Fluorescência de células activadas (FACS) e Gene Análise da expressão de Fos-expressando neurônios de fresco e congelado cérebro de um rato Tissue

O objetivo geral deste procedimento é dissociar os neurônios que expressam Fos do tecido cerebral de ratos adultos frescos ou congelados para subsequente classificação de células ativadas por fluorescência, ou FACS. Este método pode ser usado para isolar células neuronais de interesse para identificar a neuroadaptação molecular única de neurônios ativados comportamentais. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o uso de tecido congelado, facilitando o isolamento de células de várias áreas do cérebro em dias diferentes.

Para processar esse tecido cerebral fresco, insira duas ou mais lâminas de barbear pré-resfriadas nas ranhuras de uma matriz de corte cerebral gelada para cortar fatias coronais de um a dois milímetros contendo as regiões cerebrais de interesse, colocando as seções em uma placa de vidro resfriada à medida que são cortadas. Primeiro, disseque a região do cérebro de interesse, descarte as outras áreas e remova a substância branca. Para congelar o tecido, transfira as amostras para um microtubo e mergulhe o tubo em isopentano negativo a 40 graus Celsius por 20 segundos para armazenamento a 80 graus Celsius negativos até processamento posterior.

Para picar o tecido, deixe as amostras descongelarem em uma placa de vidro frio por não mais de um minuto antes de cobrir as amostras em uma a duas gotas de solução de tampão A. Em seguida, segurando uma lâmina de barbear completamente vertical à placa, pique o tecido 100 vezes em cada direção ortogonal. Para picar completamente o tecido, é fundamental mantê-lo úmido com o tampão A e seguir os tempos e a direção de picagem especificados.

É fundamental remover a maior parte da substância branca durante a dissecção do tecido e manter o tecido coberto com o tampão A para melhorar a eficiência da picagem e manter a saúde das células. Quando o tecido tiver sido completamente processado, use a lâmina de barbear para transferir as peças para um tubo de microcentrífuga contendo um mililitro de tampão A frio e inverta o tubo três a cinco vezes para submergir todo o tecido picado na solução. Para dissociar os fragmentos de tecido em suspensão de célula única, peletizar as amostras por centrifugação.

Descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione lentamente um mililitro de solução enzimática fria e recém-descongelada na parede interna do microtubo. E use uma pipeta de ponta grande para aspirar e dispensar imediatamente a totalidade de cada pellet quatro vezes para dispersar os pedaços de tecido picados.

Em seguida, inverta rapidamente o microtubo para evitar que os pellets grudem no fundo do tubo e incube a amostra com mistura de ponta a ponta por 30 minutos a quatro graus Celsius. No final da digestão, centrifugue o tubo novamente e adicione 0,6 mililitros de tampão A frio às células. Usando a mesma ponta de pipeta, aspire e dispense imediatamente os pellets cinco vezes.

Em seguida, selecione uma pipeta de vidro de 1,3 milímetro e use-a para triturar suavemente as amostras 10 vezes. Coloque a amostra no gelo por dois minutos para permitir que os detritos e as células não dissociadas se depositem no fundo do tubo. Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros.

Em seguida, adicione 600 microlitros de solução tampão A ao pellet restante e use uma pipeta de 0,8 milímetro de diâmetro para triturar a amostra mais 10 vezes. Depois de permitir que os tecidos se assentem como acabamos de demonstrar, agrupe o sobrenadante com a primeira suspensão celular e adicione mais 600 microlitros de tampão ao pellet. Em seguida, use uma pipeta de 0,4 milímetro para triturar a amostra e coloque o tubo no gelo por dois minutos para permitir que os tecidos se assentem.

Seguir as etapas de trituração mecânica no protocolo é importante para uma classificação bem-sucedida. Em seguida, agrupar o sobrenadante com as células dissociadas. Em seguida, adicione 600 microlitros de tampão A à amostra e repita a trituração da pipeta de 0,4 milímetro mais três vezes.

Coloque os tubos no gelo por dois minutos para permitir que as células se assentem. E então, agrupe o sobrenadante em um segundo tubo de 15 mililitros. Repita o processo de trituração mais três vezes, usando a menor pipeta de vidro, aumenta significativamente o rendimento das células para posterior classificação.

Depois que todos os sobrenadantes forem coletados, adicione 800 microlitros de etanol a 100% de 20 graus Celsius negativos a quatro mirotubos no gelo. Em seguida, transfira 800 microlitros de células do primeiro tubo de sobrenadante coletado para cada um dos dois primeiros tubos de etanol e 800 microlitros de células do segundo tubo de sobrenadante para cada um dos dois últimos tubos de etanol. Inverta os tubos para misturar as amostras.

Em seguida, coloque as amostras no gelo por 15 minutos, com mistura por inversão a cada cinco minutos. No final da incubação, centrifugue as células. Em seguida, tocando apenas a parede do microtubo, use uma micropipeta para remover lentamente todos, exceto os últimos 50 microlitros de cada sobrenadante.

Filtrar cada uma das duas suspensões celulares separadamente utilizando dois pares diferentes de filtros celulares. As células estão então prontas para serem marcadas com anticorpos contra os marcadores celulares de interesse e classificação por citometria de fluxo. A análise de amostras de tecido cerebral fresco e congelado revela a presença de pequenas populações homogêneas de células neuronais com tamanho e granularidade semelhantes.

As pequenas populações homogêneas podem ser fechadas para excluir quaisquer agregados celulares, e os neurônios podem ser identificados por sua positividade NeuN e DAPI. Em amostras de tecido fresco e congelado, os níveis de mRNA de NeuN também são significativamente maiores nas populações positivas para NeuN do que nas populações negativas para NeuN. Em contraste, os níveis de mRNA do marcador de células glial e olidogodendrocyte são maiores na população negativa para NeuN do que na população positiva para NeuN.

Uma tendência semelhante de níveis mais altos de mRNA de marcadores de células microgiais é observada na população negativa para NeuN, embora isso não tenha sido estatisticamente significativo. Além disso, os níveis de mRNA Fos são maiores nos neurônios Fos positivos do que nos neurônios Fos-negativos, com um aumento de três vezes de mRNA Fos nos neurônios Fos positivos de tecido fresco e um aumento de onze vezes de mRNA Fos em neurônios Fos positivos de tecido congelado, confirmando a validade do método para identificar genes específicos de interesse de células classificadas por fluxo em condições de tecido fresco e congelado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de seguir as etapas críticas de prevenção de lise celular.

Após este procedimento, outros métodos, como a classificação de células ativadas por fluorescência, podem ser realizados para isolar os subconjuntos de células de interesse para posterior análise molecular a jusante. O uso de tecido congelado permite que as amostras sejam classificadas em dias separados, o que é fundamental para experimentos que envolvem procedimentos longos e complicados de coleta e preparação de tecidos. Essa técnica também pode ser usada para preparar amostras de cérebro humano congeladas post-mortem armazenadas por vários meses ou anos para classificação por citometria de fluxo.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem os mecanismos moleculares subjacentes ao comportamento de neurônios que expressam Fos ou outras células de tipo selvagem imunomarcadas de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissociar células do tecido cerebral de rato fresco ou congelado para classificação de células ativadas por fluorescência de neurônios ou tipos de células de interesse.