Desenvolvimento de um Sistema Insert Co-cultura de dois tipos celulares na ausência de célula-célula Contact

O objetivo geral deste procedimento é criar um sistema de co-cultivo celular de dois tipos celulares utilizando inserts com uma membrana permeável, permitindo assim a difusão de fatores solúveis secretados. Isso é realizado por meio de uma série de etapas que posicionam com precisão inserts contendo um tipo celular em uma placa de cultura tecidual com múltiplas cavidades contendo um segundo tipo celular. Começamos semeando o tipo celular número um nos inserts e o tipo celular número dois em uma placa de cultura tecidual com múltiplas cavidades.

O segundo passo é transferir os insertos para os poços da placa contendo o tipo celular número dois. Em última análise, isso permite colher os dois tipos celulares, bem como os respectivos sobrenadantes. Portanto, é possível avaliar o efeito de fatores solúveis secretados sobre o tipo celular de interesse.

Em organismos multicelulares, fatores solúveis secretados provocam respostas em diferentes tipos celulares como resultado da sinalização parácrina. Assim, o valor de um sistema de co-cultura com inserto reside na sua capacidade de oferecer uma maneira original de avaliar as alterações nos parâmetros celulares mediadas por fatores solúveis secretados, na ausência de contato célula-célula. Os sistemas de co-cultura com inserto oferecem diversas vantagens em comparação com outras técnicas de co-cultura, tais como: um, sinalização direcional; dois, conservação da polaridade celular; e três, detecção específica por população das alterações celulares.

Um protocolo específico para medir os efeitos tóxicos de citocinas secretadas por micróglia N9 ativada por lipopolissacarídeo sobre células neuronais PC12 será detalhado a seguir, fornecendo assim uma compreensão concreta da metodologia de co-cultivo com inserções. Para começar, retire a embalagem de uma placa de cultura tecidual de 24 poços e das inserções de 0,4 mícron em politetrafluoretileno. Em seguida, posicione as inserções nos poços vazios da placa de cultura tecidual segurando a borda superior da inserção com pinças estéreis.

Em seguida, preencha os insertos com meio N9 de rotina até que a membrana esteja completamente coberta. Incube os insertos por pelo menos uma hora, ou durante a noite, para melhorar a capacidade de adesão das células. Uma vez que os insertos estejam prontos, divida as micróglias N9 com 80 a 90% de confluência usando meio N9 de rotina para obter uma suspensão celular que será utilizada para semear os insertos.

Em seguida, remova o meio de rotina dos insertos tomando cuidado para não perfurar a membrana com a ponta da micropipeta. Depois, semeie cada inserto com 60.000 células por centímetro quadrado, utilizando 50 microlitros da suspensão celular, ou conforme indicado no protocolo do fabricante do inserto. Durante a distribuição da suspensão celular, assegure-se de que ela permaneça homogênea invertendo ocasionalmente o tubo.

Quando todos os insertos forem semeados, agite suavemente a placa de frente para trás e depois da esquerda para a direita, a fim de distribuir as células uniformemente. Evite movimentos circulares, pois isso fará com que as células se acumulem no centro do inserto. Em seguida, incube a placa contendo os insertos por 24 horas antes de prosseguir com a ativação de micróglias N9.

Inicie pesando 10 miligramas de lipopolissacarídeo e armazene-o em um tubo Eppendorf de 1,5 mililitro para uso posterior. Como o lipopolissacarídeo é um endotoxina pró-inflamatória potente e exige precauções especiais de segurança, recomenda-se fortemente o uso de óculos, luvas e um respirador contra partículas. Em seguida, prepare uma série de diluições sucessivas do lipopolissacarídeo utilizando o meio de tratamento N9 morno, a fim de obter soluções de trabalho com concentrações de quatro, dois e um micrograma por mililitro.

Por fim, remova metade do meio de cultura dos insertos, tomando cuidado para não perturbar as células. Em seguida, adicione suavemente 25 microlitros das soluções de trabalho de lipopolissacarídeo aos insertos, obtendo diluições finais de dois, um ou 0,5 microgramas por mililitro. Incube a placa por mais 24 horas antes de prosseguir com os experimentos de co-cultura.

Esta etapa exige células PC12 cultivadas a 30.000 células por centímetro quadrado, interneurônios diferenciados e micróglia N9 ativada com lipopolissacarídeo por 24 horas, conforme descrito na seção anterior. Comece removendo cuidadosamente todo o meio dos inserts e substituindo-o por 50 microlitros de meio de tratamento N9 fresco e aquecido. Isso é necessário para remover todos os vestígios de lipopolissacarídeo, deixando apenas a micróglia N9 ativada.

