Excitação externa de Neurônios Usando Campos Elétricos e Magnéticos em One e culturas bidimensionais

O objetivo geral deste protocolo para a estimulação elétrica e magnética de culturas unidimensionais e bidimensionais é usar culturas neuronais de forma eficiente como um modelo reduzido para estimulação cerebral do qual podemos extrair insights e parâmetros importantes. O uso de nosso protocolo de estimulação elétrica com culturas unidimensionais nos permite medir parâmetros específicos relacionados à excitação neural, por exemplo, cronaxia e reobase em diferentes compartimentos do neurônio. A técnica de estimulação magnética nos permite comparar o efeito dos campos magnéticos versus elétricos em culturas neuronais.

Este modelo também nos permite diagnosticar e tratar melhor os distúrbios cerebrais. Propomos um método eficaz e fácil para cultivar redes neuronais padrão em qualquer padrão de design, mesmo redes unidimensionais. Podemos então orientar campos magnéticos elétricos e variáveis no tempo em relação a essas redes para separar e observar contribuições de diferentes compartimentos do neurônio.

A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer seres humanos ou modelos animais, permitindo uma pesquisa extensa e exaustiva dos parâmetros corretos para estimulação neuronal. Demonstrando o procedimento estarão Yuri Burnishev, um técnico do meu laboratório e Ami Eisen, um estudante de doutorado no laboratório. Para começar, prepare culturas neuronais padronizadas semeando células neurais em lamínulas de vidro parcialmente pré-revestidas com uma camada de biorrejeição.

Para fazer isso, limpe lamínulas de 25 milímetros. E usando uma máquina de pulverização catódica, cubra a lamínula com uma camada de biorrejeição. Ajuste os parâmetros para o processo de deposição para criar uma camada que consiste em um fino filme de cromo de seis a 10 angstroms, que garante a estabilidade do revestimento e uma camada de ouro de 30 angstrom de espessura, fornecendo ao revestimento reatividade de tióis.

Assim que o processo estiver concluído, remova a lamínula da máquina de pulverização catódica e examine o revestimento obtido. Em seguida, monte um sistema de plotter de caneta modificado substituindo uma ponta de tinta de uma caneta plotter por uma agulha de gravação de metal afiada. Coloque uma folha de borracha colada a uma placa rígida no plotter para que uma superfície resistente e de alto atrito seja garantida durante a gravação.

Em seguida, ajuste a posição da folha pressionando os botões fornecidos na plotadora. Assim que a folha de borracha estiver no lugar, pipete uma pequena gota de água em sua superfície e coloque a lamínula pré-revestida sobre a gota. Em seguida, usando o plotter, grave as camadas de metal por meio de arranhões repetitivos, gerando linhas de 200 micrômetros de espessura para criar os padrões desejados.

Antes de uma estimulação elétrica, coloque a lamínula semeada em uma câmara de imagem. Para estimular as células com um campo elétrico de direção constante, use dois eletrodos paralelos separados por 11 milímetros e localizados em lados opostos da cultura plaqueados nas lamínulas de 13 milímetros. Em seguida, monte a câmara de imagem da cultura e o suporte do eletrodo correspondente de forma que os eletrodos do fio sejam imersos no meio extracelular e posicionados um milímetro acima da cultura.

Em seguida, conecte o par de eletrodos únicos ao amplificador operacional que amplifica o sinal do gerador. Aplique um único pulso de onda quadrada bipolar com um ciclo de trabalho de 50% e amplitude de 22 volts. Use uma onda bipolar sem componente DC para evitar a eletrólise que pode ocorrer nos eletrodos.

Aplique o pulso com duração de 10 microssegundos a quatro milissegundos para garantir uma estimulação eficaz, mas evitar lesões celulares. Para estimular as células com campos elétricos de mudança de direção, use dois pares perpendiculares de eletrodos. Certifique-se de que os dois pares de eletrodos, bem como seus terminais de alimentação e monitoramento, estejam completamente isolados eletricamente um do outro e flutuando do solo terrestre.

Para alterar a orientação do campo elétrico, varie a amplitude da tensão aplicada aos dois pares de eletrodos. Em seguida, determine a intensidade e a direção do campo resultante por adição de vetor. Para gerar um campo rotativo de amplitude fixa, aplique uma onda senoidal a um par de eletrodos enquanto alimenta o outro par com uma onda cosseno.

Para iniciar a estimulação magnética, posicione uma cultura neuronal, cultivada em um padrão circular, sob o microscópio. Estimule a cultura usando uma bobina de estimulação magnética circular padrão e um estimulador de suporte que estão disponíveis comercialmente. Para estimular as culturas com intensidades de campo magnético não padronizadas, conecte uma bobina de estimulação magnética personalizada ao estimulador personalizado.

Em seguida, com o auxílio de um ponteiro laser, alinhe o centro da cultura ao centro da bobina para garantir uma estimulação bem-sucedida. Ajuste as posições da bobina para que ela permaneça aproximadamente cinco milímetros acima do centro da cultura. Uma vez que a bobina de estimulação esteja posicionada corretamente, carregue o estimulador a um potencial de até cinco quilovolts.

Em seguida, usando um interruptor de alta corrente e alta tensão, descarregue a alta corrente de tensão através da bobina de estimulação para gerar um pulso magnético que estimule a atividade dos neurônios cultivados. Finalmente, monte uma bobina de captação na mesma posição da cultura neuronal e meça a intensidade do campo magnético gerado. Este esquema mostra que, aplicando diferentes amplitudes de pulsos de tensão aos dois pares de eletrodos, os campos elétricos podem ser orientados para todos os ângulos sem a necessidade de girar manualmente a cultura.

Aqui estão os exemplos de gravações de transientes de cálcio com estimulação elétrica em diferentes tensões aplicadas. Ao aplicar uma duração constante do campo elétrico, o número de neurônios que disparam e respondem ao campo elétrico mostra uma distribuição gaussiana cumulativa em função da amplitude da tensão. E este é um exemplo de uma curva de força-duração obtida ao empregar este protocolo.

Para as culturas em anel que respondem ao campo magnético, a taxa de sucesso da estimulação cresce com o raio da cultura. Este gráfico mostra a relação entre o tamanho do anel e a intensidade do campo magnético. As excitações mais bem-sucedidas das culturas estão na sobreposição entre o espaço da fase experimentalmente acessível e a região de alta probabilidade.

Uma vez dominada, a preparação de culturas unidimensionais pode ser realizada dentro de três a quatro horas. Ao realizar a estimulação elétrica e magnética, é importante lembrar de permitir a recuperação total da cultura da etapa de estimulação e certificar-se de que todos os equipamentos estejam flutuando em relação ao aterramento elétrico. Seguindo este procedimento, outras questões podem ser abordadas, como a cultura de neurônios de diferentes áreas do cérebro, medindo estatísticas, por exemplo, de neurônios corticais.

Outra possibilidade é medir parâmetros de qualquer neurônio modelo de doença. Após seu desenvolvimento, essa técnica pode abrir caminho para a otimização da força e das durações necessárias para uma estimulação cerebral eficaz e segura. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar qualquer padrão desejado de culturas neuronais e ser capaz de estimulá-las elétrica ou magneticamente para o estudo das interações dos neurônios com os campos eletromagnéticos.