma suspensão celular que será utilizada para semear os insertos.Em seguida, remova o meio de rotina dos insertos tomando cuidado para não perfurar a membrana com a ponta da micropipeta. Depois, semeie cada inserto com 60.000 células por centímetro quadrado, utilizando 50 microlitros da suspensão celular, ou conforme indicado no protocolo do fabricante do inserto. Durante a distribuição da suspensão celular, assegure-se de que ela permaneça homogênea invertendo ocasionalmente o tubo.Quando todos os insertos forem semeados, agite suavemente a placa de frente para trás e depois da esquerda para a direita, a fim de distribuir as células uniformemente. Evite movimentos circulares, pois isso fará com que as células se acumulem no centro do inserto. Em seguida, incube a placa contendo os insertos por 24 horas antes de prosseguir com a ativação de micróglias N9.Inicie pesando 10 miligramas de lipopolissacarídeo e armazene-o em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro para uso posterior. Como o lipopolissacarídeo é um endotoxina pró-inflamatória potente e exige precauções especiais de segurança, recomenda-se fortemente o uso de óculos, luvas e um respirador contra partículas. Em seguida, prepare uma série de diluições sucessivas do lipopolissacarídeo utilizando o meio de tratamento N9 morno, a fim de obter soluções de trabalho com concentrações de quatro, dois e um micrograma por mililitro.Por fim, remova metade do meio de cultura dos insertos, tomando cuidado para não perturbar as células. Em seguida, adicione suavemente 25 microlitros das soluções de trabalho de lipopolissacarídeo aos insertos, obtendo diluições finais de dois, um ou 0,5 microgramas por mililitro. Incube a placa por mais 24 horas antes de prosseguir com os experimentos de co-cultura.Esta etapa exige células PC12 cultivadas a 30.000 células por centímetro quadrado, interneurônios diferenciados e micróglia N9 ativada com lipopolissacarídeo por 24 horas, conforme descrito na seção anterior. Comece removendo cuidadosamente todo o meio dos inserts e substituindo-o por 50 microlitros de meio de tratamento N9 fresco e aquecido. Isso é necessário para remover todos os vestígios de lipopolissacarídeo, deixando apenas a micróglia N9 ativada.Leve em consideração que os inserts estão soltos nos poços da placa de cultura de tecidos e podem se mover se a ponta for pressionada com muita força contra a parede. Este passo deve ser realizado um insert por vez, a fim de evitar que as células sequem devido ao contato prolongado com o ar. Em seguida, remova completamente o meio das células neuronais PC12 e substitua por 0,6 mililitros de meio de tratamento PC12 fresco e aquecido.Faça isso um por vez com cuidado para garantir que as células não sequem. Usando pinças, segure a borda superior de um inserto e coloque-o suavemente no poço contendo as células neuronais PC12. Quando todos os insertos forem transferidos, verifique a presença de bolhas de ar sob as membranas dos insertos.As bolhas de ar impedirão qualquer troca através da membrana do inserto e podem comprometer todo o experimento. Remova quaisquer bolhas de ar levantando o inserto suavemente do poço com pinça e colocando-o novamente no meio de cultura celular; essa ação deve eliminar a maioria das bolhas. No entanto, para bolhas persistentes, tente mergulhar suavemente o inserto de volta no meio de cultura celular em um ângulo.Não bata nem agite os insertos, pois isso tende a causar a dissociação de células aderidas. Em seguida, verifique os volumes de meio nos insertos e nos poços; o líquido em ambos os compartimentos deve estar aproximadamente no mesmo nível. Após a remoção de todas as bolhas de ar e com os volumes de meio adequados, incube a placa.As células, o meio de cultura ou ambos podem então ser coletados para medir os efeitos da sinalização parácrina entre as micróglias N9 e as células neuronais PC12. Ensaios imunoenzimáticos foram realizados no meio de cultura do compartimento inferior para quantificar citocinas pró-inflamatórias. Os resultados ilustram que 24 horas após o período de ativação, as micróglias N9 tratadas com dois microgramas por mililitro de lipopolissacarídeo secretaram significativamente mais citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6, fator de necrose tumoral alfa e interferon gama, em comparação com as micróglias não tratadas.Além disso, as microglías N9 tratadas com um micrograma por mililitro de lipopolissacarídeo secretaram significativamente mais interferon gama após 24 horas, enquanto foi necessário 48 horas para observar um aumento significativo nos níveis do meio celular de interleucina-6 e fator de necrose tumoral alfa. Em contraste, a condição com 0,5 micrograma por mililitro não conseguiu potencializar a expressão de citocinas nas microglías N9 tanto em 24 quanto em 48 horas após o período de ativação. Além disso, os dados de 24 horas no grupo de dois microgramas por mililitro sugerem que houve microgliose, um aumento na população microglial.No entanto, somente após 48 horas o número de células foi significativamente aumentado. Por fim, para avaliar as consequências da ativação de micróglias que levam à secreção aumentada de citocinas e microglioses, a citotoxicidade foi avaliada nas células neuronais PC12 em co-cultura. Ao medir os níveis de desidrogenase láctica extracelular, que é liberada por células danificadas, observou-se que as células neuronais PC12 exibiam maior morte celular conforme a concentração de lipopolissacarídeo nas células N9 aumentava.Assim, esses resultados mostram que fatores solúveis secretados são capazes de atravessar a membrana dos inserts de co-cultivo e podem causar danos citotóxicos a células neuronais PC12 na ausência de contato célula-célula. Embora apenas um cenário de co-cultivo com insertos tenha sido apresentado aqui, trata-se de uma técnica muito flexível. Neste protocolo, um tipo celular foi pré-tratado com a molécula responsável por reduzir a secreção de fatores solúveis que, ao transferir o inserto para o poço, afetam o comportamento de um segundo tipo celular.No entanto, é possível incubar ambos os tipos celulares juntos em um sistema de co-cultivo para detectar o aumento da fraqueza ou resistência de uma ou ambas as populações celulares a um tratamento posterior. Essa técnica pode simplesmente utilizar duas populações de células incubadas juntas sem qualquer tratamento, para avaliar a sinalização parácrina recíproca basal, por exemplo. Além de ser valorizada no campo da neuroinflamação, como demonstrado aqui, os sistemas de co-cultivo com insertos podem ser usados para responder a uma ampla gama de questões relacionadas à regeneração tumoral, neurolatirismo, sinalização de apoptose ou qualquer outro tema que envolva componente de sinalização parácrina.Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa compreensão de como os sistemas de co-cultivo com insertos podem oferecer uma maneira simples de avaliar as alterações mediadas por fatores solúveis secretados. E esperamos ter convencido você do alto potencial desses sistemas de co-cultivo com insertos no estudo da sinalização parácrina multicelular na ausência de contato célula-célula.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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