Leve em consideração que os inserts estão soltos nos poços da placa de cultura de tecidos e podem se mover se a ponta for pressionada com muita força contra a parede. Este passo deve ser realizado um insert por vez, a fim de evitar que as células sequem devido ao contato prolongado com o ar. Em seguida, remova completamente o meio das células neuronais PC12 e substitua por 0,6 mililitros de meio de tratamento PC12 fresco e aquecido.

Faça isso um por vez com cuidado para garantir que as células não sequem. Usando pinças, segure a borda superior de um inserto e coloque-o suavemente no poço contendo as células neuronais PC12. Quando todos os insertos forem transferidos, verifique a presença de bolhas de ar sob as membranas dos insertos.

As bolhas de ar impedirão qualquer troca através da membrana do inserto e podem comprometer todo o experimento. Remova quaisquer bolhas de ar levantando o inserto suavemente do poço com pinça e colocando-o novamente no meio de cultura celular; essa ação deve eliminar a maioria das bolhas. No entanto, para bolhas persistentes, tente mergulhar suavemente o inserto de volta no meio de cultura celular em um ângulo.

Não bata nem agite os insertos, pois isso tende a causar a dissociação de células aderidas. Em seguida, verifique os volumes de meio nos insertos e nos poços; o líquido em ambos os compartimentos deve estar aproximadamente no mesmo nível. Após a remoção de todas as bolhas de ar e com os volumes de meio adequados, incube a placa.

As células, o meio de cultura ou ambos podem então ser coletados para medir os efeitos da sinalização parácrina entre as micróglias N9 e as células neuronais PC12. Ensaios imunoenzimáticos foram realizados no meio de cultura do compartimento inferior para quantificar citocinas pró-inflamatórias. Os resultados ilustram que 24 horas após o período de ativação, as micróglias N9 tratadas com dois microgramas por mililitro de lipopolissacarídeo secretaram significativamente mais citocinas pró-inflamatórias, como interleucina-6, fator de necrose tumoral alfa e interferon gama, em comparação com as micróglias não tratadas.

Além disso, as microglías N9 tratadas com um micrograma por mililitro de lipopolissacarídeo secretaram significativamente mais interferon gama após 24 horas, enquanto foi necessário 48 horas para observar um aumento significativo nos níveis do meio celular de interleucina-6 e fator de necrose tumoral alfa. Em contraste, a condição com 0,5 micrograma por mililitro não conseguiu potencializar a expressão de citocinas nas microglías N9 tanto em 24 quanto em 48 horas após o período de ativação. Além disso, os dados de 24 horas no grupo de dois microgramas por mililitro sugerem que houve microgliose, um aumento na população microglial.

No entanto, somente após 48 horas o número de células foi significativamente aumentado. Por fim, para avaliar as consequências da ativação de micróglias que levam à secreção aumentada de citocinas e microglioses, a citotoxicidade foi avaliada nas células neuronais PC12 em co-cultura. Ao medir os níveis de desidrogenase láctica extracelular, que é liberada por células danificadas, observou-se que as células neuronais PC12 exibiam maior morte celular conforme a concentração de lipopolissacarídeo nas células N9 aumentava.

Assim, esses resultados mostram que fatores solúveis secretados são capazes de atravessar a membrana dos inserts de co-cultivo e podem causar danos citotóxicos a células neuronais PC12 na ausência de contato célula-célula. Embora apenas um cenário de co-cultivo com insertos tenha sido apresentado aqui, trata-se de uma técnica muito flexível. Neste protocolo, um tipo celular foi pré-tratado com a molécula responsável por reduzir a secreção de fatores solúveis que, ao transferir o inserto para o poço, afetam o comportamento de um segundo tipo celular.

No entanto, é possível incubar ambos os tipos celulares juntos em um sistema de co-cultivo para detectar o aumento da fraqueza ou resistência de uma ou ambas as populações celulares a um tratamento posterior. Essa técnica pode simplesmente utilizar duas populações de células incubadas juntas sem qualquer tratamento, para avaliar a sinalização parácrina recíproca basal, por exemplo. Além de ser valorizada no campo da neuroinflamação, como demonstrado aqui, os sistemas de co-cultivo com insertos podem ser usados para responder a uma ampla gama de questões relacionadas à regeneração tumoral, neurolatirismo, sinalização de apoptose ou qualquer outro tema que envolva componente de sinalização parácrina.

Após assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma boa compreensão de como os sistemas de co-cultivo com insertos podem oferecer uma maneira simples de avaliar as alterações mediadas por fatores solúveis secretados. E esperamos ter convencido você do alto potencial desses sistemas de co-cultivo com insertos no estudo da sinalização parácrina multicelular na ausência de contato célula-célula.